Name: antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads
Uploaded: 2016-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
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1. anticorpo di cattura su Perle G ad alta capacità di proteine ​​magnetica A o proteine ​​magnetica <ol><li> Uniformemente ri-sospendere sfere magnetiche di agitando delicatamente. Mantenere la divisa di sospensione quando si dispensa perle. </li><li> Aggiungere 50 ml di perline liquami in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Mettere nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere con attenzione il buffer di stoccaggio. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di anticorpi tampone vincolante. </li><li> Mescolare e posizionare nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere con attenzione il tampone di legame. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di campione contenente 50-100 mg di anticorpi ai talloni. I campioni possono essere purificati anticorpi o anticorpi in supporti delle cellule. </li><li> Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. </li><li> Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di anticorpi tampone di legame / lavaggio e mescolare. Mettere nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il tampone vincolante / lavaggio. Ripetere questo sTEP per un totale di due lavaggi. </li><li> Procedere alla sezione 2 di anticorpi di etichette che utilizzano la chimica ammina o alla Sezione 3 per gli anticorpi etichetta con tiolo chimica. </li></ol> 2. Anticorpo Labeling Utilizzando Amine Chimica <ol><li> Coniugato anticorpo <ol><li> Aggiungere 100 ml di tampone ammina coniugazione ai talloni. </li><li> Sciogliere i coloranti fluorescenti ammina reattiva (AlexaFluor 532-SE): 10 mg / ml aggiungendo 100 ml di dimetilsolfossido (DMSO) a 1,0 mg di colorante. Mescolare nel vortex. Rendere questa soluzione al momento dell&#39;uso. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di tintura amminico reattivo per 100 mg di anticorpo. Nota: in genere si raccomanda un 5-20 molare eccesso di colorante reattivo. Tuttavia, quantità di colorante reattivo aggiunto alla reazione deve essere empiricamente ottimizzata a seconda colorante desiderato rapporto anticorpi e intrinseche proprietà anticorpi. </li><li> Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in suspension. </li><li> Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di anticorpi tampone di legame / lavaggio e mescolare. Mettere nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere e gettare tampone di legame / lavaggio. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi. </li></ol></li><li> anticorpo di recupero <ol><li> Aggiungere 50 ml di tampone di eluizione ai talloni. </li><li> Mescolare per 5 minuti a temperatura ambiente usando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione. </li><li> Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere campione eluito e trasferimento in un nuovo tubo micro-centrifuga contenente 5 ml di tampone di neutralizzazione. </li><li> Ripetere il processo ancora una volta e in comune i campioni eluiti. </li><li> Quantificare la concentrazione di anticorpi e tingere-to-anticorpo rapporto come descritto nella Sezione 4. </li></ol></li></ol> 3. Anticorpo etichettatura Utilizzando Thiol Chimica <ol><li> anticorpo Riduzione <ol><li> Aggiungere 250 microlitridi tampone coniugazione tiolo e mix. Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere ed eliminare il buffer. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Aggiungere 100 ml di tampone coniugazione tiolo. </li><li> Aggiungere ditiotreitolo (DTT) ad una concentrazione finale di 2,5 mM. </li><li> Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione. </li><li> Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e scartare il buffer. </li><li> Aggiungere 250 ml di tampone coniugazione tiolo e mescolare. Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere ed eliminare il buffer. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi. </li><li> Aggiungere 100 ml di tampone coniugazione tiolo. </li></ol></li><li> Coniugato anticorpo <ol><li> Sciogliere il colorante tiolo reattivo a 10 mg / ml aggiungendo 100 ml di DMSO a 1,0 mg di colorante. Mescolare nel vortex. Rendere questa soluzione al momento dell&#39;uso. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di tintura tiolo reattivo per 100 mg di anti-corpo. Nota: in genere si raccomanda un 5-20 molare eccesso di colorante reattivo. Tuttavia, quantità di colorante reattivo aggiunto alla reazione deve essere empiricamente ottimizzata a seconda colorante desiderato rapporto anticorpi e intrinseche proprietà anticorpi. </li><li> Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione. </li><li> Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 250 ml di tampone coniugazione tiolo e mescolare. Posizionare nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il tampone. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi. </li></ol></li><li> Elute anticorpo <ol><li> Aggiungere 50 ml di tampone di eluizione ai talloni. </li><li> Mescolare per 5 minuti a temperatura ambiente usando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione. </li><li> Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere campione eluito e trasferimento in un nuovo tubo micro-centrifuga contenente 5 ml di neutBuffer ralization. </li><li> Ripetere il processo ancora una volta e in comune i campioni eluiti. </li><li> Quantificare la concentrazione di anticorpi e tingere-to-anticorpo rapporto come descritto nella Sezione 4. </li></ol></li></ol> Rapporto 4. Calcolare Dye-to-anticorpo <ol><li> Misurare l&#39;assorbanza del coniugato anticorpo-dye a 280 nm (A280) e alla λmax per il colorante (Amax). </li><li> Calcolare la concentrazione di anticorpi: Anticorpo Concentrazione (mg / ml) = A280 - (A max × CF) / 1.4 dove CF = fattore di correzione del colorante (fornita dal produttore). </li><li> Calcolare il rapporto dye-to-anticorpi: Dye-to-anticorpo Ratio (DAR) = (A max × 150.000) / Ab Concentrazione (mg / ml) × ε colorante dove, tintura ε = coefficiente di estinzione del colorante al massimo assorbimento e il peso molecolare di anticorpo = 150.000 Da. </li></ol>

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Authors are employees of Promega Corporation.

L&#39;obiettivo di questo studio era di sviluppare un metodo per etichettare anticorpi, presenti nei mezzi di cella a basse concentrazioni, con una varietà di piccole molecole. Tale metodo permette un gran numero di anticorpi, durante le prime fasi di scoperta di anticorpi, etichettato con piccole molecole e schermati con un saggio biologicamente rilevante. Uno di questi test è il test degli anticorpi internalizzazione mediata dai recettori in cui internalizzazione può variare tra gli anticorpi anche con affinità si...

Gli anticorpi marcati con piccole molecole sono forse i reagenti più utilizzati in biologia 1,2. Anticorpi marcati con coloranti fluorescenti e biotina sono ampiamente utilizzati nella diagnostica per immagini, immunodosaggi, citometria a flusso, Western blot e immunoprecipitazione tra le altre applicazioni 3-6. Anticorpi radiomarcati 3,7 trovano ampio utilizzo nella diagnostica per immagini e la terapia, gli anticorpi marcati con farmaci citotossici (ADC) stanno offrendo nuove opzioni per il trattamento dei tumori, e due ADC sono già stati approvati per uso terapeutico 8. Nonostante il loro ampio uso, le modalità di etichettatura anticorpi sono rimasti sorprendentemente invariate e di solito sono molteplici reazioni e dissalazione passi 9-12. metodi di soluzione funzionano molto bene nei casi in cui deve essere etichettato solo pochi anticorpi e sono disponibili in forma altamente purificata ad alta concentrazione e in volumi sufficienti. Tuttavia, per le applicazioni più recenti come ADC, vi è unnecessario etichettare anticorpi nella fase ibridoma presto in modo che possano essere sottoposti a screening per proprietà biologicamente rilevanti, ad esempio, recettore-mediata anticorpo internalizzazione 13-16. Nella fase ibridoma, volumi di campione sono limitati, gli anticorpi sono espressi a basse concentrazioni e un numero di campioni sono grandi, quindi metodi di etichettatura di soluzioni basate non sono adatti. Al fine di semplificare e migliorare il throughput dei tradizionali metodi di etichettatura degli anticorpi, alcuni approcci alternativi sono stati proposti 17,18. Un approccio consiste nell&#39;utilizzare Protein amagnetico A perline affinità confezionati in piccole colonne di catturare anticorpi seguita dalla reazione di marcatura ed eluizione di proteina marcata e purificata. Questo metodo può essere utilizzato per etichettare anticorpi direttamente dal supporto cellulare, tuttavia, l&#39;uso di colonne può essere laborioso. Un metodo basato branello magnetico è stato recentemente riportato 19 che elimina l&#39;uso di colonne e produttività ma a causa miglioraall&#39;anticorpo limitata capacità delle perline vincolante, solo nanogrammo a basse quantità microgrammi di anticorpi potrebbe essere etichettato. Recentemente abbiamo sviluppato e usato ad alta capacità magnetica Proteina A e Proteine ​​perline G (&gt; 20 mg di IgG umana / ml di perline stanziali) di etichettare gli anticorpi presenti nei mezzi di cella con piccole molecole 20. L&#39;elevata capacità delle perle permette decine a centinaia di microgrammi di anticorpo da etichettare convenientemente e la risposta magnetica rapida delle perline semplifica la gestione e il trattamento di un gran numero di campioni in parallelo. Utilizzando coloranti fluorescenti come surrogati per le piccole molecole, si dimostra che il metodo è compatibile con ammina e tiolo etichettatura chimica e offre alti recuperi di anticorpi marcati e molto puri. Questo protocollo e il video di accompagnamento descrivono l&#39;etichettatura on-tallone di anticorpi di topo presenti nei mezzi di comunicazione cellulari che utilizzano proteine ​​magnetica A e G proteina perline. Il protocollo èsuddiviso in quattro sezioni: Sezione 1 descrive la cattura di anticorpi sul tallone da campioni biologici. Dopo la cattura, l&#39;etichettatura di anticorpi con colorante fluorescente che utilizzano la chimica ammina o che utilizzano la chimica tiolo è descritta nelle sezioni 2 e la sezione 3, rispettivamente. Infine, la sezione 4 descrive il metodo per il calcolo della concentrazione di anticorpo e il colorante rapporto anticorpo.

<table><tbody><tr><td>Magne Protein A Beads</td><td>Promega Corporation</td><td>&amp;nbsp;G8781</td><td></td></tr><tr><td>Magne Protein G Beads</td><td>Promega Corporation&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;G7471</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)</td><td>Life Technologies</td><td>A20001</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td><td>Life Technologies</td><td>A10255</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-ME (Maleimide)</td><td>Life Technologies</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Promega</td><td>Z5332</td><td></td></tr></tbody></table>

antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads

Anticorpi marcati con piccole molecole come coloranti fluorescenti, farmaci citotossici, e traccianti radioattivi sono strumenti essenziali nella ricerca biomedica, immunodiagnostica e più recentemente come agenti terapeutici. I metodi tradizionali per gli anticorpi di etichettatura con piccole molecole richiedono anticorpi purificati in concentrazione relativamente alta, coinvolgono più passaggi dialisi ed hanno limitato il throughput. Tuttavia, diverse applicazioni, tra cui il campo di anticorpi coniugati farmaco (ADC), potranno beneficiare di nuovi metodi che consentano l&#39;etichettatura di anticorpi direttamente dal supporto di cellule. Tali metodi possono consentire anticorpi proiettati in saggi biologicamente rilevanti, ad esempio, il dosaggio degli anticorpi internalizzazione mediata da recettori nel caso di ADC. Qui, descriviamo un (metodo on-tallone) metodo che consente l&#39;etichettatura di piccole quantità di anticorpi direttamente dal supporto di cellule. Questo approccio utilizza ad alta capacità magnetica proteina A e la proteina G perline affinità per catturare gli anticorpidal supporto di cellule seguita da marcatura con piccole molecole utilizzando sia ammina o chimica tiolo e successiva eluizione degli anticorpi marcati. Prendendo coloranti fluorescenti come surrogati per le piccole molecole, dimostriamo l&#39;etichettatura on-tallone di tre diversi anticorpi di topo direttamente dal supporto di cellule utilizzando sia ammina e tiolo chimica etichettatura. L&#39;elevata affinità di legame di anticorpi anti proteine ​​A e proteine ​​G garantisce elevati recuperi, nonché di elevata purezza degli anticorpi marcati. Inoltre, l&#39;uso di sfere magnetiche consente a più campioni vengano maneggiati manualmente, migliorando così significativamente il throughput di etichettatura.

Uno schema per l&#39;etichettatura anticorpi con piccole molecole con elevata capacità Protein magnetico A e proteina G perline è mostrato in Figura 1. Anticorpi catturato sulla proteina magnetica perline G possono essere etichettati con piccole molecole, per coloranti fluorescenti esempio, utilizzando la chimica ammina quali etichette ammine primarie degli acidi lisina amminoacidi o utilizzando la chimica tiolo che le etichette ai tioli ridotti nella regione cerniera ...

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Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Il metodo on-tallone per etichettare anticorpi con piccole molecole permette l&#39;etichettatura di una piccola quantità di anticorpi direttamente dal supporto cellulare. Questo metodo è compatibile con ammina e chimica tiolo, e può gestire campioni multipli in parallelo, manualmente o utilizzando piattaforme automatizzate.

Anticorpo etichettatura con coloranti fluorescenti utilizzando proteine ​​magnetica A e proteine ​​G perline

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

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Immunology and Infection

11.8K Views.  Promega Corporation.  Il metodo on-tallone per etichettare anticorpi con piccole molecole permette l'etichettatura di una piccola quantità di anticorpi direttamente dal supporto cellulare. Questo metodo è compatibile con ammina e chimica tiolo, e può gestire campioni multipli in parallelo, manualmente o utilizzando piattaforme automatizzate. 

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Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is protein conjugation by genetically introducing an unnatural amino acid containing a bioorthogonal functional group. This report describes a detailed protocol for site-specific antibody conjugation. The protocol includes experimental details for the genetic incorporation of an azide-containing amino acid, and the conjugation reaction by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). This strain-promoted reaction proceeds by simple mixing of the reacting molecules at physiological pH and temperature, and does not require additional reagents such as copper(I) ions and copper-chelating ligands. Therefore, this method would be useful for general protein conjugation and development of antibody drug conjugates (ADCs).

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

Efficiente e anticorpi etichettatura per cicloaddizione azide-alchino Strain-promosso site-specific

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

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Biochimica

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Protocollo sperimentale per il rilevamento<em&gt; cianobatteri</em&gt; In campioni liquidi e solidi con un anticorpo Microarray chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Ambiente

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Neuroscienze

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Biologia

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Profiling dell'espressione genica specifica del tipo di cella nel fegato del mouse

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD), and so on. To detect and analyze soluble or diffuse protein oligomers or aggregates, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which can detect the diffusion speed and brightness of a single particle with a single molecule sensitivity, has been used. However, the proper procedure and know-how for protein aggregation detection have not been widely shared. Here, we show a standard procedure of FCS measurement for diffusion properties of aggregation-prone proteins in cell lysate and live cells: ALS-associated 25 kDa carboxyl-terminal fragment of TAR DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) and superoxide dismutase 1 (SOD1). The representative results show that a part of aggregates of green fluorescent protein (GFP)-tagged TDP25 was slightly included in the soluble fraction of murine neuroblastoma Neuro2a cell lysate. Moreover, GFP-tagged SOD1 carrying ALS-associated mutation shows a slower diffusion in live cells. Accordingly, we here introduce the procedure to detect the protein aggregation via its diffusion property using FCS.

We here introduce a procedure to measure protein oligomers and aggregation in cell lysate and live cells using fluorescence correlation spectroscopy.

Rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

Source: Blanco, Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54994">Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

Anticorpo etichettatura con coloranti fluorescenti utilizzando proteine magnetica A e proteine G perline

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Efficiente e anticorpi etichettatura per cicloaddizione azide-alchino Strain-promosso site-specific

Protocollo sperimentale per il rilevamento

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine RNA binding

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

Profiling dell'espressione genica specifica del tipo di cella nel fegato del mouse

Rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

Una tecnica per rilevare i ceppi cianobatterici utilizzando un chip di microarray di anticorpi

Anticorpo etichettatura con coloranti fluorescenti utilizzando proteine ​​magnetica A e proteine ​​G perline

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Efficiente e anticorpi etichettatura per cicloaddizione azide-alchino Strain-promosso site-specific

Protocollo sperimentale per il rilevamento

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Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

Profiling dell'espressione genica specifica del tipo di cella nel fegato del mouse

Rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

Una tecnica per rilevare i ceppi cianobatterici utilizzando un chip di microarray di anticorpi

Anticorpo etichettatura con coloranti fluorescenti utilizzando proteine magnetica A e proteine G perline

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

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Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)