Il miglior principio della spettroscopia di correlazione a fluorescenza, FCS, è stato inventato inizialmente negli anni '70. Negli anni '90, importanti e molti miglioramenti per fcs sono stati stabiliti combinando con una microscopia confocale apparato. Da allora, FCS è stato utilizzato per molte applicazioni di cura chimica e virale, come le interazioni molecolari e l'analisi dell'aggregazione proteica.
L'aggregazione proteica è un segno distintivo dei disturbi neurodegenerativi. La luminosità della fluorescenza sono singole particelle in azione delle dimensioni molecolari spiegate dalle proprietà di diffusione. È molto importante nella misurazione delle aggregazioni proteiche perché può determinare i cicli di vita previsti delle molecole, ma anche distinguere l'omo o l'etero polimerizzazione.
Qui, introduciamo una procedura per misurare la diffusione della sclerosi laterale amiotrofica associata a proteine a forma aggregata utilizzando FCS nei lisati cellulari e nelle cellule vive. Preparare 100 millimetri di plastica che coltiva la cellula Neuro2a seduta comodamente nel normale mezzo di crescita. Confermare la confluenza della cella.
Rimuovere il supporto. Aggiungere 3,5 millilitri di soluzione trypsina-EDTA nel terzo piatto della cartuccia e incubarli a 37 gradi celsius per un minuto. Aggiungere 9,5 millilitri di mezzo di crescita normale nel piatto e sospenderli.
La sospensione cellulare viene mescolata con il blu tripano per macchiare le cellule morte. Aggiungere la sospensione alla diapositiva di conteggio delle celle. Contare il numero di celle utilizzando il contatore delle celle o manualmente.
Controlla il numero di cellulare vivo e la loro vitalità. Diluire la cella nel mezzo contato a 1,0 per 10 alla potenza di 5 per millilitro. Aggiungere due millilitri di sospensione cellulare nel piatto di plastica da 35 millimetri per la lisi cellulare o il piatto dello spazio di crescita per la misurazione delle cellule vive.
Incubare il piatto a 37 gradi Celsius per un giorno. Il giorno dopo, preparare la miscela di DNA plasmide e reagenti di trasfezione. Aggiungere la miscela di trasfezione al mezzo contato dalle cellule e incubare le cellule per 24 ore.
Un giorno dopo. Controllare l'espressione GFP utilizzando un microscopio di routine. Potete vedere i corpi degli ingredienti TDP25 molto luminosi nelle cellule.
La llisi cellulare deve essere eseguita sul banco biochimico. Rimuovere il mezzo nel piatto. Aggiungere due millilitri di PBS a 25 gradi celsius da lavare come mezzo.
Rimuovere il PBS. Posizionare il piatto su una piastra di alluminio sulla parte superiore del ghiaccio frantumato. Immediatamente, aggiungere il tampone di lysis da 200 microliter nel piatto.
Raschiare il piatto usando un raschietto per cellulari. Recuperare il llysate con detriti cellulari non dissolti in un nuovo tubo da 1,5 millimetri. Centrifugare il lysate a quattro gradi celsius.
Per le misurazioni delle cellule vive, sostituire il mezzo con uno nuovo prima della misurazione. Controllare l'attacco cellulare utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Inoltre, controllare l'espressione GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Utilizzare un sistema FCS combinato al microscopio confocale. Accendi il laser da 488 nanometri. Stabilizzare il sistema, almeno, per 30 minuti.
Impostare il percorso ottico. Utilizzare un laser da 488 nanometri per la luce istantanea. Utilizzare uno splitter a fascio appropriato e metri dicroici.
E anche, fusibili a fluorescenza. Di solito, useremo camere in vetro di copertura per la calibrazione e le misurazioni della soluzione. Con attenzione, prendi la camera di vetro di copertura.
Posizionare la superficie del vetro sulla carta di screening dell'obiettivo. Versare la calibrazione FCS. Aggiungere anche la soluzione Rhodamine 6G.
Aggiungere l'acqua ultrapura sull'obiettivo. Non usare l'olio. Impostare la camera sul palco del microscopio.
Spostare il palco nella posizione appropriata. Create la regolazione del foro stenopeica e aprite la procedura guidata di regolazione del foro stenopeica. Monitora la velocità di conteggio dei fotoni come movimento grossolano del foro stenopeica per la direzione x.
La posizione più luminosa è stata giustamente determinata. Quindi, monitora la velocità di conteggio dei fotoni come movimento fine. La posizione più luminosa è stata determinata con successo Questa è la posizione del foro stenopeica per la direzione x.
Allo stesso modo, cerca la posizione più luminosa del foro stenopeica per la direzione y. Anche la posizione più luminosa per la direzione y è stata determinata con successo. Compound la posizione x e y del foro stenopeico.
È meglio regolare la posizione del foro stenopeica prima della misurazione di ogni giorno. Quando il percorso live viene modificato, la posizione del foro stenopeica deve essere regolata di nuovo. Creare una frequenza di conteggio e monitorare la frequenza di conteggio del telefono.
Passare alla modalità di monitoraggio CPM. Contare l'anello di correzione dell'oggetto eseguito in modo che il valore CPM sia il più alto. Chiudere la finestra della tariffa di conteggio.
Inizia con la misurazione della soluzione Rhodamine 6G. Al termine della misurazione, fate clic sull'adattamento per eseguire l'analisi del raccordo curve. Selezionate un modello per il montaggio della vecchia funzione di correlazione.
Per Rhodamine 6G, selezionate il modello per la diffusione tridimensionale a 1 componente con uno stato di tripletta. Impostare l'ora di inizio del raccordo spostando la linea rossa. Fate clic su Adatta tutto (Fit All), per avviare il calcolo del raccordo.
Controllare la deviazione di adattamento. Assicurarsi che i lati siano registrati e negativi, intorno allo zero. Controllare i valori montati.
Assicurarsi che il tempo di diffusione sia approssimativamente nell'intervallo da 20-30 microsecondi. Inoltre, il parametro strutturale va da quattro a otto. Aprite il pannello di adattamento e selezionate un modello per la misurazione.
Immettete lo stesso valore del parametro strutturale nel modello per il campione nel pannello di adattamento. Assicurarsi che il tipo debba essere impostato su Fisso. Misurazione GFP-TDP25 nel llysato cellulare.
Posizionare il lysate nella camera di coverglass. Posizionare il coperchio per evitare di asciugare il lisato. Posizionare il coperchio del palco per un'ombreggiatura leggera.
Nel pannello di acquisizione, impostare la potenza del laser, il tempo di misurazione e le sue ripetizioni. Avviare l'acquisizione. È stato osservato un picco.
Un picco è stato osservato di nuovo. Il picco indica molecole luminose passate attraverso il corpo di rilevamento. I picchi indicano oligomeri o aggregati solubili.
Create un adattamento per eseguire l'analisi del raccordo a curva. Selezionate il modello per la diffusione tridimensionale a 2 componenti con stato tripletta. Impostare l'ora di inizio del raccordo.
Fare clic su Adatta tutto. Controllare i valori montati. SOD1-G85R taggato con misurazione GFP in una cella viva.
A differenza della misurazione della soluzione, consiglio di utilizzare l'incubatore dello stadio di calore. Impostare il piatto di 150 100 zioni sul palco del microscopio. Confermare la messa a fuoco e la posizione utilizzando l'oculare.
Selezionare una cella di misura. Ingrandire e regolare la posizione della cella utilizzando una modalità di scansione rapida. Acquisire l'istantanea delle celle utilizzando la modalità di velocità di scansione lenta.
Selezionate una posizione di misurazione FCS utilizzando lo strumento Posizione (Position). Il mirino indica la posizione di misura. Avviare la misurazione.
La leggera diminuzione del record del tasso di conteggio dei fotoni suggerisce il fotobleaching della GFP. Eseguire il raccordo della curva. Vengono mostrati i risultati rappresentativi della GFP-TDP25 nel llysato cellulare.
Il grafico superiore è un record della frequenza di conteggio dei fotoni. Dove ci sono frecce è un picco, che suggerisce oligomeri solubili e aggregati. Il grafico centrale rappresenta la vecchia funzione di correlazione.
La linea grigia mostra la funzione di correlazione bassa e vecchia. La linea magenta mostra la funzione montata. Le linee tratteggiate indicano gli orari di inizio e fine per il montaggio.
La tabella inferiore mostra il valore montato. Successivamente, vengono mostrati i risultati rappresentativi di SOD1-G85R-GFP in una cella viva. Il grafico superiore rappresenta un record del nostro tasso di conteggio dei fotoni.
È stata osservata la graduale diminuzione del tasso di conteggio dei fotoni registrato, suggerendo il fotobleaching della crescita della FPG per diverse misurazioni. Ciò è dovuto alla lenta velocità di diffusione nelle cellule vive. Il grafico centrale rappresenta la vecchia funzione di correlazione di SOD1.
La linea grigia mostra la funzione di correlazione bassa e vecchia. La linea magenta mostra la funzione montata. Le linee tratteggiate indicano gli orari di inizio e fine con il raccordo.
La tabella inferiore mostra i valori montati. Qui vi mostriamo questa procedura per misurare la diffusione da ogni cellula associata TDP-25 nel lisato cellulare e tutto il mutante di SOD1 nelle cellule vive utilizzando FCS. Gli oligomeri solubili e l'aggregazione nel litolato cellulare possono essere spesso osservati come picchi o esplosioni.
D'altra parte, nelle cellule vive, tali picchi sono raramente osservati, ad eccezione di strutture vive possibilmente ovvie. Una specie di SOD1 mutante che si diffonde lentamente aggiunge luminosità media per singole particelle come l'omopolimerizzazione SOD1 all'interno di noi. La procedura qui illustrata è semplice e utile.
FCS non contiene radiazioni;stato direttamente dormiente. È solo la tua, e la nostra, empatia immaginativa.
