Il rilevamento dei fitopatogeni è un passo cruciale nella gestione delle malattie delle piante. Questo protocollo fornisce un metodo di rilevamento rapido per la contaminazione dell'acqua di irrigazione a causa di un comune agente patogeno da combattimento aviotrasportato dall'acqua. Utilizzando questa tecnica, agenti patogeni specifici, come Phytophthora capcici, possono essere lavorati e rapidamente rilevati dal nostro grande volume di acqua di irrigazione pur rimanendo in loco.
A dimostrare la procedura saranno Owen Hudson, uno studente masters del mio laboratorio, e Sumyya Waliullah, una ricercatrice post-dottorato del laboratorio del Dr.Pingxi G per allestire una pompa e un filtro per il rilevamento in loco di Phytophthora capcici nell'acqua di irrigazione. Attaccare un pallone filtrante a un tubo collegato a una pompa a mano e montare l'imbuto buchner nel tappo di gomma nella bocca del pallone filtrante. Quindi inserire un pezzo di carta da filtro di dimensioni appropriato con una dimensione di ritenzione di 15 micron nell'imbuto.
Per ottenere campioni d'acqua raccogliere l'acqua di irrigazione dalla fonte di destinazione. L'acqua può avere piccole quantità di detriti, ma non sedimenti significativi o suolo. Versare lentamente tra 50 e 1000 millilitri di acqua di prova sulla carta filtrante all'interno dell'imbuto mentre si utilizza la pompa a mano per creare un'aspirazione per tirare l'acqua attraverso l'imbuto.
Quando tutta l'acqua è stata filtrata, utilizzare le forcep per rimuovere la carta filtrante dall'imbuto. E usa forbici sterili per tagliare la carta a piccoli pezzi. Immergere da otto a 12 pezzi di carta in 400 microlitri di tampone di estrazione in un tubo da 1,5 millilitri per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente.
Vortice o altrimenti agitare la carta per 10 secondi una volta al minuto. Alla fine dell'incubazione, utilizzare le forcep per rimuovere la carta con il meno buffer possibile. E ripeti la licenza con il prossimo set di pezzi di carta da filtro.
Per l'estrazione del DNA dai campioni di carta filtrante aggiunti 20 microlitri di proteinasi K e 10 microlitri di 10 nanogrammi per microliter RNA anche al campione e incubare la soluzione a temperatura ambiente per 15 minuti con vortice o scuotimento ogni tre minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 500 microlitri di perline magnetiche nel tampone di legame al campione e mescolare bene scuotendo. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, posizionare il tubo e il rack separatore magnetico per due minuti prima di rimuovere e scartare il supernatante.
Rimuovere il tubo dal separatore magnetico e sospendere vigorosamente le perline in 500 microlitri di tampone di lavaggio. Dopo 30 secondi riportare il tubo sul magnete e attendere due minuti prima di scartare il supernatante. Ripetere il lavaggio anche con 500 microlitri di tampone di lavaggio e 500 microlitri di 80% di etanolo, come appena dimostrato.
E l'aria guida il pellet di perline magnetiche per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione sospendere di nuovo le perline in 50 microlitri di tampone di eluizione con pipettazione per un minuto prima di riposizionare il tubo sul magnete per due minuti per consentire la raccolta del supernatante. Dopo aver preparato il mix di primer LAMP come indicato nella tabella, aggiungere a 2,5 microlitri di primer mix 12,5 microlitri di un mastermix LAMP di lava un microlitro di DNA estratto e nove microlitri di acqua distillata doppia su un tubo PCR e impostare un controllo positivo e uno negativo.
incubare tutti i campioni in un blog di calore di 64 gradi Celsius per 45 minuti o il genio tre strumenti di amplificazione alla fine dell'incubazione, un carico di cinque microlitri di ogni campione amplificato su un gel di agarosio dell'1% e immaginare le bande risultanti su una macchina per l'imaging ultravioletto. Se è stato utilizzato un colorante calorimetrico, visualizzare il cambiamento di colore per determinare i risultati come positivi o negativi. Se è stato utilizzato uno strumento di amplificazione portatile, visualizzare il grafico di amplificazione sullo schermo per determinare i risultati.
Il tempo ottico per l'esecuzione del saggio LAMP a 64 gradi è di 45 minuti, poiché le concentrazioni più basse che erano positive per il rilevamento non vengono amplificate fino a 40 minuti, mentre concentrazioni più elevate vengono amplificate a 20 minuti. L'amplificazione può essere confermata su un gel di agarosio all'1% etichettato con una macchia di acido nucleico. Come illustrato, la PCR convenzionale è 40 volte meno sensibile di LAMP.
Rilevando 4,8 per 10 al terzo zoospore per concentrazioni di millilitro al livello più basso. In questa analisi, campioni d'acqua sono stati raccolti da sette stagni utilizzati per la produzione commerciale di ortaggi nella contea di Tift, in Georgia. Tre dei quali hanno dimostrato risultati LAMP positivi.
Quando i campioni sono stati testati dalla PCR convenzionale, tuttavia, le zoospore sono state rilevate solo in uno dei tre campioni positivi. In questa tabella vengono riepilogate le differenze tra i metodi di rilevamento che utilizzano variabili quali sensibilità, tempo, preparazione richiesta, materiali e costi. LAMP è il metodo meno costoso tra i metodi testati ed è anche il più veloce, richiedendo solo 30-60 minuti per l'amplificazione rispetto all'amplificazione PCR convenzionale.
L'utilizzo di questo DNA di protocollo estratto da agenti patogeni di semi UMI strettamente correlati non comporta alcuna rilevazione per nessuno dei campioni, confermando la specificità dei primer. Assicurarsi di non versare l'acqua del campione troppo velocemente e fare attenzione quando si aggiunge DNA estratto ai tubi LAMP per limitare la contaminazione. Una volta sviluppati altri agenti patogeni a base d'acqua, i metodi di filtrazione e acido della lampada possono essere adattati per altri agenti patogeni.
