The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

マウスを用いた実験では、畜産の神経科学のガイドラインについては、ドイツの法律とドイツ社会に従いました。ルール大学ボーフムの動物の世話と利用委員会が適切な許可を付与しています。 1.準備と皮質アストロサイトの栽培注：ニューロンが用意されている前に、星状細胞培養物がコンフルエントな単層に策定すべきであるとして、次のステップに進む前に、プロトコル、少なくとも7日間のこれらのステップを完了して下さい。初代星状細胞は、生後日（P）0-3の周りの仔マウスから得られた混合グリア培養物から誘導されます。 T75フラスコあたり3頭（6皮質）が使用されます。 <ol><li>無菌条件下で10％v / vのウマ血清および0.1％（v / v）のゲンタマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補完することにより、星状細胞培地を準備します。 2週間まで4℃でメディアを保管してください。 </li><li>コート3倍T75フラスコののwi6％（v / v）のCO 2の存在下、37℃で少なくとも1時間;（細胞培養グレードの水中でPDL）を10μg/ mLのポリ-D-リジン番目。コーティング後、結合していない陽イオンを除去し、9 mLの星状細胞培地を追加するためにリン酸緩衝食塩水（PBS）で2回フラスコを洗浄します。 </li><li>脳の調製のために、（関係なく使用される脳の数の）15 mLチューブを1Xに10センチメートルペトリ皿と1 mLのHBSSを1Xに10 mLのハンクス平衡塩溶液（HBSS）を追加します。手術用はさみ、2細かい鉗子と手続きのための手の届くところに双眼鏡のペアを保管してください。 </li><li>手術用ハサミで素早く3仔を刎ねると、空の10cmの皿に頭を収集します。 <ol><li>両眼の下の皮質の準備を行います。 2微細な鉗子を使用して、目のレベルに向かって首アップから始まる、正中線で頭蓋骨から背部皮膚を削除します。その後、その血管と脳は、頭蓋骨の下に表示されます。 </li><li>ピンセットで吻側端に頭を修正し、頭蓋骨の正中線を切開、後端から始まります。その後、脳を公開する権利と頭蓋骨の左半分をオフにクリップ。 </li><li>鉗子の先端を閉じて、脳の下に腹側にそれを配置します。頭蓋骨から脳を持ち上げ、HBSSに満ちた10センチメートルペトリ皿にそれを転送します。すべての脳を皿に収集されるまで、残りの検体と同じように進んでください。 </li></ol></li><li>脳を収集した後、ハサミのような鉗子のペアを使用して後脳からつまんで皮質の分離で始まります。鉗子の1組と2つの半球間の正中切開を行います。慎重に鉗子で脳を固定し、中脳皮質の半分で終わるために第2の鉗子を使用して、嗅球を遮断します。 </li><li>鉗子の1ペアで1皮質の半分を修正して、fは、それらを取り外すことにより半球から髄膜を剥離横方向のエッジをROM、その後、第二の鉗子を使用して、皮質表面からそれらを引きます。 </li><li>皿に向かって下方に向き、その表面に皮質の半分を反転。慎重に鉗子の一組を使用して、三日月状海馬を解剖し、削除します。個々の皮質を運ぶために1つの閉じた鉗子を使用して円錐形の15 mLチューブに単一の皮質を転送します。 </li><li>すべての皮質を収集した後、無菌層流フードへのトランジットと皮質組織の解離のための準備を始めます。 </li><li> 2 mLの反応管に1mLのDMEMを加えるとvのパパイン（30単位）/ wの0.1％を追加します。清澄溶液を（約3分）を発症するまで37℃の水浴中で懸濁液をインキュベートします。 0.24ミリグラム/ mLのL-システインおよび20μg/ mLのDNA分解酵素を加え、穏やかに振ります。 注：消化のために、酵素溶液約1ミリリットルが必要です。 </li><li>加える前に1 mLの滅菌溶液を得るために、フィルタ（0.22μmの孔径）それ皮質組織へ。 （水浴において、すなわち 、）、37℃で1時間- 30分間チューブをインキュベートします。 注：1.11ステップ - 1.14は重要であり、15分以内に完了する必要があります。 </li><li>消化反応を終了するには、1 mLのアストロサイト培地を追加し、慎重に1 mLのピペットを用いて消化された組織を粉砕します。トリチュレーションのために、優しく、それによって吸引し、皮質組織懸濁液を押し出し、ピペットプランジャーを移動します。 </li><li>組織を単細胞懸濁液に解離された後、216×gで5分間、5mLの星状細胞培地と遠心分離機を加えます。 </li><li>得られたペレットから慎重に上清を吸引除去し、1 mLのアストロサイト培地中で細胞を再懸濁。 </li><li> 9 mLのアストロサイト培地（1.2を参照）を補充T75フラスコに細胞懸濁液を追加します。 </li><li> 6％v / vのCO 2の存在下でのインキュベーター中37℃で細胞をインキュベートします。 4日後、（最初の完全な培地交換を行います10mL）で。 3日 - その後、培養液ごとに2を変更します。 </li><li>細胞がコンフルエントな単層を形成した場合は7日後、確認してください。文化の完全な合流が達成されるまで3日 - いない場合は、別の2を待ちます。 注：アストロサイトが大きい扁平な細胞体を表示するには、フラスコの底に局在し、顕著な細胞プロセスを開発することはありません。彼らは、単層17の上に常駐する小さな位相コントラスト明るい前駆細胞およびミクログリアは異なります。 </li><li>前駆細胞を取り除くと、純粋なアストロサイトの文化を取得し、オービタルシェーカー上でT75フラスコを置き、250rpmで培養O / Nを振るするために。温度を37℃に調整し、フラスコのフィルタは、CO 2の蒸発を防止するために、実験用フィルムで密封されていることをされていることを確認してください。 </li><li> eliminaに20μMのシトシン-1-β-D-アラビノフラノシド（AraCの）を補充翌日、培地を吸引し、10 mLを加え、新鮮な培地TE残留分割細胞。 注：2のためのAraCとのインキュベーション- 37℃のインキュベーターで3 dは、6％CO 2は、純粋なアストロサイトの文化になります。 </li><li>光学顕微鏡下での目視検査により星状細胞培養物の純度を監視します。残留位相コントラスト明るい前駆細胞およびミクログリアはまだアストロサイト単分子層17の上に存在する場合、繰り返しは1.18と1.19ステップ（ステップ1.16参照）。 注：コンフルエントと純粋な星状細胞単層は、次のステップに進む前に、インキュベーター内で最大14日（37℃、6％v / vのCO 2）で維持することができます。培地の半分を3日毎に変更してください。これらの細胞は格納手順を介して自分の神経細胞の支持特性を失うことになるとして、アストロサイトを、収集凍結と解凍しないでください。 </li></ol>間接共培養のためのアストロサイトの準備2 注：48から72時間をセルにニューロン、転送アストロサイトを準備する前にリットル培養インサート。一般的に、単一のT75フラスコは、1つの製剤を用いて得られた神経細胞培養をサポートするために十分な数の細胞を提供します。 <ol><li> 24ウェルプレートに必要な数のインサートを配置します。被膜37℃で約1時間の10μg/ mLのPDL（細胞培養グレードの水に溶解）とそれぞれのインサート6％（v / v）のCO 2。インキュベーション後、PBSで2回インサートを洗います。一方で、アストロサイトの準備を進めます。 注：アストロサイトの細胞懸濁液が使用可能になるまでPBSで満たされたインサートを保持することができます。 </li><li> （AraCを持つ）アストロサイト培地を吸引し、任意の残留血清が削除されていることを確認するために10 mLのPBSと文化1時間を洗います。 </li><li>フラスコに0.05％トリプシンEDTA（エチレンジアミン四酢酸）の3 mLを加え、約10分間、37℃、6％v / vのCO 2でのトリプシン処理のために細胞をインキュベートします。 </li><li>顕微鏡とfacilitaを使用して目視検査によって細胞の剥離を制御しますデスクトップに対するフラスコの側面をタップすることで細胞の剥離をTE。 注：2.5ステップ - 2.8が重要であり、15以内に終了する必要があります - 20分。 </li><li>トリプシン処理の後、穏やか7 mLの星状細胞培地中で再懸濁細胞を、15 mLの試験管に細胞懸濁液を移します。 216×gで5分間遠心分離します。 </li><li>注意深く上清を吸引し、1 mLのアストロサイト培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>計数チャンバーを用いて細胞を数えます。 </li><li> 500μLのアストロサイト培地で24ウェルプレートのウェルの底を記入し、各個々のインサートに500μLのアストロサイト培地中で25,000細胞を移します。 37°C、6％v / vのCO 2で培養物をインキュベートします。 注：42後 - 72時間培養物が約100％コンフルエンスに到達します。この段階で、培養物の純度は11免疫細胞化学によって確認することができます。コンフルエントな培養物に進むまでに7日間維持することができます次のステップ。培地の半分を3日毎に変更してください。 </li></ol>初代海馬ニューロンの調製注：プライマリマウスの海馬ニューロンはE15.5から導出されるべきである - 時限妊娠マウスのE16胚。 <ol><li> 0.6％とニューロン培地（10mMのピルビン酸ナトリウムとのMEM、0.1％W / Vオボアルブミン、2％（v / v）のB27培地補充物、0.1％（v / v）のゲンタマイシン（滅菌を濾過））、および調製培地（HBSSを準備/ワットVグルコースおよび10mMのHEPES（4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸））。前暖かく、37°C​​、6％（v / v）のCO 2でのフィルタフラスコ内で前平衡化ニューロン媒体。 </li><li> （細胞培養インサートで使用するための切り欠きされている特殊なカバースリップを使用）を24ウェルプレートのウェルにガラスカバースリップ（直径12mm）を配置します。 <ol><li> 37℃の水（細胞培養グレード）中の15μgの/ mLのポリDL-オルニチンを有する少なくとも1時間コート。ことを確実にするために、ウェルあたり少なくとも500μLを使用しますカバーガラスを完全に覆われています。 PBSでウェルを2回洗浄します。細胞をプレーティングするまでウェル中にPBSを残します。井戸が乾燥していないことを確認してください。 </li></ol></li><li>海馬を分析するには、準備媒体で満たされた3×10cmの皿と1 mLの準備培地で1×2 mLチューブを準備します。はさみと2細かい鉗子を準備します。 </li><li>頸椎脱臼により妊娠中のマウスを生け贄に捧げる、70％v / vエタノールで洗浄することにより腹部を殺菌し、鋭いハサミを使用して腹部を開きます。はさみで慎重にビーズの子宮を切除し、準備媒体で満たされた1×10cmの皿に臓器を移します。 </li><li>次に、子宮から胚を削除します。慎重に子宮を切開し、2鉗子を使用して胚を損なうことなく羊膜を除去します。その後、ハサミで各胚を刎ねると準備媒体が供給される第2の10cmの皿に頭を移します。 </li><li> preparに類似（ヘッドの準備に進みます1.7） - ationが1.4で説明しました。 <ol><li>ピンセットで頭を固定化し、中枢神経軸に垂直な後脳に近いネック領域に頭蓋骨と皮膚を切開。頭蓋骨と皮膚をカバー両方を持ち上げ、それによって脳を露出させ、頭の吻側端に向かって柔らかいスカルキャップを曲げるために鉗子の第二の対を使用してください。 </li><li> 2鉗子の助けを借りて、頭蓋腔から脳を切り離します。この鉗子の、1に近いペアを行うと、嗅球から始まり、後脳に向かって移動する頭蓋骨から脳を分離します。準備媒体で満たされた別の10cmの皿に脳を収集します。 </li></ol></li><li>アストロサイトの準備（ステップ1.6）のために上記のように皮質部分から海馬を解剖。各半球から海馬を取り出して、準備媒体で満たされた2 mLのチューブにそれらを収集。 </li><li>解剖を完了した後、無菌層流ベンチとdigesにチューブを移しますパパインを含む1mLの消化液と海馬組織をtは。 1.10、代わりにDMEMをMEMを使用する - ステップ1.9で説明したように消化溶液を準備します。 注：3.9ステップ - 3.12は重要であり、10以内に完了しなければならない - 15分。 </li><li>消化が完了した後、慎重にピペットで穏やかな吸引により消化溶液を引き出します。 </li><li>順次追加した後、慎重に洗浄サイクル当たり1 mLの新鮮な培養培地を吸引することによって、海馬をニューロン培地で3回洗浄します。細胞懸濁液を遠心しないでください。 </li><li>最後の洗浄工程の後、慎重に1mLのニューロン培地中で組織を粉砕します。 </li><li>計数チャンバーを用いて細胞をカウントし、24ウェルプレート（3.2で述べたプレート）の1ウェルあたり500μLニューロン培地中の35,000細胞をプレー。 注：必要に応じて、細胞のアリコートを細胞調製物の活力を評価するために、トリパンブルーで対比することができます。視覚的検査により、めっき密度を制御顕微鏡を用いたイオン（典型的には90 - 標準の10倍の対物レンズの視野あたり110細胞）。 </li><li> 37°C、1時間の6％v / vのCO 2のインキュベーターに入れニューロン。 </li><li> 、インキュベーションを投稿準備インサートを取るインキュベータのうち（コンフルエント星状細胞単層を播種）（ステップ2.8を参照してください）。アストロサイトの培地を吸引し、500μlの新鮮なニューロン培地に置き換えることにより、メディアを交換します。 注： - 3 DIV（in vitroでの日数）インサートは2の後、コンフルエント星状細胞単層を保有する必要があります。 </li><li>慎重に滅菌ピンセットを用いて、神経細胞培養（ステップ3.13）を含有するウェルにアストロサイトに挿入を置きます。 </li><li>バック、37℃、6％v / vのCO 2インキュベーター中に生じた間接的なニューロン、星状細胞共培養を置きます。 注：これらの条件下で、ニューロンが完全に定義された培地中で最大4週間培養することができます。いいえ培地交換は必要ありません。長期培養のためには、電子メールを記入することをお勧めします24ウェルプレートからの蒸発を低減するために、滅菌水でmpty井戸。 </li><li>実行in vitro細胞解析後の培養期間を希望する（ 例えば、免疫細胞化学、PCR、ウエスタンブロット、電気生理学的記録（パッチクランプまたは多電極アレイ）のための）7,15,18。 注：培養系はまた、培養物11の急性および慢性の薬理学的治療に適しています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Volterra, A., Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes,+from+brain+glue+to+communication+elements:+the+revolution+continues.">Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).</li><li>Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic-neuronal+crosstalk:+implications+for+neuroprotection+from+brain+injury.">Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury.</a> Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).</li><li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+signaling+between+astrocytes+and+neurons.">Dynamic signaling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li><li>Dityatev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+formation+and+functions+of+chondroitin+sulfate-rich+extracellular+matrix+of+perineuronal+nets.">Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets.</a> Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).</li><li>Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+developmental+neurotoxicity:+use+of+microelectrode+arrays+to+measure+functional+changes+in+neuronal+network+ontogeny.">In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny.</a> Front Neuroeng. 4, 1 (2011).</li><li>Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+Oscillatory+Activity+in+Immature+Cortical+Network+Is+Driven+by+GABAergic+Preplate+Neurons.">Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons.</a> J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).</li><li>Geissler, M., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+indirect+co-culture+set+up+of+mouse+hippocampal+neurons+and+cortical+astrocytes+on+microelectrode+arrays.">A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays.</a> J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).</li><li>Yu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+and+astroglial+TGFbeta-Smad3+signaling+pathways+differentially+regulate+dendrite+growth+and+synaptogenesis.">Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis.</a> Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).</li><li>Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+reactive+astrogliosis+and+its+effect+on+neuronal+growth.">An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth.</a> Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).</li><li>Kucukdereli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+excitatory+CNS+synaptogenesis+by+astrocyte-secreted+proteins+Hevin+and+SPARC.">Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC.</a> PNAS. 108, E440-E449 (2011).</li><li>Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+are+crucial+for+survival+and+maturation+of+embryonic+hippocampal+neurons+in+a+neuron-glia+cell-insert+coculture+assay.">Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay.</a> Synapse. 65, 41-53 (2011).</li><li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+synaptic+transmission:+astrocytes+rule!.">Basal synaptic transmission: astrocytes rule!.</a> Cell. 146, 675-677 (2011).</li><li>Christopherson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+hippocampal+neurons,+which+lack+four+crucial+extracellular+matrix+molecules,+display+abnormalities+of+synaptic+structure+and+function+and+severe+deficits+in+perineuronal+net+formation.">Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation.</a> J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).</li><li>Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-Glia+Interactions+in+Neural+Plasticity:+Contributions+of+Neural+Extracellular+Matrix+and+Perineuronal+Nets.">Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets.</a> Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li><li>Pyka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+astrocyte-dependent+synaptogenesis+and+modulate+synaptic+activity+in+primary+embryonic+hippocampal+neurons.">Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons.</a> Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).</li><li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+astrocyte-secreted+matricellular+proteins+in+central+nervous+system+development+and+function.">The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function.</a> J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).</li><li>Ethell, I. M., Ethell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+in+brain+development+and+remodeling:+synaptic+functions+and+targets.">Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets.</a> J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).</li><li>Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A., Dityatev, A. l. e. x. a. n. d. e. r., Wehrle-Haller, B. e. r. n. h. a. r. d., Asla, P. i. t. k. &. #. 2. 2. 8. ;. n. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prog Brain Res. 214, 3-28 (2014).</li><li>Dityatev, A., Rusakov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+plasticity+at+the+tetrapartite+synapse.">Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse.</a> Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).</li><li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+synapses:+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse.">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse.</a> JoVe. , (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

共有媒体でそれらを維持しながら、現在のプロトコルの主な目標は、完全に独立した神経細胞とアストロサイトの培養物です。このため、得られた培養物の純度は、手順の開始時に確認されるべきです。私たちは、オリゴデンドロサイト前駆マーカーおよびミクログリアを識別するためにIBA1タンパク質としてO4抗原、アストロサイトのマーカーとしてGFAP、神経細胞のマーカーとして、ニュー...

過去数十年間を通して、神経膠細胞機能の一般的な解釈は、神経機能1についての積極的な規制の役割に向かって単に支持するの帰属から進化してきました。そのため、健康と病気2における脳の恒常性に対するその顕著な影響のため、アストロサイトは、科学界のために特別な関心があります。過去数年間において、研究の多様性は、in vivoおよびin vitro 3ニューロン-グリア相互作用に焦点を当てています。しかし、培養系のほとんどは、両方の細胞型のとそれぞれのsecretomesの独立した分析を可能にするものではありません。 いくつかのアプローチは、長期的な生存および生理学的に関連する神経回路網の開発4-6を達成するために、ニューロンとグリアの直接共存培養を利用します。物理的に分離された7両方の細胞型を維持しながら、本プロトコルは、同じ目標に到達します。 conditioneに比べてD媒体は、我々のシステムは、ニューロンとアストロサイト間の双方向通信を勉強することができ、8,9近づきます。細胞は、共有媒体に成熟さながら分泌シグナル伝達分子の発現をモニターすることができます。アストロサイトは、それによってニューロンの成長を調節する、例えば、サイトカイン、成長因子および細胞外マトリックス分子10,11として可溶性因子を放出し、7,12機能として、この機会は、特に関連性があります。したがって、 インビトロでの網膜神経節細胞のトロンボスポンジンの添加は、シナプス13の形成を誘導することが実証されています。しかし、他の未知の要因が13、機能的シナプスをレンダリングするために必要です。また、星状細胞により放出された分子は、ニューロン - グリア相互作用の基礎を理解するために識別されなければなりません。 マウスおよびラットからの一次ニューロンとアストロサイトの栽培は、以前に14から16に記載されています。ここで間接共培養法で両方の細胞型を結合するエレガントで汎用性の高いツールを提示します。二つの文化は、物理的に同じ媒体を共有まだ分離されているため、ニューロン、星状細胞および可溶性分子の影響は、別々に、したがって神経グリア相互作用研究のための強力なツールを作成し、分析することができます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cell-culture-grade water</td><td>MilliQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytosine-&amp;#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>CAUTION: H317, H361</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)&amp;nbsp;</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>CAUTION: H317-334</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Serva</td><td>22700</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Biochrom AG</td><td>S9135</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2529</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7641</td><td>CAUTION: H334</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>self-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well-plates</td><td>Thermoscientific/Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>24-wells-plate (for the&amp;nbsp; indirect co-culture)</td><td>BD Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Binocular</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Cell-culture inserts</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Heraeus</td><td>Multifuge 3S-R</td><td></td></tr><tr><td>Counting Chamber</td><td>Marienfeld</td><td>650010</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST Dumont (#5)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>glass cover slips (12&amp;nbsp;mm)</td><td>Carl Roth (Menzel- Gl&amp;auml;ser)</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 240i</td><td></td></tr><tr><td>Micro-tube (2 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>Millex Syringe-driven filter unit</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>833,902</td><td></td></tr><tr><td>pipette (1 mL)</td><td>Gilson</td><td>Pipetman 1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile work bench</td><td>The Baker Company</td><td>Laminar Flow SterilGARD III</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>FST Dumont</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Henry Schein</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Sarstedt</td><td>833,911,002</td><td></td></tr><tr><td>tube (15 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>64,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>Water bath type 1004</td><td></td></tr></tbody></table>

the indirect neuron-astrocyte coculture assay: an in vitro set-up for the detailed investigation of neuron-glia interactions

適切な神経細胞の発達と機能の開発と成人の脳の前提条件です。しかし、複雑な神経回路網の高度に制御形成と維持のメカニズムは完全にこれまで理解されていません。健康と病気のニューロンに関する未解決の問題は、人間の関連する病状、 例えば、アルツハイマー病や統合失調症を調査する基本的な開発を理解することから、多様で到達しています。ニューロンのほとんどの詳細な分析は、 インビトロで行うことができます。しかし、神経細胞は、細胞を要求し、その長期生存のためのアストロサイトの追加支援を必要としています。この細胞異質は、ニューロンとアストロサイトの分析を分析することを目的と矛盾しています。物理的でありながら、私たちは、ここで同じ化学的に規定された培地を共有する純粋な一次ニューロンとアストロサイトの長期的な共存培養を可能にする細胞培養アッセイを提示します分離しました。この設定では、培養物は、4週間まで生存し、アッセイは、ニューロン - グリア相互作用に関する研究の多様性に適しています。

間接的共培養システムを介して神経細胞培養物の分析は、多種多様であり、培養成熟の異なる段階で行うことができます。細胞は、最大4週間維持することができるという事実のために、培養物の長期的な研究が可能です。 図1の中央の左側のパネルで概略的には、共存培養のセットアップを示しています。星...

Watch this Scientific Journal Video about The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions at JoVE.com

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

このプロトコルは、ニューロン - グリア相互作用の区画化分析のための間接的なニューロン、星状細胞共培養を説明します。

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：<em&gt;インビトロ</em&gt;ニューロングリアの相互作用の詳細な調査のためのセットアップ

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

the-indirect-neuron-astrocyte-coculture-assay-an-vitro-set-up-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

14.6K ビュー.  Ruhr-University. このプロトコルは、ニューロン - グリア相互作用の区画化分析のための間接的なニューロン、星状細胞共培養を説明します。 

ビデオ: The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

新しい共培養法を用いた軸索の成長に関する研究グリア細胞の不均一性の影響

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

神経科学

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

初代ラット皮質ニューロンとグリアのBilaminarの共培養

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

生物学

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

発生生物学

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

 CNS相互作用研究のための一次ミクログリアとニューロン共培養プロトコール

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

著者スポットライト:疾患状態におけるミクログリアとニューロンの相互作用を研究するためのin vitro共培養モデル

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

An Indirect Neuron-Astrocyte Co-Culture Technique for Studying Neuron-Glia Interactions

Source: Gottschling, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54757">The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video illustrates a method for establishing an indirect neuron-astrocyte co-culture using a compartmentalized approach. In this setup, neurons and astrocytes are spatially separated but share a conditioned medium. Neurotrophic factors released by astrocytes promote neuron differentiation and the formation of synaptic connections, suggesting neuron-glia interactions.

ニューロン-グリア相互作用を研究するための間接ニューロン-アストロサイト共培養技術

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：

要約

さらに動画を探す

この動画の章

新しい共培養法を用いた軸索の成長に関する研究グリア細胞の不均一性の影響

初代ラット皮質ニューロンとグリアのBilaminarの共培養

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロサイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

ニューロン-グリア相互作用を研究するための間接ニューロン-アストロサイト共培養技術

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：

要約

さらに動画を探す

この動画の章

新しい共培養法を用いた軸索の成長に関する研究グリア細胞の不均一性の影響

初代ラット皮質ニューロンとグリアのBilaminarの共培養

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

ニューロン-グリア相互作用を研究するための間接ニューロン-アストロサイト共培養技術

ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロサイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング