This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Lo studio delle interazioni ospite / patogeno ha dimostrato di essere un metodo notevole per capire infezioni batteriche e sviluppare strategie alternative per contrastare malattie infettive. Tuttavia, a causa della diversità delle strategie elaborate da diversi batteri patogeni, l&#39;identificazione e la caratterizzazione di fattori di virulenza batterici e dell&#39;ospite vie di segnalazione che sono indirizzate durante le infezioni rappresentano una vera e propria sfida. Ciò richiede lo sviluppo di nuovi approcci per l&#39;identificazione su larga scala dei nodi principali di interazione ospite / patogeno. Il recente sviluppo di prodotti innovativi, ad alto throughput e tecniche di screening ad alto contenuto rappresenta una preziosa risorsa che può essere adattato allo studio di batteri patogeni intracellulari 15. Qui, abbiamo usato il zoonotici batterica patogeno coxiella burnetii come modello per sviluppare approcci di screening che combinano transposon mutagenesi e analisi basate sulla fluorescenza. Importantemente, questo metodo di screening consente il monitoraggio simultaneo di molteplici fasi del ciclo intracellulare Coxiella, fornendo una panoramica globale delle strategie sviluppate da questo batterio di invadere, replicare e persistono all&#39;interno delle cellule infette. L&#39;approccio qui descritto si basa su due tecniche ben consolidate, trasposone mutagenesi e saggi basati sulla fluorescenza, che sono state applicate con successo allo studio di batteri patogeni. Combinando queste tecniche nel contesto di schermi ad alta produttività / elevato contenuto permette di valutare gli effetti di un elevato numero di mutazioni batteriche analizzando un numero molto elevato di eventi (tipicamente 15.000 cellule infettate per mutazioni batteriche vengono esposte e analizzati). Ciò fornisce un importante analisi statistica di eventi come invasione batterica delle cellule ospiti e la replica intracellulare, che sono, per natura, ad una elevata variabilità. È importante notare che le linee cellulari diverse epithelial può essere utilizzato per questo tipo di screening. Tuttavia, le cellule epiteliali piatte e grandi sono ottimali per l&#39;analisi delle immagini come organelli delle cellule ospiti sono più facili da individuare. Poiché la maggior parte dei microscopi automatici può gestire automaticamente un gran numero di piatti, non ci sono limiti al numero di mutanti che possono essere proiettati contemporaneamente. A seconda del patogeno, il privilegio utente può l&#39;uso di un epifluorescenza o un microscopio confocale. Il tempo di acquisizione dell&#39;immagine sarà principalmente dipende dalla sensibilità della telecamera microscopio, il numero di campi acquisiti per pozzetto e dal numero di canali acquisiti per campo di vista. L&#39;utente può decidere come regolare questi fattori per ottimizzare il protocollo di screening. A titolo di esempio, abbiamo ripreso una 96-pozzetti / h utilizzando le condizioni di cui al punto 5.1. L&#39;analisi delle immagini dipende in gran parte la macchina (o cluster di macchine) utilizzato. Usiamo un 12-core (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB di RAM workstation. La macchina richiede approxirca 40 minuti per analizzare le immagini acquisite da una piastra. Un aspetto importante da prendere in considerazione nella preparazione di queste analisi è la messa a punto di nuovi (o l&#39;ottimizzazione di protocolli esistenti) per consentire la manipolazione e il trattamento di un gran numero di campioni. Un esempio tipico è lo sviluppo della singola colonia di primer PCR approccio, che ha permesso di amplificare rapidamente e frammenti di sequenza di DNA contenenti Coxiella il sito di inserimento di ciascun trasposone, da campioni molto piccoli. Sulla base della nostra esperienza, la polimerasi ad alta fedeltà deve essere attentamente selezionati e testati per ottenere risultati riproducibili. L&#39;unica limitazione di questo approccio può nascondere nell&#39;osservazione che, nella maggior parte dei casi, circa il 30% dei campioni trattati non sono sfruttabili, sia a causa della PCR o la procedura di sequenziamento. Tuttavia, considerando che l&#39;isolamento di nuovi mutanti di trasposoni Coxiella non è un fattore limitante, questo non rappreinviato un grosso problema. Analogamente, lo sviluppo di un test affidabile per quantificare la concentrazione batterica delle scorte mutanti è stato fondamentale per questo approccio. A causa della tendenza ad aggregarsi Coxiella quando in sospensione, l&#39;uso di letture di densità ottica non è applicabile per calcolare la concentrazione di culture Coxiella e l&#39;unica alternativa esistente era PCR quantitativa (qPCR). Qui, l&#39;uso di un DNA agente intercalante fluorescente contrassegnati notevolmente accelerato batteri quantificazione. Questo approccio può anche sfruttare l&#39;uso di linee cellulari stabili esprimenti marcatori fluorescenti per diversi compartimenti intracellulari seconda patogeno utilizzato. Un altro aspetto importante è l&#39;uso di colture cellulari privo di rosso fenolo. Abbiamo osservato che questo indicatore pH ha una fluorescenza naturale attraversa spettro rosso e verde che satura il segnale registrato sul lettore di fluorescenza automatizzato. Tegli strategia qui presentata si basa su casuale mutagenesi trasposoni. Per i mutanti di interesse, si consiglia di convalidare trasposizioni unici (e clonalità) con Southern blot e PCR amplificazioni del sito di inserimento trasposoni. Oltre al materiale descritto nella sezione protocollo, squadre interessate a utilizzare l&#39;approccio di screening qui presentato, avranno grande vantaggio nel set up di un database relazionale per la raccolta dati, un server per la memorizzazione dei dati e di una stazione di lavoro per l&#39;analisi delle immagini rapida. È importante sottolineare che il metodo qui descritto è adatto per lo studio di altri patogeni batterici intracellulari fornito un metodo di mutagenesi casuale esiste per il patogeno, linee cellulari possono essere infettati dal patogeno e questo mostra un fenotipo specifico durante l&#39;infezione.

L&#39;emergente, batterio endemico Coxiella burnetii è responsabile di grandi epidemie di febbre Q, una debilitante zoonosi simil-influenzale con grave salute e l&#39;impatto economico 1. I principali serbatoi di Coxiella sono animali domestici e da fattoria, e si stima che oltre il 90% dei bovini da latte negli Stati Uniti portano C. burnetii 2. Gli esseri umani sono ospiti accidentali che vengono infettati da inalazione di aerosol contaminati. Febbre Q umana si manifesta sia come una malattia acuta o cronica, che può avere complicanze fatali, con un tasso di mortalità raggiunge il 65% 1,3. Con una dose infettiva di 1 - 10 organismi, Coxiella è il patogeno più infettiva noto ed è stato studiato come potenziale arma bio 4. La recente epidemia esplosiva di febbre Q nei Paesi Bassi (2007 - 2010), con casi crescente da 182 a più di 2.000 all&#39;anno, si pone come un esempio della grave virulenza di questo patogeno5. La notevole efficienza di infezioni Coxiella è probabilmente associata con la sua resistenza allo stress ambientale, in combinazione con il suo adattamento unico di ospitare le cellule. Infatti, Coxiella è presente nell&#39;ambiente sotto forma di varianti metabolicamente inattive a piccole cellule (SCV), che sono notevolmente resistenti alle diverse condizioni difficili (essiccamento, temperatura, etc.). Distributori sono up presa da fagociti via α V β 3 integrine 6 mentre l&#39;invasione delle cellule non fagocitiche è mediato dal Coxiella adesione / invasione OmpA 7 e un recettore non ancora identificato. Dopo l&#39;assorbimento, Coxiella risiede in vacuoli aderenti, positivi per i marcatori endosomali primi Rab5 e EEA1 8. I batteri rispondono a endosomiale acidificazione convertendo alle varianti a grandi cellule metabolicamente attive (LCV) e l&#39;attivazione di un sistema di secrezione di tipo 4 Dot / Icm (T4SS) 9, Altamente omologa a quella di Legionella pneumophila 10. La secrezione di effettori Dot / ICM consente coxiella di generare un grande vano acido LAMP1-positivo contenente enzimi lisosomiali attivi dove i batteri possono prosperare e attivamente proteggere le cellule infette da apoptosi 11. Pertanto, il ciclo di intracellulare Coxiella è controllata dalla traslocazione Dot / Icm-mediata di effettori batterici 12, tuttavia, i fattori microbici coinvolti nell&#39;invasione cellula ospite, replicazione batterica e la diffusione dell&#39;infezione sono generalmente poco noti. La combinazione di trasposoni mutagenesi e analisi basate sulla fluorescenza, stiamo sviluppando approcci imparziali per l&#39;identificazione simultanea di fattori batterici coinvolti nelle fasi principali di infezioni Coxiella: 1) internalizzazione all&#39;interno delle cellule ospiti, 2) la replica intracellulare, 3) spread cella-a-cella e 4) la persistenza. Fino ad oggi, abbiamo proiettato oltre 1.000 mutations in 500 sequenze Coxiella codificanti, che ci ha fornito intuizioni senza precedenti nelle interazioni ospite-patogeno che regolano Coxiella patogenesi 7. Da notare, questo approccio può essere applicato allo studio di altri patogeni intracellulari che condividono caratteristiche di biologia cellulare con Coxiella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasione e la colonizzazione delle cellule ospiti di batteri patogeni dipendono dall&#39;attività di un gran numero di proteine ​​procariotiche, definite come fattori di virulenza, che può sovvertire e manipolare funzioni host chiave. Lo studio delle interazioni ospite / patogeno è quindi estremamente importante per comprendere le infezioni batteriche e di sviluppare strategie alternative per combattere le malattie infettive. Questo approccio tuttavia, richiede lo sviluppo di nuovi saggi high throughput per la imparziale, l&#39;identificazione automatica e la caratterizzazione dei determinanti di virulenza batterica. Qui, si descrive un metodo per la generazione di una libreria mutante GFP-tagged by trasposone mutagenesi e lo sviluppo di screening ad alto contenuto di approcci per l&#39;identificazione simultanea di più fenotipi trasposoni-associata. Il nostro modello di lavoro è intracellulare batterica burnetii patogeno Coxiella, l&#39;agente eziologico della febbre zoonosi Q, che è associato con sévere epidemie con un conseguente onere sanitario e economico. La natura obbligato intracellulare di questo patogeno è, fino a poco tempo, gravemente ostacolato l&#39;identificazione dei fattori batterici coinvolti nella patogeno ospite, rendendo di Coxiella il modello ideale per l&#39;attuazione di approcci high-throughput / alto contenuto.

Dopo l&#39;isolamento di mutanti di trasposoni, singola colonia innesco PCR è un robusto, metodo di high-throughput per identificare il sito di inserimento trasposoni per ogni mutante. Questo approccio deriva da un tipico protocollo nested PCR ma qui un singolo innesco ibrida specificamente e / o non specifico per il DNA template seconda della rigorosità della temperatura di ricottura (Figura 1A). I prodotti tipici di PCR costituiti da più frammenti di DNA, la maggior parte dei quali sono specifici (Figura 1B). L&#39;uso di un diverso Primer di sequenziamento che annealing proprio a monte della ITR trasposone, ed a valle della sequenza riconosciuta da primer di amplificazione prevede specificità per la fase di sequenziamento (Figura 1C). Software automatizzato per l&#39;analisi di sequenza allinea le sequenze ottenute al genoma Coxiella fornendo il luogo esatto di inserzione di trasposoni (Figura 1C). Tutti inserzione di trasposoni possono essere quindi annotated sul genoma Coxiella (Figura 1D). Ogni mutante Coxiella è isolata e amplificata in condizioni asettiche in ACCM-2 di media prima di uno stoccaggio o di screening. La Figura 2 illustra un esempio di 38 mutanti di trasposoni in 16 punti / ICM geni Coxiella (Figura 2A). Per valutare la fattibilità di mutanti Coxiella, curve di crescita axeniche sono ottenute campionando colture batteriche per 7 giorni post-inoculazione e l&#39;applicazione del test di concentrazione batterica descritto in 1.5 (Figurie 2B). Mutanti amplificati vengono poi incubate con cellule epiteliali, in triplicato piastre a 96 pozzetti per 7 giorni. Tutti i mutanti Coxiella generati essendo GFP-tag, curve di crescita intracellulari sono ottenute misurando l&#39;intensità di fluorescenza GFP di ogni pozzetto, ogni 24 ore, e riportando i valori misurati in funzione del tempo (Figura 2C). Intrcurve di crescita acellulari forniscono analisi quantitativa dei fenotipi associati con ogni inserimento trasposoni nel genoma Coxiella. Per aggiungere informazioni qualitative sugli stessi mutanti di trasposoni, abbiamo optato per l&#39;acquisizione automatica delle immagini e analisi. Sette giorni dopo l&#39;infezione, le piastre sono fissate, trasformati per immunofluorescenza come descritto in 4 e analizzati utilizzando un processo automatizzato, microscopio a epifluorescenza come descritto nella 5. immagine automatica software di analisi come CellProfiler (Broad Institute, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) elabora i canali acquisiti oggetti per analisi comparative (figura 3) in modo indipendente e segmenti identificati. Questo consente l&#39;identificazione e la caratterizzazione morfologica dei nuclei ospitanti cellulari, contorni di cellule, lisosomi e Coxiella colonie (Figura 3 pannelli superiori). Correlazione colonie Coxiella con le cellule ei lisosomi permette ai Identificatisu e specifiche analisi morfologica di Coxiella vacuoli -non (che sono LAMP1 positivi, Figura 3 pannello in basso a sinistra). Correlazione colonie Coxiella con contorni della cellula ospite consente l&#39;identificazione e specifica analisi morfologica delle cellule infette (Figura 3 pannello in basso al centro). Infine, i 4 canali vengono uniti per scopi di controllo qualità illustrazione e (Figura 3 in basso pannello di destra). I dati ottenuti da analisi delle immagini automatizzata possono essere tracciati uno contro l&#39;altro per ottenere &quot;grafici a dispersione multi-fenotipiche&quot;. Come esempio, nella Figura 4A zona media (in micron 2) di colonie Coxiella è tracciata contro il numero di colonie per cella (Figura 4A), al fine di identificare mutazioni che influenzano la replicazione intracellulare di Coxiella (replica fenotipo) e / o la capacità dei batteri di invadere le cellule ospiti (internalization fenotipo). L&#39;analisi statistica è stata usata per definire le regioni nel risultante grafico a dispersione corrispondente a lievi (-4 &lt;Z-score ≤ -2) e grave (Z-score ≤ -4) fenotipi. Mutanti sono stati osservati in 3 gruppi principali: le mutazioni che hanno determinato una crescita intracellulare difettoso di Coxiella sono stati raggruppati nella parte più a sinistra del grafico (Figura 4A, puntini rosa e rosso); mutazioni che hanno interessato Coxiella internalizzazione nelle cellule sono state raggruppate nella parte inferiore del grafico (Figura 4A, blu chiaro e scuro punti) e, infine, i punti verdi nella regione più a destra della trama corrisponde a mutazioni conseguente fenotipi non significativi ( Z-score&gt; -2). È importante sottolineare che, mutanti che non riescono a replicare, ma sono ancora in grado di invadere le cellule ospiti, vengono rilevati dopo 7 giorni di infezione da batteri singoli o piccole colonie, adiacente ad ospitare nuclei delle cellule (Figura 4C, secondo pannello). Pertanto, la dimensione di Coxiella colo &quot;Nies &quot;sarà influenzato in modo significativo, ma il numero delle cellule infette non varierà rispetto alle cellule -infected WT Coxiella. Al contrario, le mutazioni che influenzano la capacità di Coxiella di invadere cellule ospiti determinano una diminuzione del numero di colonie / cellule. Quando questo numero è significativamente inferiore a 1, indica che, in media, vi è una diminuzione del numero complessivo di cellule infette. In alternativa, l&#39;area media (in micron 2) delle colonie Coxiella può essere tracciata contro il numero di cellule ospiti sopravvissute infezione (Figura 4B), per identificare mutazioni che conferiscono citotossicità di Coxiella (fenotipo citotossico). Come sopra, l&#39;analisi statistica è stata usata per definire le regioni nel risultante grafico a dispersione corrispondente a lievi (-4 &lt;Z-score ≤ -2) e grave (Z-score ≤ -4) fenotipi. La maggior parte screening mutazioni non ha influenzato in modo significativo la sopravvivenza delle cellule, indipendentemente replicazione batterica all&#39;interno di hostcellule (punti verdi Figura 3B). 37 mutazioni sopravvivenza della cellula ospite forma lieve (Figura 3B, punti luce rossa), e 7 mutazioni erano particolarmente dannoso per ospitare sopravvivenza cellulare (figura 3B, puntini rossi scuri). Si noti che i parametri addizionali ottenute dall&#39;immagine procedura di analisi automatica possono essere usate per derivare altri grafici, a seconda delle esigenze sperimentali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Sequencing e annotazione di Coxiella mutanti di trasposoni (A) primer colonia singola PCR è usato per amplificare frammenti di DNA contenenti il sito di inserimento trasposoni. Un primer di amplificazione (Amp) è utilizzato sia come primer specifici e non specifici a seconda della rigorosità della temperatura di ricottura. (B) Tipico risultato di singola colonia di primer PCR. Ogni riattisu produce una serie di frammenti di dimensioni variabili, alcune delle quali contengono il sito di inserzione trasposone; alcuni altri sono amplificati casualmente come sottoprodotti della bassa stringenza ciclo PCR. (C) L&#39;uso di un primer di sequenziamento (Seq) che ibridizza alla sequenza trasposone permette il sequenziamento dei frammenti di interesse. Software (D) Le analisi della sequenza consente l&#39;annotazione automatica di inserzione di trasposoni sul genoma batterico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2:. Axeniche e la crescita intracellulare di Coxiella mutanti di trasposoni (A) Nella schermata pilota, abbiamo isolato, sequenziato e proiettato 38 mutanti di trasposoni in 16 nucleo gEnes del sistema di secrezione dot / ICM Coxiella (indicati in rosso). (B) Al fine di valutare la fattibilità di ogni mutante trasposoni, la crescita di ogni isolare in terreno di coltura axeniche viene monitorata in 8 giorni utilizzando una fluorescenza tagged agente intercalante del DNA. (C) Ogni mutante viene quindi utilizzato per infettare cellule epiteliali. Come il trasposone possiede una cassetta GFP, la crescita batterica intracellulare è monitorato oltre 7 giorni di infezione, seguendo le variazioni di fluorescenza GFP associata con la replica Coxiella, usando un lettore per micropiastre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: analisi delle immagini automatizzata delle infezioni Coxiella Un auto.microscopio a epifluorescenza accoppiate viene utilizzato per l&#39;immagine di 21 posizioni per pozzetto di triplicato piastre da 96 pozzetti. I segmenti software di analisi dell&#39;immagine oggetti in ogni canali acquisiti per la quantificazione e analisi. In tutti i casi, sono esclusi oggetti toccano il bordo delle immagini. (A) Il canale Hoechst è utilizzato per identificare i nuclei della cellula ospite (cerchiato in verde). (B) Questi sono usati come semi per identificare contorni della cellula ospite nel canale Cy3 (la posizione dei nuclei è cerchiato in blu, contorni cellulari sono in verde). (C) Il canale Cy5 è utilizzato per identificare compartimenti LAMPADA1-positive (cerchiato in verde); solo gli oggetti inclusi nei contorni di cellule individuate in precedenza (in rosso) sono conservati per l&#39;analisi delle immagini. (D) Il canale GFP viene utilizzato per identificare colonie Coxiella (cerchiato in verde). (E) Correlazione colonie Coxiella con scomparti LAMPADA1 positivo permette l&#39;identificazione di Coxiella </em&gt; vacuoli -contenenti (CCV); solo gli oggetti inclusi nei contorni di cellule individuate in precedenza (in verde) sono conservati per l&#39;analisi delle immagini. (F) Correlazione colonie Coxiella con contorni cellulari permette l&#39;identificazione delle cellule infette (pseudocolored). (G) Le immagini acquisite nei 4 canali di fluorescenza (corrispondente a colonie Coxiella (verde), nuclei delle cellule ospite (blu), membrana plasmatica della cellula ospite (grigio), compartimenti LAMPADA1-positivo (rosso)) vengono fuse e utilizzata per l&#39;illustrazione e la qualità controllo. Scala bar 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4: identificazione su larga scala dei fattori coinvolti nella Coxiella host / patogeno interagisconoioni. (A) La superficie media (in micron 2) di colonie Coxiella è tracciata contro il numero relativo di colonie per cella, per identificare replica e internalizzazione fenotipi di interesse. Punti verdi rappresentano fenotipi che si discostano da WT coxiella da un Z-score&gt; -2 (non significativo). Rosa e puntini blu rappresentano replica e internazionalizzazione fenotipi, rispettivamente, con un Z-score tra -2 e -4 (fenotipi lievi). Rosso e puntini blu scuro rappresentano fenotipi con Z-score ≤ -4 (fenotipi forti). (B) La superficie media (in micron 2) delle colonie Coxiella è stata tracciata contro il numero totale di cellule infettate (e non infetti) sopravvissute 7 giorni di infezione per valutare l&#39;effetto citotossico risultante dalla inserzione di trasposoni. Punti verdi rappresentano fenotipi che si discostano da WT coxiella da un Z-score&gt; -2 (non significativo). Puntini rosa rappresentano citotossico phenotypes con Z-score tra -2 e -4 (fenotipi lievi). I punti rossi rappresentano fenotipi citotossici con Z-score ≤ -4 (fenotipi forti). Le frecce indicano mutanti illustrate dal corrispondente lettera minuscola in C. (C) Immagini rappresentative della replica, internalizzazione e fenotipi citotossici. In tutti i casi, i nuclei delle cellule ospiti sono in rosso, colonie Coxiella sono in verde. Scala bar 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii è un batterio Gram-negativi obbligato intracellulare responsabile della zoonotici malattia febbre Q. Qui si descrivono i metodi per la generazione di Coxiella mutanti di trasposoni fluorescente nonché l&#39;identificazione automatizzata e l&#39;analisi dei risultanti internalizzazione, replica e citotossici fenotipi.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

9.7K Views.  Université Montpellier.  Coxiella burnetii è un batterio Gram-negativi obbligato intracellulare responsabile della zoonotici malattia febbre Q. Qui si descrivono i metodi per la generazione di Coxiella mutanti di trasposoni fluorescente nonché l'identificazione automatizzata e l'analisi dei risultanti internalizzazione, replica e citotossici fenotipi. 

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A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Uno screening genetico per isolare Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Facilitare Drug Discovery: un sistema automatico di alta Tenore infiammazione in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

Identificazione di geni novelli associati con alginato di produzione in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Utilizzo Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesi Mariner Transposon-mediata

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

High throughput sequenziamento parallelo al Fitness misura di Leptospira interrogans trasposone inserimento mutanti durante dorato siriano criceto infezione

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Replica di ordinato, Nonredundant biblioteca del ceppo di Pseudomonas aeruginosa PA14 trasposone inserimento mutanti

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Valutazione visiva e microscopiche di Streptomyces mutanti inerente allo sviluppo

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...