Questo protocollo è significativo perché misura quantitativamente la fagocitosi dei fumigatori aspergillus etichettati Conidia dai leucociti umani, insieme all'attaccamento di Conidia alle cellule e alla mancanza di interazione per citometria del flusso. Il vantaggio principale di questo metodo è che facilita l'analisi rapida di un gran numero di cellule. Inoltre, l'etichettatura dei marcatori cellulari consente di separare la valutazione di neutrofili e monociti all'interno dello stesso campione.
In qualsiasi questa tecnica può essere utilizzato per analizzare altri funghi clinici rilevanti come Mucorales. Invece i globuli rossi potrebbero essere usati come fagociti. Per iniziare questa procedura, bagnare un tovagliolo di carta con disinfettante e posizionarlo in un armadietto di sicurezza bio.
Posizionare un piatto di Aspergillus fumigatus coltivato sopra l'assorbente di carta per evitare un'iperdistribuzione della Conidia volatile. Aggiungere 10 millilitri di PBS contenenti lo 0,01% di detersivo sopra il fungo e utilizzare una spatola Drigalski per stendere il liquido sul piatto e strofinare la Conidia di colore scuro. Trasferire la sospensione Conidia su un colino da 50 millilitri attraverso un colino da 30 micrometri, che rimuoverà eventuali mielie residue.
Aggiungere altri 10 millilitri di PBS con detersivo alla piastra, stenderlo con una spatola e trasferirlo nello stesso tubo attraverso il colino. Successivamente, preparare una soluzione sterile di carbonato di sodio molare 0,1, sciolto in PBS. E preparare una soluzione millimolare da 0,1 millimolare di polvere FITC, in questa soluzione di carbonato di sodio.
Sospendere di nuovo 100 milioni o meno di Conidia, in cinque millilitri di questa soluzione FITC, in un tubo da 15 millilitri. Incubare in un rotatore a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Per gonfiarsi a Conidia, resuspend il FITC etichettato Conidia in cinque millilitri di mezzo RPMI, integrato con 10%FCS.
E incubare in un rotatore a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato. In un armadietto di sicurezza bio, posizionare cinque millilitri di buffy coat in un tubo da 50 millilitri. Riempire il tubo con il buffer EL e invertire tre volte.
Incubare orizzontalmente per cinque o otto minuti, fino a quando l'aspetto lattiero della miscela diventa chiaro. Quindi, centrifugare a 300 volte G e a temperatura ambiente per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitri di el buffer mediante pipettazione.
Aggiungere altri 24 millilitri di tampone EL e invertire il tubo più volte. Centrifuga a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitri di supporti RPMI, integrati con il 10%FCS.
Per iniziare, trasferisci due milioni di leucociti e quattro milioni di Conidia con etichetta FITC in 1,5 millilitri di RPMI integrati con FCS al 10%, su una piastra di coltura da 12 pozzi. Includere un controllo delle celle solo senza Conidia e un controllo delle celle con Conidia senza etichetta. Incubare la piastra in un incubatore di anidride carbonica umidificato, a 37 gradi Celsius per la quantità di tempo desiderata.
Quando l'incubazione è completa, utilizzare un raschietto cellulare per raccogliere le cellule e trasferirle in un tubo da 15 millilitri. In primo luogo, mettere 100 microlitri di ogni campione e controlli in un unico pozzo di una piastra inferiore a V da 96 po '. Aggiungere 150 microlitri di PBS contenenti due millimolari di EDTA per il lavaggio.
Per la compensazione del colore, posizionare un milione di celle senza Conidia per ogni colore, in altri pozzi della piastra. Includere un pozzo di celle che verranno lasciate senza tensione. Aggiungere 150 microlitri di PBS contenenti due millimolari di EDTA ad ogni pozzo per il lavaggio.
Quindi, coprire la piastra con un foglio adesivo e centrifugare a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, rimuovere il foglio e scartare il supernatante invertendo rapidamente e con forza la piastra solo una volta sopra il lavandino o un tovagliolo di carta usa e getta. Rimospendare le cellule in 100 microlitri di miscela di anticorpi e mescolare bene con la pipettazione.
Per le compensazioni di colore, resuspend le rispettive cellule in 100 microlitri di PBS contenenti due millimolari di EDTA, e aggiungere un singolo tipo di anticorpo a ciascun pozzo, alla stessa quantità utilizzata nella miscela di anticorpi. Coprire con un foglio adesivo e incubare a temperatura ambiente al buio per 20 minuti. Successivamente, rimuovere il foglio e aggiungere 150 microlitri di PBS contenenti due millimolari di EDTA ad ogni pozzo per il lavaggio.
Coprire di nuovo la piastra con un foglio adesivo. Centrifuga a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi rimuovere il foglio e scartare il supernatante invertendo rapidamente e con forza la piastra su un lavandino o un tovagliolo di carta usa e getta.
Rimorsipare le cellule in 200 microlitri di PBS contenenti EDTA millimolare e trasferire la sospensione cellulare da ogni pozzo, in un tubo inferiore rotondo separato. Avviare il citometro di flusso e lasciarlo riscaldare. Nel software di acquisizione, creare un nuovo esperimento e impostare ed etichettare i nuovi campioni.
Impostare i parametri e i rilevatori per i fluorofori appropriati, come indicato nel protocollo di testo. In questo software, visualizzare i grafici a punti appropriati come delineato nel protocollo di testo. Usando le cellule solo campione, acquisire alcune cellule e impostare il cancello intorno ai leucociti.
Basato sul cancello del leucocita, gate per le cellule positive cd45, da separare da Conidia nella trama cd45 della SSC. In un grafico a punti, CD14, CD66b, neutrofili di gate e monociti separatamente. Successivamente, passare dall'unico campione di celle a Conidia senza etichetta.
In un grafico a punti, anti-FITC, APC FITC, visualizzare i neutrofili nei quadranti impostati per i segnali anti-FITC e FITC. Aprire la visualizzazione statistiche e regolare i quadranti, consentendo un massimo dell'1% delle celle nei quadranti Q1, Q2 e Q4. Ripetere questo processo per il cancello monocitare. Nel cancello del leucocita, registrare tutti i campioni con almeno 20.000 eventi.
La fagocitosi della Conidia etichettata FITC dai neutrofili umani può essere letta dalle viste statistiche. In questo studio, un metodo citometrico a flusso rapido viene utilizzato per misurare l'interazione dei fumigatori di Aspergillus Conidia con un gran numero di leucociti umani primari. Utilizzando gli anticorpi appropriati e la strategia di gating qui mostrata, una gating generale di leucociti umani per caratteristiche FSC e SSC, è seguita da una separazione dei leucociti in conidia libera, dal marcatore pan leucocitare, CD45.
Conidia può raggiungere quasi le dimensioni delle cellule al momento della citometria del flusso, specialmente quando si utilizza Conidia gonfia, e o lunghi tempi di incubazione, e quindi può comprarci l'analisi. Poiché i monociti primari umani e i neutrofili prendono Conidia in modo diverso, questo protocollo consente l'analisi separata di queste popolazioni cellulari in base alla colorazione con i marcatori di lignaggio cellulare ben consolidati, CD14 per i monociti e CD66b per i neutrofili. La percentuale di fagociti primari umani che interiorizzano la Conidia può essere altamente variabile tra i donatori di sangue, ma dipende anche da fattori sperimentali, come il tempo di incubazione e lo stato di gonfiore della Conidia.
L'internalizzazione delle spore può essere rilevata dopo 0,5 ore di co-incubazione e aumenta con il tempo. La Conidia pre-gonfia viene assunta più facilmente rispetto alle spore a riposo, anche in brevi tempi di incubazione. Se la Conidia è fissata con formaldeide, la fagocitosi viene diminuita rispetto alla conidia nativa.
Seguendo questa procedura, i supernanti delle cellule immunitarie co-incubate e della Conidia possono essere raccolti e analizzati da Eliza per verificare se l'interazione provoca un rilascio di citochine da parte delle cellule immunitarie. Ricorda, il sangue umano può potenzialmente trasmettere malattie infettive. Questo lavoro richiede la vaccinazione attraverso l'epatite B, l'uso di un armadietto di sicurezza bio, oltre a indossare guanti su un camice da laboratorio.
