The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

Gli esperimenti con i topi erano in conformità con la legge tedesca e la Società tedesca per le linee guida Neuroscience di allevamento. La cura degli animali e di utilizzo comitati del Università della Ruhr a Bochum hanno concesso i permessi appropriati. 1. Preparazione e coltivazione di corticale astrociti Nota: Completate queste fasi del protocollo almeno 7 d prima di procedere alle fasi successive, come le colture di astrociti dovrebbero svilupparsi in monostrati confluenti prima che i neuroni sono preparati. astrociti primari sono derivati ​​da colture gliali miste ottenute da cuccioli di topo intorno al giorno postnatale (P) 0-3. Tre cervelli (6 cortecce) per beuta T75 devono essere utilizzati. <ol><li> Preparare il mezzo astrociti completandolo Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero v / v cavallo e 0,1% v / v gentamicina in condizioni sterili. Conservare il mezzo a 4 ° C per 2 settimane. </li><li> Cappotto 3x T75 Boccette with 10 ug / mL Poly-D-lisina (PDL; in acqua coltura cellulare-grade) per almeno 1 ora a 37 ° C in presenza di 6% v / v CO 2. Dopo il rivestimento, lavare i flaconi due volte con tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere i cationi non legati, e aggiungere 9 ml di media astrociti. </li><li> Per la preparazione dei cervelli, aggiungere soluzione salina bilanciata di Hank 10 mL (HBSS) a 1x 10 centimetri Petri e 1 mL HBSS a 1x 15 mL tubo (indipendentemente dal numero di cervelli che verrà utilizzato). Tenere un paio di forbici chirurgiche, 2 pinza sottile e un binocolo a portata di mano per la procedura. </li><li> Decapitare 3 cuccioli rapidamente con le forbici chirurgiche e raccogliere le teste in un vuoto 10 centimetri piatto. <ol><li> Eseguire la preparazione delle cortecce sotto il binocolo. Utilizzando due pinza sottile, rimuovere la pelle dorsale dal cranio alla linea mediana, partendo dal collo verso il livello degli occhi. Successivamente, il cervello con i suoi vasi sanguigni è visibile sotto il cranio. </li><li>Fissare la testa alla fine rostrale con un paio di pinze e incidere la linea mediana del cranio, a partire dalla fine posteriore. Successivamente, la clip fuori le metà sinistra del cranio a destra e per esporre il cervello. </li><li> Chiudere la punta della pinza e posizionarlo sul ventre sotto il cervello. Sollevare il cervello fuori dal cranio e trasferirlo in HBSS pieno di 10 centimetri Petri. Procedere allo stesso modo con gli altri campioni fino a quando tutti i cervelli sono raccolti nel piatto. </li></ol></li><li> Dopo aver raccolto il cervello, inizia con la separazione delle cortecce pizzicando fuori romboencefalo usando un paio di pinze, come un paio di forbici. Eseguire un&#39;incisione mediana tra i due emisferi, con un paio di pinze. fissare con cura il cervello con una pinza e tagliare il mesencefalo e bulbi olfattivi utilizzando un secondo pinza per finire con le due metà corticali. </li><li> Fissare la metà corticale con un paio di pinze e sbucciare le meningi dalle emisferi da loro distacco FROM il bordo laterale e successivamente tirando dalla superficie corticale utilizzando un secondo pinza. </li><li> Capovolgere la parte corticale con la sua superficie orientata verso il piatto; attenzione sezionare e rimuovere l&#39;ippocampo a forma di mezzaluna con un paio di pinze. Trasferire i singoli cortecce nel conico tubo da 15 ml utilizzando una pinza chiusi per portare un individuo corteccia. </li><li> Dopo aver raccolto tutte le cortecce, transito verso la cappa a flusso laminare sterile e iniziare con i preparativi per la dissociazione del tessuto corticale. </li><li> Aggiungere 1 ml DMEM in una provetta 2 mL di reazione e aggiungere 0,1% w / v papaina (30 unità). Incubare la sospensione in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C fino a quando una soluzione chiarificata sviluppa (circa 3 min). Aggiungere 0,24 mg / ml di L-cisteina e 20 mg / ml DNAsi e agitare delicatamente. NOTA: Per la digestione, è necessario circa 1 mL di soluzione enzimatica. </li><li> Filtro (0,22 micron dimensione dei pori) per ottenere 1 ml di soluzione sterile prima di aggiungereal tessuto corticale. Incubare le provette per 30 min - 1 ora a 37 ° C (cioè, in un bagno d&#39;acqua). NOTA: i passaggi 1,11-1,14 sono critici e dovrebbe essere completato entro 15 minuti. </li><li> Per terminare la reazione di digestione, aggiungere 1 ml di media astrociti e triturare con cura il tessuto digerito con una pipetta 1 ml. Per triturazione, spostare delicatamente lo stantuffo della pipetta, aspirando così e estrusione la sospensione tessuto corticale. </li><li> Una volta che il tessuto è stato dissociato in una cella singola sospensione, aggiungere 5 ml di media astrociti e centrifugare per 5 min a 216 x g. </li><li> Aspirare il surnatante con cura dal pellet risultante e sospendere nuovamente le cellule in 1 media astrociti ml. </li><li> Aggiungere le sospensioni cellulari per fiaschi T75 rifornito con 9 medio astrociti mL (vedi 1.2). </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in incubatore in presenza di 6% v / v CO 2. Dopo 4 d, eseguire il primo cambio terreno completo (10 mL). Successivamente, modificare il terreno di coltura ogni 2 - 3 d. </li><li> Dopo 7 d, verificare se le cellule hanno formato un monostrato confluente. In caso contrario, attendere per altri 2 - 3 giorni fino è raggiunto completa confluenza della cultura. NOTA: Gli astrociti visualizzare grandi corpi cellulari appiattite, localizzare sul fondo del pallone e non sviluppano processi cellulari notevoli. Essi differiscono dalle piccole cellule progenitrici luminose a contrasto di fase e microglia risiedono in cima al monostrato 17. </li><li> Al fine di eliminare le cellule progenitrici e di ottenere una coltura pura astrociti, posizionare i contenitori T75 su un agitatore orbitale e scuotere le culture O / N a 250 rpm. Assicurarsi che la temperatura viene regolata a 37 ° C e che il filtro del pallone viene sigillato con una pellicola di laboratorio per evitare l&#39;evaporazione del CO 2. </li><li> Il giorno successivo, aspirare il terreno e aggiungere terreno di coltura di 10 ml di fresca rifornito con 20 mM citosina-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) a eliminacellule che si dividono residue te. NOTA: incubazione con AraC per 2 - 3 d in incubatore a 37 ° C, il 6% di CO 2 si tradurrà in una coltura pura astrociti. </li><li> Monitorare la purezza delle colture di astrociti mediante ispezione visiva sotto il microscopio ottico. Se le cellule progenitrici luminoso residuo a contrasto di fase e microglia risiedono ancora in cima alla monostrato astrociti 17 (vedi punto 1.16), ripetere i punti 1.18 e 1.19. NOTA: Il confluenti e monostrati astrociti puri possono essere mantenuti fino a 14 d in incubatrice (37 ° C, il 6% v / v di CO 2) prima di procedere alla fase successiva. Cambiare la metà del mezzo ogni 3 d. Non raccogliere, congelare e scongelare i astrociti, come queste cellule perdono le loro proprietà di supporto neuronali attraverso la procedura di memorizzazione. </li></ol> 2. Gli astrociti preparando per il co-coltura indiretta Nota: 48 - 72 ore prima di preparare i neuroni, astrociti trasferimento al celInserti l-cultura. Generalmente, una singola beuta T75 fornisce un numero sufficiente di cellule per sostenere le colture neuronali ottenuti con una preparazione. <ol><li> Posto come molti inserti come necessario in 24-pozzetti-. Coat ciascun inserto con 10 ug / mL PDL (disciolto in acqua coltura cellulare-grade) per circa 1 ora a 37 ° C, 6% v / v CO 2. Dopo l&#39;incubazione, lavare gli inserti due volte con PBS. Nel frattempo, procede all&#39;elaborazione di astrociti. NOTA: Gli inserti riempiti con PBS possono essere mantenuti fino alla sospensione cellulare astrociti è pronto all&#39;uso. </li><li> Aspirare il mezzo di astrociti (con AraC) e lavare la cultura una volta con 10 ml di PBS per garantire qualsiasi siero residuo viene rimosso. </li><li> Aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina-EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) ai flaconi e incubare le cellule per tripsinizzazione a 37 ° C, 6% v / v CO 2 per circa 10 min. </li><li> Controllare il distacco delle cellule mediante ispezione visiva utilizzando un microscopio e facilitaTE il distacco delle cellule toccando il lato dei flaconi contro desktop. NOTA: i passaggi 2,5-2,8 sono critici e dovrebbe essere completato entro 15 - 20 min. </li><li> Dopo la tripsinizzazione, delicatamente risospendere le cellule in 7 mL medio astrociti e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml. Centrifugare per 5 min a 216 x g. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 media astrociti ml. </li><li> Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio. </li><li> Riempire il fondo dei pozzetti della 24-ben piatto con 500 microlitri di media astrociti e trasferire 25.000 cellule in 500 microlitri di media astrociti in ogni singolo inserimento. Incubare la coltura a 37 ° C, 6% v / v CO 2. NOTA: dopo 42 - 72 ore, le culture raggiungerà circa il 100% di confluenza. In questa fase la purezza della coltura può essere verificata mediante immunocitochimica 11. Le colture confluenti possono essere mantenute per un massimo di 7 d fino procedere allaprossimo passo. Cambiare la metà del mezzo ogni 3 d. </li></ol> 3. Preparazione di primaria neuroni dell&#39;ippocampo Nota: neuroni dell&#39;ippocampo di topo primaria dovrebbero essere derivati ​​da E15.5 - E16 embrioni di topi in gravidanza cronometrati. <ol><li> Preparare mezzo neurone (MEM con 10 mM piruvato di sodio, 0,1% w / v ovalbumina, 2% v / v B27 mezzo integratore, e 0,1% v / v gentamicina (sterile filtrato)), e media di preparazione (HBSS con 0,6% w / v glucosio e 10 mM HEPES (4- (2-idrossietil) acido etansolfonico -1-piperazina)). Pre-calda e pre-equilibrare il mezzo neurone in beute per filtrazione a 37 ° C, 6% v / v CO 2. </li><li> Posizionare il vetro-coprioggetti (diametro 12 mm) nei pozzetti di 24 pozzetti piastre (utilizzare i coprioggetti speciali, che sono dentata per l&#39;utilizzo con inserti colture cellulari). <ol><li> Coat per almeno 1 h con 15 ug / mL Poly-DL-ornitina in acqua (coltura cellulare-grade) a 37 ° C. Utilizzare almeno 500 microlitri per pozzetto per garantire chei coprioggetti sono completamente coperti. Lavare i pozzetti due volte con PBS. Lasciare il PBS nei pozzetti fino placcatura le cellule. Assicurarsi che i pozzi non si asciugano. </li></ol></li><li> Per sezionare i ippocampi, preparare 3x 10 cm piatti pieni di media preparazione e 1x tubo di 2 ml con 1 mezzo di preparazione ml. Preparare forbici e 2 pinza sottile. </li><li> Sacrificare il mouse incinta di dislocazione cervicale, sterilizzare l&#39;addome mediante lavaggio con il 70% v / v di etanolo, e aprire l&#39;addome con le forbici affilate. Asportare l&#39;utero di perline accuratamente con le forbici e trasferire l&#39;organo in 1x 10 centimetri piatto pieno di media preparazione. </li><li> Quindi, rimuovere gli embrioni dall&#39;utero. incidere con cura l&#39;utero e rimuovere la membrana amniotica senza danneggiare gli embrioni utilizzando 2 pinze. Successivamente, decapitate ogni embrione con un paio di forbici e trasferire le teste in un secondo piatto 10 centimetri fornito con media preparazione. </li><li> Procede all&#39;elaborazione delle teste (simile al preparzione descritto nella 1,4-1,7). <ol><li> Immobilizzare la testa con un paio di pinze e incidere il cranio e pelle nella regione del collo vicino al hindbrain, perpendicolare al nevrasse. Utilizzare un secondo paio di pinze per sollevare sia cranio e pelle che ricopre, e piegare la calotta morbida verso la fine rostrale della testa, esponendo così il cervello. </li><li> Con l&#39;aiuto di 2 pinze, staccare il cervello dalla cavità cranica. Per fare questo, chiudi 1 paio di pinze e separare il cervello dal cranio a partire da bulbi olfattivi e lo spostamento verso il rombencefalo. Raccogliere il cervello in un altro 10 centimetri piatto pieno di media preparazione. </li></ol></li><li> Sezionare ippocampi dalle porzioni corteccia come descritto sopra per la preparazione astrociti (passo 1.6). Rimuovere il ippocampi da ciascun emisfero e raccoglierli nel tubo 2 ml riempita con il mezzo di preparazione. </li><li> Dopo aver completato la dissezione, trasferire il tubo al banco flusso laminare sterile e Digest il tessuto dell&#39;ippocampo con 1 soluzione di digestione mL contenente papaina. Preparare la soluzione di digestione come descritto nella fase 1,9-1,10, ma utilizzare MEM invece DMEM. NOTA: i passaggi 3,9-3,12 sono critici e dovrebbe essere completato entro 10 - 15 minuti. </li><li> Dopo il completamento della digestione, prelevare con attenzione la soluzione digestione delicata aspirazione con una pipetta. </li><li> Lavare il ippocampi 3 volte con mezzo neurone dalla sequenza aggiungendo e, successivamente, con attenzione aspirare 1 ml di coltura fresco di media per ogni ciclo di lavaggio. Non centrifugare la sospensione cellulare. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, triturare accuratamente il tessuto 1 medium neurone mL. </li><li> Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio e piastra 35.000 cellule in 500 microlitri di media neurone per un singolo pozzo di un 24-ben piastra (il piatto di cui al 3.2). NOTA: Facoltativamente, un&#39;aliquota cella può essere contrastate con trypan blu per valutare la vitalità della preparazione cellulare. Controllare la densità di placcatura da Visual ispezionareionico usando il microscopio (tipicamente 90 - 110 cellule per campo visivo di un obiettivo standard di 10X). </li><li> Inserire neuroni nel incubatore a 37 ° C, 6% v / v CO 2 per 1 h. </li><li> Invia le incubazione, prendere gli inserti preparati (seminato con monostrati confluenti astrociti) fuori dell&#39;incubatore (vedi punto 2.8). Sostituire il supporto aspirando medio astrociti e la sua sostituzione con 500 microlitri di media neurone fresco. NOTA: Gli inserti deve ospitare monostrati astrociti confluenti dopo 2 - 3 DIV (giorni in vitro). </li><li> Posizionare gli inserti con astrociti attenzione nei pozzetti che contengono le culture neuronali (punto 3.13) con pinza sterile. </li><li> Posizionare la risultante indiretta co-coltura di neuroni-astrociti di nuovo nel incubatore a 37 ° C, il 6% v / v di CO 2. NOTA: In queste condizioni, i neuroni possono essere coltivate per 4 settimane mezzo completamente definito. Nessun cambiamento mezzo è necessaria. Per le colture da lungo tempo, si consiglia di riempire epozzi mpty con acqua sterile per ridurre l&#39;evaporazione dal 24 a micropiastre. </li><li> Eseguire in vitro delle cellule analisi dopo periodi di coltura desiderata (ad esempio, per immunocitochimica, PCR, Western Blot, registrazioni elettrofisiologiche (patch clamp o matrice multielettrodico)) 7,15,18. NOTA: Il sistema di coltura è adatto anche per il trattamento farmacologico acuta e cronica delle culture 11. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

L&#39;obiettivo principale del protocollo attuale è quello di colture neuronali e astrociti completamente separati, mentre li mantenendo in mezzo condiviso. Per questo motivo, la purezza delle colture ottenute vanno verificate all&#39;inizio del procedimento. Si consiglia l&#39;uso di tubulina specifica dei neuroni, neurofilamenti o proteine ​​NeuN come marcatori neuronali, GFAP come marcatore astrociti, O4 antigene come marcatore degli oligodendrociti precursore e proteine ​​Iba1 per identificare microglia. </...

Nel corso degli ultimi decenni, l&#39;interpretazione generale della funzione nevroglia si è evoluta da l&#39;attribuzione di un solo supporto verso un ruolo regolatore attivo per quanto riguarda la funzione neuronale 1. A causa del loro impatto di rilievo sulla omeostasi del cervello in salute e malattia 2, astrociti sono di particolare interesse per la comunità scientifica. Negli ultimi anni, una diversità di studi si sono concentrati sulle interazioni neuroni-glia in vivo e in vitro 3. Tuttavia, la maggior parte dei sistemi di coltura non consentono per l&#39;analisi separata delle due tipi cellulari e dei rispettivi secretomes. Diversi approcci sfruttano la co-coltivazione diretta dei neuroni e glia per raggiungere la sopravvivenza di lunga durata e fisiologicamente rilevanti di sviluppo della rete neuronale 4-6. Il presente protocollo raggiunge gli stessi obiettivi, mantenendo entrambi i tipi di cellule separate fisicamente 7. Rispetto al conditioned media si avvicina a 8,9, il nostro sistema permette di studiare la comunicazione bidirezionale tra neuroni e astrociti. L&#39;espressione di molecole di segnalazione secrete può essere monitorato mentre le cellule maturare nel mezzo condiviso. Questa opportunità è particolarmente rilevante, come astrociti rilasciano fattori solubili, come le citochine, fattori di crescita e molecole della matrice extracellulare 10,11, regolando così la crescita neuronale e funzionano 7,12. Pertanto, è stato dimostrato che l&#39;aggiunta di trombospondina alle cellule gangliari retiniche in vitro induce la formazione di sinapsi 13. Tuttavia, sono necessari per rendere sinapsi funzionali 13 altri fattori ancora sconosciuti. Inoltre, molecole rilasciate dagli astrociti devono essere identificati al fine di comprendere la base delle interazioni neuroni-glia. La coltivazione di neuroni primari e astrociti di topo e ratto è stato descritto in precedenza 14-16. Qui noipresentare uno strumento elegante e versatile per combinare entrambi i tipi cellulari in un approccio co-coltura indiretta. Poiché le due culture sono fisicamente separati ancora condividere lo stesso mezzo, l&#39;impatto di neuroni, astrociti e molecole solubili, possono essere analizzate separatamente, creando così un potente strumento per studi di interazione neuroni-glia.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cell-culture-grade water</td><td>MilliQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytosine-&amp;#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>CAUTION: H317, H361</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)&amp;nbsp;</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>CAUTION: H317-334</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Serva</td><td>22700</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Biochrom AG</td><td>S9135</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2529</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7641</td><td>CAUTION: H334</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>self-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well-plates</td><td>Thermoscientific/Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>24-wells-plate (for the&amp;nbsp; indirect co-culture)</td><td>BD Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Binocular</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Cell-culture inserts</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Heraeus</td><td>Multifuge 3S-R</td><td></td></tr><tr><td>Counting Chamber</td><td>Marienfeld</td><td>650010</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST Dumont (#5)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>glass cover slips (12&amp;nbsp;mm)</td><td>Carl Roth (Menzel- Gl&amp;auml;ser)</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 240i</td><td></td></tr><tr><td>Micro-tube (2 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>Millex Syringe-driven filter unit</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>833,902</td><td></td></tr><tr><td>pipette (1 mL)</td><td>Gilson</td><td>Pipetman 1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile work bench</td><td>The Baker Company</td><td>Laminar Flow SterilGARD III</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>FST Dumont</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Henry Schein</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Sarstedt</td><td>833,911,002</td><td></td></tr><tr><td>tube (15 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>64,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>Water bath type 1004</td><td></td></tr></tbody></table>

the indirect neuron-astrocyte coculture assay: an in vitro set-up for the detailed investigation of neuron-glia interactions

Corretto sviluppo e la funzione neuronale è il presupposto di sviluppo e il cervello adulto. Tuttavia, i meccanismi alla base della formazione altamente controllato e manutenzione di reti neuronali complesse sono state comprese finora. Le questioni aperte in materia di neuroni nella salute e nella malattia sono diversi e si estende da comprendere lo sviluppo di base per indagare le patologie legate umani, per esempio, il morbo di Alzheimer e la schizofrenia. L&#39;analisi più dettagliata dei neuroni può essere eseguita in vitro. Tuttavia, i neuroni sono esigenti cellule e hanno bisogno del sostegno supplementare degli astrociti per la loro sopravvivenza a lungo termine. Questa eterogeneità cellulare è in conflitto con l&#39;obiettivo di analizzare l&#39;analisi di neuroni e astrociti. Presentiamo qui un test di coltura cellulare che consente la co-coltivazione a lungo termine di neuroni primari puri e astrociti, che condividono lo stesso mezzo chimicamente definito, pur essendo fisicamenteseparato. In questa configurazione, le culture sopravvivono per un massimo di quattro settimane e il test è adatto per una varietà di indagini riguardanti l&#39;interazione neuroni-glia.

L&#39;analisi delle colture neuronali tramite il sistema di co-coltura indiretta è multiforme e può essere eseguita in diverse fasi della cultura stagionatura. A causa del fatto che le cellule possono essere mantenute fino a 4 settimane, indagini a lungo termine delle culture sono possibili. Lo schema del pannello centrale sinistro della figura 1 mostra la configurazione co-coltivazione. Con l&#39;uso di que...

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The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Questo protocollo descrive l&#39;indiretta co-coltura di neuroni-astrociti per l&#39;analisi compartimenti stagni delle interazioni neuroni-glia.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

14.6K Views.  Ruhr-University.  Questo protocollo descrive l'indiretta co-coltura di neuroni-astrociti per l'analisi compartimenti stagni delle interazioni neuroni-glia. 

Video: The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

Studio gliali eterogeneità Influenza sulla crescita cellulare Axon Utilizzando un nuovo metodo co-coltura

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

Ricerca

Neuroscienze

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biologia

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Biologia dello sviluppo

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

 Protocollo di co-coltura primaria di microglia e neuroni per studi di interazione con il SNC

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

Autore in primo piano: Modello di co-coltura in vitro per lo studio delle interazioni microglia-neuroni in condizioni di malattia

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

An Indirect Neuron-Astrocyte Co-Culture Technique for Studying Neuron-Glia Interactions

Source: Gottschling, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54757">The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video illustrates a method for establishing an indirect neuron-astrocyte co-culture using a compartmentalized approach. In this setup, neurons and astrocytes are spatially separated but share a conditioned medium. Neurotrophic factors released by astrocytes promote neuron differentiation and the formation of synaptic connections, suggesting neuron-glia interactions.

Una tecnica di co-coltura indiretta neurone-astrocita per lo studio delle interazioni neurone-glia

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Studio gliali eterogeneità Influenza sulla crescita cellulare Axon Utilizzando un nuovo metodo co-coltura

Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l'analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Una tecnica di co-coltura indiretta neurone-astrocita per lo studio delle interazioni neurone-glia