L'ictus ischemico è una condizione clinica caratterizzata da ipoperfusione del tessuto cerebrale e provoca perdita neuronale. Numerose prove suggeriscono che l'interazione tra glia e cellule orinatoi eserciti gli effetti di pressione dopo un evento ischemico. Al fine di esplorare potenziali meccanismi protettivi, è importante sviluppare modelli che consentano di studiare le interazioni neurone-glia in un ambiente ischemico.
Qui presentiamo un approccio semplice per isolare astrociti e neuroni dalla corteccia embrionale del ratto, e che utilizzando specifici mezzi culturali consente la creazione di colture arricchite di neuroni o astrociti o colture neo-glia ad alta resa e riproducibilità. Per studiare il crosstalk tra astrociti e neuroni, proponiamo un approccio, basato su un sistema di co-coltura, in cui i neuroni coltivati in scivolamenti di copertura siano mantenuti a contatto con un monostrato di astrociti placcati in placche multi-pozzo. Le due culture sono mantenute una parte da piccole sfere di paraffina.
Questo approccio consente la manipolazione indipendente e l'applicazione di un trattamento specifico a ciascun tipo di cellula, che rappresenta un vantaggio in molti studi. Per simulare ciò che accade durante un ictus ischemico, le colture sono sottoposte a un protocollo di privazione di ossigeno e glucosio. Questo protocollo rappresenta uno strumento utile per studiare il ruolo delle interazioni neurone-glia nell'ictus ischemico.
Inizia con l'isolamento della corteccia embrionale del ratto. Gli embrioni sono stati ottenuti da una famiglia di ratti a 15 giorni di gestazione e sono collocati in un tubo falcon sterile contenente PBS. Sempre all'interno del tuorlo gli embrioni di bustina sono collocati all'interno di una piastra di Petri contenente PBS freddo.
Con l'aiuto di forbici e pinzette, il sacco vitellino viene rotto e l'embrione viene rimosso e posto in un'altra piastra di Petri contenente PBS freddo su una confezione di ghiaccio. È necessario fare molta attenzione quando si rompe il sacco del tuorlo per non danneggiare l'embrione. Posizionare l'embrione al microscopio sezionato, fissare delicatamente l'embrione utilizzando un twizzer.
L'incisione iniziale dovrebbe essere parallela alla corteccia. Fai attenzione a non decapitare l'animale. Il cuoio capelluto e vengono accuratamente rimossi per non danneggiare il tessuto cerebrale corticale.
Questa prossima incisione separa la corteccia. Rimuovere i vasi sanguigni presenti nel tessuto. Infine, utilizzando una pipetta, trasferire il tessuto corticale su un tubo Falcon con PBS.
La sospensione a singola cellula si ottiene attraverso la digestione meccanica del tessuto cerebrale corticale utilizzando punte con diametro decrescente. Assicurarsi che il tessuto sia ben omogeneizzato Dopo la digestione, centrifugare il materiale a 400 G per tre minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il sedimento nel mezzo di coltura, precedentemente riscaldato a 37 gradi.
Calcolare il numero totale di cellule presenti nella sospensione utilizzando una camera Neubauer e preparare la diluizione per l'adeguata densità cellulare. Infine, seminare le cellule nel multi-pozzo e incubare a 37 gradi. Per preparare il materiale per il sistema di co-coltura, riscaldare la paraffina in un blocco riscaldante fino a quando non diventa liquido.
Quindi, con l'aiuto di una pipetta Pasteur in vetro stereo preparare piccole sfere sopra gli scivoli di copertura che erano precedentemente posizionati in un multi-pozzo e rivestiti con Poli-D-Lisina. 24 ore prima che le due colture siano portate a contatto, cambiare il mezzo di coltura di neuroni e astrociti per integrarlo NBM con o senza FBS inattivato dal calore. Quando le due colture sono pronte all'uso, trasferire il neurone, seduto nella copertura scivola con sfere di paraffina a pozzi contenenti astrociti usando una pinzetta precedentemente immersa nel 70% di etanolo.
Dopo aver posizionato entrambi i tipi di cellule in contatto, attendere da otto a 12 ore, quindi iniziare i diversi stimoli e procedure. La privazione di ossigeno e glucosio viene eseguita in una coltura con sette giorni di crescita. Rimuovere il mezzo di coltura e lavare le cellule due volte con mezzo HBSS senza integrazione di glucosio.
Assicurarsi che tutto il mezzo contenente glucosio venga lavato. Sigillare la Camera dell'Ipossia e aggiungere la miscela di gas contenente il 95% di azoto e il 5% di anidride carbonica per quattro minuti con un flusso di 20 litri per minuti al fine di sostituire l'ossigeno presente all'interno della camera. Quindi, fermare il flusso e posizionare la Camera dell'Ipossia in un'incubatrice a 37 gradi.
Dopo il periodo di privazione di ossigeno e glucosio, sostituire il mezzo, HBSS senza integrazione di glucosio con il mezzo di coltura appropriato per le restanti procedure e incubare le cellule a 37 gradi. Al fine di caratterizzare il tipo di coltura corticale, abbiamo eseguito l'immunoistochimica nei tre tipi di colture corticali per valutare il numero di cellule che hanno espresso GFPA o MAP2, che sono marcatori ampiamente utilizzati rispettivamente per le cellule astrocitiche e neuronali. Queste analisi hanno rivelato che quando questo protocollo, siamo stati in grado di ottenere una coltura pura arricchita di astrociti con circa il 97% delle cellule che esprimono GFAP.
Per quanto riguarda la coltura arricchita dai neuroni, abbiamo verificato circa il 78% delle cellule che esprimono MAP2. Tuttavia identifichiamo circa il 18% delle cellule negative GFAP e MAP2. Per la coltura corticale neurone-glia, È stato osservato che circa il 49% delle cellule sono positive MAP2.
Il 31% è positivo alla GFAP. E il 20% non è responsabile per GFAP né MAP2. Sette giorni dopo l'istituzione della coltura corticale, la coltura neuronale-glia e la coltura arricchita di neuroni sono state sottoposte a una procedura OGD per 4 e 6 ore.
Dopo questa procedura, le cellule sono state etichettate con MAP2 e quindi il numero di cellule positive MAP2 è stato quantificato utilizzando la microscopia a fluorescenza. Nella coltura neuronale-glia, è stata osservata una diminuzione di circa il 30% nel numero dei neuroni, quando la coltura è stata sottoposta a un periodo OGD di 4 ore. Dopo un periodo OGD di 6 ore, l'estensione della lesione aumenta, raggiungendo circa il 60% della perdita neuronale.
Per quanto riguarda la coltura arricchita di neuroni esposti all'OGD, è stata osservata una diminuzione di circa il 41% e del 64% del numero di cellule MAP2. Inoltre, è stato osservato che nella coltura arricchita di neuroni, c'è stato un leggero aumento dell'estensione della lesione rispetto alla coltura neuronale-glia esposta anche all'OGD durante 4 ore. In conclusione, qui rappresentano un modello in vitro per studiare l'ictus ischemico stabilito in modo semplice, veloce, costoso e riproducibile.
Inoltre, il metodo descritto consente anche di implementare neuroni e culture primarie arricchite di astrociti, ma anche una cultura neuronale-glia. Quindi, fornendo un ottimo modello in vitro per modellare diverse malattie cerebrali con un livello più elevato di complessità, rispetto alle linee cellulari immortalate e alle colture neuronali o gliali pure.
