Gli autori desiderano ringraziare i volontari che hanno contribuito materiale clinico a questo studio. Siamo anche grati al personale presso il Dipartimento di Sanità Pubblica e Medicina Clinica, Divisione di Medicina / Medicina Respiratoria, Ospedale Universitario, Umeå (Norrlands Universitetssjukhus) per la raccolta di tutto il materiale clinico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a AS-S dal Consiglio svedese della ricerca, la Fondazione svedese cuore-polmone, la Fondazione svedese per la ricerca strategica, e il Karolinska Institutet.

NOTA: Questa ricerca è stato approvato dal Etico Review Board regionale in Umeå, Svezia. 1. broncoscopia per il campionamento endobronchiale biopsie di soggetti umani <ol><li> Ottenere il consenso informato da tutti i partecipanti. </li><li> Trattare soggetti con midazolam per via orale (4-8 mg) e glicopirronio per via endovenosa (0,2-04 mg) 30 minuti prima della broncoscopia. Applicare anestesia topica con lidocaina nella laringe e bronchi. Lasciate che il gargarismo soggetto con ~ 3 ml di lidocaina al 4% e si applicano 3 ml alla base della lingua e nella laringe tramite una siringa laringe. Ottimizzare l&#39;anestesia topica con 8-10 dosi di spray lidocaina. Effettuare questa operazione con la seduta soggetto. </li><li> Inserire un video broncoscopio flessibile attraverso la bocca tramite un boccaglio di plastica con il soggetto in posizione supina. Utilizzare uno spray catetere appositamente creati per completare l&#39;anestesia topica della trachea distale e bronchi attraverso il broncoscopio. Qui, usare una dose di circa5-10 ml di lidocaina 2%. </li><li> Prendere 6-9 endobronchiali biopsie della mucosa dalla carena principale e le principali divisioni bronchiali con pinze fenestrate (Figura 1). Dopo la broncoscopia e prima di lasciare l&#39;ospedale, lasciare che il resto soggetto per 2-4 ore e di fornire lui / lei con un pasto leggero. </li></ol> 2. Incorporare biopsie in glicole metacrilato (GMA) Resina NOTA: Il protocollo immunostaining GMA è stato originariamente sviluppato presso l&#39;Università di Southampton, Istochimica Unità di Ricerca 17. <ol><li> Fissazione: Per l&#39;immunoistochimica, rimuovere le biopsie delle pinze e metterli direttamente in fiale di vetro contenenti 3 ml di inibitori di acetone e proteasi disidratati ghiacciate (phenylmethylsulfonyl fluoruro (35 mg / 100 ml di acetone) e iodoacetamide (370 mg / 100 ml di acetone )). Fissare il tessuto durante la notte a -20 ° C (figura 2). NOTA: Le seguenti operazioni devono essere Perfoconfermate in una cappa aspirante con opportuni guanti di nitrile. Il kit embedding contiene componenti che possono causare reazioni di sensibilizzazione, irritazione, e / o cutanee allergiche. Tutti i rifiuti devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi. </li><li> Disidratazione: Rimuovere l&#39;acetone con gli inibitori e sostituire con acetone fresco disidratato (senza inibitori) per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovere l&#39;acetone e sostituirlo con benzoato di metile per 15 min. </li><li> Infiltrazione: Preparare una soluzione di elaborazione di 5% soluzione di metil benzoato di glicole metacrilato monomero; 10 ml è sufficiente per un flaconcino. Usando una pipetta Pasteur plastica, aspirazione Eliminare la soluzione metil benzoato e sostituirlo con 3 ml di soluzione di elaborazione. Incubare le biopsie e soluzione di elaborazione eccesso a 4 ° C per 2 ore; pipette Pasteur possono essere usati per tutte le successive modifiche soluzioni, tra cui incorporamento soluzione. </li><li> Sostituire la soluzione di elaborazione ogni 2 ore (3x 2 incubazione hr), quindi il tempo di infiltrazione totale del biopsies nella soluzione di elaborazione è di almeno 6 ore. Inserire etichette di carta nella parte alta delle capsule embedding per identificare le biopsie. </li><li> Preparare una soluzione incorporamento di perossido di benzoile 75 mg in 10 ml di glicol metacrilato monomero. Aggiungere 0,25 ml di N, N poli -dimethylaniline (ossido di etilene) (acceleratore) alla soluzione embedding per iniziare la reazione di polimerizzazione. Rimuovere la soluzione di elaborazione e mettere una biopsia nella capsula embedding rilevanti con pinze. </li><li> Lentamente riempire la capsula embedding verso l&#39;alto con l&#39;incorporamento soluzione e chiudere il tappo. Evitare di disturbare la biopsia e la creazione di grosse bolle d&#39;aria. Incubare le capsule a 4 ° C fino a quando la resina si è completamente polimerizzato. </li><li> Conservare le biopsie incorporati a -20 ° C in una provetta da 50 ml contenente circa 5 g di gel di silice. </li></ol> 3. Sezione del GMA-embedded endobronchiali biopsie <ol><li> Rivestimento vetrino da microscopio: Lavare i vetrini da microscopio in unlavastoviglie su un ciclo normale. Coprire le diapositive e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Preparare una soluzione di rivestimento di 10% di poli-L-lisina soluzione (PLL) in acqua distillata. Immergere i vetrini in soluzione di rivestimento per 5 minuti, e poi lasciarli asciugare all&#39;aria. Conservare diapositive PLL rivestite secco nelle loro scatole originali. </li><li> Lavare le strisce lastra di vetro con il 0,1% di Tween 20 in acqua distillata. Sciacquare il bicchiere con il 70% di etanolo e asciugare con carta assorbente. Tagliare lame di vetro dalla striscia di vetro con un produttore di coltello. Conservare le lame in un contenitore che impedisce il movimento di assicurare che il bordo di taglio non venga danneggiato o scheggiato. </li><li> Biopsia taglio: Posizionare la capsula biopsia in uno splitter capsule e ridurre ogni lato con una lama singola-edge in acciaio al carbonio. Rimuovere la biopsia GMA-embedded e fissarlo saldamente in una morsa. Trim eccesso GMA da tutto il biopsia utilizzando la lama in acciaio. </li><li> GMA sezionamento. <ol><li> Preparare la soluzione di ammoniaca 0,05% con acqua distillata. Posizionare il coltello vetro e la biopsia in the microtomo. Allineare con cura il blocco biopsia con la lama regolando il portalama e l&#39;angolo del blocco biopsia modo che la lama si appoggia piatta contro la superficie del blocco. </li><li> Tagliare 2 micron sezioni spesse utilizzando il microtomo su una velocità di taglio lento e utilizzare pinze per trasferire e galleggiare le sezioni in acqua ammoniaca. Float sezioni per 45-90 secondi, permettendo delicato recupero antigene e dispiegarsi della sezione. </li><li> Pick up sezioni con vetrino da microscopio. Controllare l&#39;istologia biopsia mediante colorazione rapidamente con blu di toluidina. </li><li> Essiccare i vetrini su un insieme piastra calda a 50 ° C e applicare 500 ml di toluidina filtrato blu macchia da una sezione con una pipetta di plastica Pasteur. Scaldare la sezione sulla piastra calda fino a quando un anello verde comincia ad emergere ai margini della macchia, e poi lavare con acqua. </li><li> Utilizzando un microscopio ottico, controllare l&#39;istologia biopsia. Sezioni utilizzati per immunoistochimica dovrebbero contenere buone zone della lamina integrepropria e dell&#39;epitelio, con il minor numero di ghiandole e il meno della muscolatura liscia possibile. </li><li> Come nella sezione 3.4.2, tagliare sezioni che hanno un buon istologia e prenderli con vetrini da microscopio PLL-rivestite per la colorazione immunoistochimica. Tagliare almeno due sezioni da ciascuna biopsia per l&#39;analisi. diapositive asciugare per almeno 1 ora. Dopo l&#39;essiccazione, le sezioni possono essere avvolti in carta stagnola e conservati a -20 ° C per 2 settimane, oppure possono essere immediatamente immunoistochimica. </li></ol></li></ol> 4. la colorazione immunoistochimica di GMA-embedded endobronchiali biopsie NOTA: sodio azide è tossica. Preparare la soluzione di sodio azide 0,1% all&#39;interno di una cappa aspirante e lontano da acidi. A contatto con acidi libera gas tossico. <ol><li> Tracciare intorno sezioni utilizzando una penna a punta di diamante e organizzare le diapositive su una griglia colorazione. </li><li> Eseguire un blocco perossidasi. Preparare una soluzione blocco perossidasi di perossido di idrogeno 0,3% in soluzione di sodio azide 0,1%. Apply 1 ml del blocco perossidasi di sezioni e incubare per 30 min. </li><li> Preparare una soluzione di lavaggio di 0,05 M salina Tris tamponata (TBS), pH 7,6. Lavare i vetrini in TBS, 3x 5 min. </li><li> Preparare una soluzione blocco BSA 1% in DMEM. Fate questo in anticipo e in grandi volumi, aliquotare e congelare fino al momento. Scolate le diapositive e incubare sezioni in soluzione di blocco per 30 minuti per bloccare legame degli anticorpi non specifico. Se legame aspecifico verifica ancora, includere una fase di incubazione 30 min con 5% siero di blocco della stessa specie l&#39;anticorpo secondario. </li><li> Diluire anticorpo primario (CD45 o CD1a) in TBS alla concentrazione desiderata (CD45 diluito 1: 1.000; CD1a diluito a 1: 1,00) e applicarla alle diapositive. Coprioggetti sezioni e incubare una notte a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini in TBS tre volte. Diluire anticorpo secondario biotinilato (diretto contro le specie ospite anticorpi primari, in questo caso di coniglio anti-topo F (ab &#39;2)) in TBS alla concentrazione desiderata (1:300 diluizione) e applicarla alle diapositive. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Preparare una streptavidina biotina-perossidasi almeno 30 minuti prima dell&#39;uso. Assicurarsi che vi sia sufficiente a coprire tutte le diapositive. Lavare i vetrini in TBS tre volte. Applicare la soluzione ai vetrini e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini in TBS tre volte. Preparare 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC) soluzione di substrato perossidasi (fatta secondo le istruzioni del produttore). Applicare alle diapositive e incubare per 20-30 minuti o fino a quando l&#39;intensità colorazione desiderata si sviluppa. </li><li> Sciacquare i vetrini in acqua corrente per il 5 min. Controcolorare sezioni con la soluzione ematossilina di Mayer filtrata per 2 minuti. Lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min. </li><li> Scolate le diapositive e coprire le sezioni con un mezzo di montaggio acquoso permanente. Essiccare i vetrini a 80 ° C in un forno di essiccazione. Lasciare raffreddare i vetrini, e poi montarli con DPX e posto un vetrino. </li></ol> 5. StAnalisi aining <ol><li> Analizzare le sezioni a 40X di ingrandimento utilizzando un microscopio ottico con una telecamera montata collegata a un computer. NOTA: Per l&#39;analisi cellulare, conteggio positivamente macchiato, cellule nucleate all&#39;interno della lamina propria bronchiale e l&#39;epitelio intatto, escluse le aree di muscolo liscio, le ghiandole, grandi vasi sanguigni e il tessuto non corrispondenti o danneggiato. </li><li> Calcolare la media dei conteggi delle cellule e correggere il numero medio di cellule per l&#39;area della lamina propria e la lunghezza dell&#39;epitelio. L&#39;area della lamina propria e la lunghezza dell&#39;epitelio può essere calcolato utilizzando un programma di analisi di immagine. </li></ol> 6. digestione enzimatica di endobronchiali biopsie <ol><li> Biopsie di lavaggio: Utilizzando pinze sterili, posto biopsie intatti in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) (Figura 3). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante a 30 rpm. Trasferire le biopsie a un d steriliish per decantazione il contenuto della provetta 15 ml con HBSS. </li><li> L&#39;interruzione di muco con DTT: Sostituire il HBSS nel tubo con 10 ml di HBSS contenente 5 mM 1,4-ditiotreitolo (DTT). Trasferire le biopsie di nuovo nel tubo da 15 ml con pinza sterile. Incubare per 15 minuti a RT su una piattaforma oscillante a 30 rpm. </li><li> Agitare il tubo dolcemente per 15 sec. Trasferire le biopsie su un piatto sterile per decantazione il contenuto della provetta 15 ml di HBSS e DTT. </li><li> Trasferire le biopsie al mezzo di coltura: sostituire il HBSS e DTT nel tubo con 10 ml di RPMI 1640 medium coltura. Trasferire le biopsie di nuovo nel tubo da 15 ml con pinza sterile. Incubare per 10 minuti a RT su una piattaforma oscillante a 30 rpm. </li><li> Digerire biopsie con collagenasi e DNasi. <ol><li> Preparare una soluzione di digestione di collagenasi II (0,25 mg / ml) e DNase (0,2 mg / ml) in RPMI preriscaldata contenente soluzione 1 M HEPES. Aggiungere 500 ml di soluzione di digestione per bene in un culto del tessuto 48 pozzettipiatto ure. </li><li> Mettere 1 biopsia per pozzetto in soluzione digestione. Incubare la piastra su una piattaforma agitazione per 60 min a 37 ° C a 220 rpm. Pipetta su e giù dopo 30 min di ri-disperdere le biopsie, e dopo 60 min, di disaggregare completamente il tessuto. </li></ol></li><li> Preparazione sospensioni singola cella. <ol><li> Pool insieme biopsie digerito dai pozzetti in una provetta da 50 ml di passare attraverso un filtro cella 40 micron. Raccogliere le cellule rimanenti lavando i pozzetti con tampone FACS ghiacciata (tampone fosfato salino (PBS) contenente 2% di siero fetale bovino). </li><li> Comprimere il tessuto rimanente sul setaccio cellulare utilizzando il retro dello stantuffo di una siringa. Centrifugare le cellule digeriti a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di tampone FACS ghiacciata. Contare le cellule utilizzando un emocitometro manualmente e Trypan blu macchia per valutare la vitalità delle cellule. </li></ol></li></ol><ol><li> Risospendere il pellet cellulare a circa 1 x 10 6 cellule in 200 microlitri di tampone FACS. </li><li> Aggiungere un colorante vitalità cellulare per esclusione cellule morte secondo il protocollo del produttore. </li><li> Aggiungere 5 ml di FcR reagente di blocco e incubare per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere gli anticorpi di superficie cellulare contro CD45 (2 ml), stirpe (CD3, CD20, CD56, CD66abce, e CD14, 2 ml ciascuna), CD16 (0,5 ml), HLA-DR (3 ml), CD11c (5 ml), CD123 (5 ml), CD1c (3 ml), e CD103 (2 mL) e incubare per 15 min a 4 ° C. Dettagli sulla anticorpi possono essere trovati nella sezione Metodi, ma, TITOLARE e ottimizzare gli anticorpi al flusso preciso citometro in uso. Lavare anticorpi in eccesso con PBS per 5 min a 400 x g. Acquisire i campioni freschi su un citofluorimetro o fissare le cellule in 1% paraformaldeide prima Acquisiz tardiionico. </li><li> Identificare dendritiche umane in biopsie polmonari utilizzando un citofluorimetro dosaggio 18 (Figura 4). NOTA: l&#39;utilizzo di un software di analisi di citometria a flusso, le cellule immunitarie si distinguono dalle altre cellule polmonari da gating su CD45. Le cellule morte possono essere escluse come cellule che sono positivi per il colorante Live / Dead. Di tutti CD45 + dal vivo le cellule, le cellule lignaggio (cellule B, le cellule T, le cellule NK, neutrofili e monociti) può essere escluso con un cocktail di anticorpi contro CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14, CD16 e in un canale. Dopo che le cellule, HLA-DR + permetteranno l&#39;identificazione di tutti i DC umane. MDC possono essere distinti da PDC in base alla espressione di CD11c o la mancanza di CD11c, rispettivamente. MDC possono essere ulteriormente suddivise in CD1c + MDC o CD141 +. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo documento descrive come generare una caratterizzazione spaziale e fenotipica dettagliata del polmone DC tessuti residenti negli esseri umani sani utilizzando immunoistochimica e citometria a flusso su biopsie della mucosa endobronchiali raccolti durante la broncoscopia. Nei paragrafi seguenti passaggi critici nel protocollo sono discusse in dettaglio. I passaggi critici con il protocollo Sezionamento e immunoistochimica: E &#39;fondamentale per mantenere i bl...

I polmoni sono in continuo contatto con l&#39;ambiente esterno e sono esposti a entrambe le particelle innocue e microbi con la capacità di causare la malattia. Pertanto, è fondamentale per il sistema immunitario di montare potenti risposte immunitarie contro patogeni, ma è altrettanto importante mantenere la tolleranza agli antigeni inalati che non causano malattie. Per fornire potenti sorveglianza immunitaria, il sistema respiratorio è fiancheggiata da una rete di cellule del sistema immunitario, comprese le cellule dendritiche (DC). DC sono cellule professionali presentanti l&#39;antigene con la capacità unica di attivare le cellule T naive. In polmoni umani, DC residenti incontrano un antigene e poi processo e trasportano ai linfonodi polmonari drenanti per presentazione e l&#39;attivazione delle cellule T 1, 2, 3. Nel sistema immunitario umano, DC può essere suddiviso in più sottoinsiemi, con distinct ma sovrapposte funzioni: CD1c + e CD141 + DC mieloidi (MDC) e CD123 + cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) 4, 5. Mentre la maggior parte conoscenza dettagliata sulle DC umana deriva da studi di sangue, è ormai evidente che i polmoni umani porto anche rare popolazioni di sottoinsiemi DC con cellule T capacità stimolante 6, 7, 8, 9. Tuttavia, i dati accumulati dimostrano che le cellule immunitarie, tra DC, differiscono nella loro frequenza, fenotipo e funzione a seconda della loro posizione anatomica 10. Pertanto, è importante studiare le cellule immunitarie dal tessuto rilevante per comprendere il loro contributo alla immunità locale e tolleranza. Nel loro insieme, questo sottolinea la necessità di studiare DC polmone residente al momento di affrontare le malattie polmonari, nonostante DC sangue che viene più facilmente disponibili e accessibili<html> nell&#39;uomo. I primi studi che hanno indagato DC polmonari residente nell&#39;uomo utilizzassero principalmente morfologia e l&#39;espressione dei singoli marcatori, come HLA-DR e CD11c, in sezioni di tessuto usando immunoistochimica 11, 12, 13. Al contrario, studi più recenti hanno di solito fatto affidamento su analisi di citometria di flusso per studiare diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie. Tuttavia, poiché è difficile trovare un singolo marker superficie cellulare che identifica univocamente uno specifico sottoinsieme DC, il potenziale limitazione di studi applicando citofluorimetria solo quattro colori è il rischio di inclusione popolazioni cellulari con marcatori fenotipici simili come DC. Ad esempio, CD11c è espresso su tutte DC mieloidi e la stragrande maggioranza dei monociti. D&#39;altra parte, negli studi di applicazione di pannelli più avanzati citometria di flusso, tessuto polmonare non-cancerose da resezioni chirurgiche di pazienti sono stati in genere utilizzatoxref &quot;&gt; 10, 14, 15, 16, anche se non è chiaro se queste popolazioni rare sono veramente rappresentativi delle DC presente in soggetti sani. Nel complesso, gli studi sono limitati in gran parte dovuto al fatto che rimosso chirurgicamente o tutto il tessuto polmonare umano è scarso. Per superare alcune di queste limitazioni, questo lavoro descrive come eseguire una dettagliata analisi della distribuzione spaziale e l&#39;identificazione fenotipica delle DC in biopsie endobronchiali mucosa ottenuti da volontari sani che si sottopongono a una broncoscopia. Diversi piccoli biopsie possono essere raccolti da ogni individuo e possono essere successivamente integrati per il sezionamento e l&#39;analisi mediante immunoistochimica o enzimaticamente digerito per analisi avanzata citometria a flusso. Usando tessuto polmonare in forma di biopsie endobronchiali ottenuti broncoscopie conferisce il vantaggio di rendere possibile l&#39;esecuzione della study su volontari sani, a differenza chirurgia aperta dei polmoni che, per ovvi motivi, è limitata a pazienti che necessitano di chirurgia toracica. Inoltre, il tessuto che viene campionata durante una broncoscopia da volontari sani è fisiologicamente normale, in contrasto ad una zona non interessata del tessuto polmonare in pazienti con malattia polmonare. D&#39;altra parte, le biopsie sono piccole e il numero di cellule recuperate, anche quando il pool diverse biopsie, limita il tipo di analisi che possono essere eseguite. Mentre il presente lavoro si concentra sulla DC, i metodi descritti può essere ampliato per includere direttamente altre cellule del sistema immunitario () di interesse che si trovano nel tessuto mucoso polmone umano. Inoltre, i protocolli sono direttamente applicabili ai campioni ottenuti da pazienti affetti da malattie polmonari dove broncoscopia fa parte di stabilire la diagnosi, come la malattia cronica ostruttiva (BPCO), sarcoidosi, o il cancro ai polmoni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1260">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bronchoscopy</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:628px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bronchoscope BF1T160</td>
			<td style="width:172px;">Olympus</td>
			<td style="width:148px;">BF1T160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light source&#160;</td>
			<td style="width:172px;">Olympus</td>
			<td style="width:148px;">Exera CV-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Fenestrated forceps</td>
			<td style="width:172px;">Olympus</td>
			<td style="width:148px;">FB21C</td>
			<td>Used to take biopsies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bite Block</td>
			<td style="width:172px;">Conmed</td>
			<td style="width:148px;">1429</td>
			<td>20x27mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glucose 25%&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>500mL intravenous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Can be used for extra relaxation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lidocaine, 40mg/mL</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Mouth and throat administration / Gargled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lidocaine 100mg/ml spray</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Administered to back of throat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lidocaine 20mg/ml spray</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Administered via bronchoscope to airways</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">GMA processing and embedding</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass vials</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Acetone</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">32201-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Molecular sieves, 4A</td>
			<td style="width:172px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:148px;">88120</td>
			<td>3-4mm diameter pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">P-7626</td>
			<td>0.035g/100ml acetone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">I-6125</td>
			<td>0.37g/100ml acetone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polythene-flat&#160; TAAB embedding capsules</td>
			<td style="width:172px;">TAAB laboratories</td>
			<td style="width:148px;">C094</td>
			<td>x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Capsule holder</td>
			<td style="width:172px;">TAAB laboratories</td>
			<td style="width:148px;">C054</td>
			<td style="width:628px;">Holds 25 8mm capsules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">JB-4 GMA embedding kit</td>
			<td style="width:172px;">Polysciences</td>
			<td style="width:148px;">00226</td>
			<td>Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Methyl benzoate</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">27614-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Silica gel with humidity indicator</td>
			<td style="width:172px;">Scharlau</td>
			<td style="width:148px;">GE0043</td>
			<td>2.5-6mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">GMA sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:172px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:148px;">10143562CEF</td>
			<td>Cut edges, frosted end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Poly-L-Lysine solution</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">P8920-500mL</td>
			<td>1:10 for working solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheet glass strips for ultramicrotomy</td>
			<td>Alkar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td>Wash solution (0.1% Tween20)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">LKB 7800B Knifemaker</td>
			<td>LKB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Capsule splitter</td>
			<td style="width:172px;">TAAB laboratories</td>
			<td style="width:148px;">C065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Carbon steel single edge blades</td>
			<td style="width:172px;">TAAB laboratories</td>
			<td style="width:148px;">B054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vice</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ammonia, 25%</td>
			<td style="width:172px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">1133.1000</td>
			<td>2mL in 1L, 1:500 (0.05%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Microtome</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica RM 2165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light source</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica CLS 150 XE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Microscope with swing arm stand</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica MZ6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">GMA Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Diamond tipped pen</td>
			<td style="width:172px;">Histolab</td>
			<td style="width:148px;">5218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Hydrogen peroxide 30% solution</td>
			<td style="width:172px;">AnalaR Normapur</td>
			<td style="width:148px;">23619.264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-045-2</td>
			<td>Probumin BSA diagnostic grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304002</td>
			<td>Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-human CD1a antibody</td>
			<td>AbD Serotech</td>
			<td>MCA80GA</td>
			<td>Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse monoclonal IgG1 isotype control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse monoclonal IgG2a isotype control</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X094301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectastain ABC Elite standard kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite</td>
			<td style="width:172px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:148px;">SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mayers haematoxylin</td>
			<td style="width:172px;">HistoLab</td>
			<td style="width:148px;">01820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Permanent Aqueous Mounting Medium</td>
			<td style="width:172px;">AbD Serotech</td>
			<td style="width:148px;">BUF058C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Drying oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">DPX permanent mounting solution&#160;</td>
			<td style="width:172px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">360292F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica DMLB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Microscope camera</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica DFC 320</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Analysis software</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica Qwin V3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Enzymatic digestion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>55021C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">DNase</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001&#160;ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Forceps</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Platform rocker</td>
			<td style="width:172px;">Grant instruments</td>
			<td>PMR-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:172px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">40 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:172px;">Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Flow cytometry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>555485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>557757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD20</td>
			<td>BD</td>
			<td>335829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD56</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD66abce</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-101-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HLA-DR</td>
			<td>BD</td>
			<td>555813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD14</td>
			<td>BD</td>
			<td>557831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD16</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD11c</td>
			<td>BD</td>
			<td>560369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD1c</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-098-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD141</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">LSR II Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>Software for analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human lung dendritic cells: spatial distribution and phenotypic identification in endobronchial biopsies using immunohistochemistry and flow cytometry

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Gli studi che caratterizzano le cellule dei tessuti residenti delle vie respiratorie umane del sistema immunitario, tra cui DC, sono limitate, in gran parte dovuto al fatto che rimosso chirurgicamente o tutto il tessuto polmonare umano è scarso. Qui, un metodo meno invasivo per ottenere tessuto polmonare da biopsie endobronchiali (EBB) su volontari sani e protocolli sviluppati per studiare le cellule immunitarie nel tessuto mediante immunoistochimica o citometria a flusso sono delineati...

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Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Cellule umane del polmone dendritiche: distribuzione spaziale e fenotipica di identificazione in endobronchiale biopsie utilizzando l&#39;immunoistochimica e citometria a flusso

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

The main advantage of this technique is that a lot of information can be generated from small tissues obtained during bronchoscopy.This method can help answer key questions in mucosal immunology, where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as COPD, sarcoidosis, or lung cancer.Visual demonstration of this procedure will enable individuals new to this method to recognize when enzymatic digestion is complete.Demonstrating this procedure, along with Faezzah Baharom, will be Greg Rankin, a postdoc from our collaborator's lab at Ume

human-lung-dendritic-cells-spatial-distribution-phenotypic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K Views.  Karolinska Institutet. The main advantage of this technique is that a lot of information can be generated from small tissues obtained during bronchoscopy.This method can help answer key questions in mucosal immunology, where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as COPD, sarcoidosis, or lung cancer.Visual demonstration of this procedure will enable individuals new to this method to recognize when enzymatic digestion is complete.Demonstrating this procedure, along with Faezzah Baharom, will be Gre...

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