This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

1. Colture Cellulari del cervello umano cellule endoteliali microvascolari (HBMEC) <ol><li> Rivestimento di fiaschi di coltura cellulare <ol><li> Per preparare la soluzione di fibronectina, aggiungere 10 ml di PBS in una provetta da centrifuga 15. Aggiungere 150 microlitri fibronectina e mescolare bene. </li><li> Per coprire il fondo un pallone di coltura di cellule T-25 aggiungere 2 mL della soluzione fibronectina. Incubare la beuta di coltura cellulare per almeno 3 ore a 37 ° C in incubatore. Rivestito fibronectina flaconi possono essere conservati per 2 settimane a 37 ° C / 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Semina e coltura cellulare di HBMEC <ol><li> soluzione fibronectina Aspirare dal fondo del pallone di coltura cellulare. Aggiungere 7,2 x 10 4 HBMEC / cm sospesi in 6 mL ECM-b medie (= ECM-b integrato con 5% di siero fetale bovino, 1% di penicillina / streptomicina, e 1% supplemento di crescita delle cellule endoteliali). Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2. Controllare la crescita delle cellule al giorno utilizzando un microscopio. </li><li> Cambiare la media ogni 3 giorni.Raccogliere o cellule dividere, quando HBMEC raggiungere circa il 80% di confluenza. HBMEC deve essere utilizzato tra passaggio 1 e 15 per evitare la perdita delle proprietà fisiologiche. </li></ol></li><li> Harvest HBMEC. <ol><li> Preparare accutase soluzione miscelando accutase (1x) con PBS a un rapporto di 1: 1. Mantenere accutase soluzione a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua fino ad ulteriore utilizzo. </li><li> Trasferimento ECM-b mezzo dal pallone di coltura di cellule in una provetta da centrifuga 15. Lavare HBMEC aggiungendo 5 ml di PBS al fondo del pallone di coltura cellulare. Aspirare PBS e ripetere la fase di lavaggio altre due volte. </li><li> Aggiungere 2 ml di soluzione pre-riscaldato accutase. Incubare a 37 ° C per 2 min. Successivamente, HBMEC vengono risospese saldamente toccando il pallone di coltura cellulare più volte. Cellule distacco è controllato tramite un microscopio </li><li> L&#39;ECM-b-medio precedentemente memorizzato in una provetta da 15 mL viene aggiunto nuovamente al pallone di coltura cellulare non appena HBMEC inizia a staccarsi. Risciacquare il fondo del pallone volte fino a più HBMEC sonoRISOSPESO. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 15. Centrifugare a 300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml ECM-b medie. Contare le cellule e diluire la sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale di 3 x 10 5 HBMEC per mL ECM-b medie. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione del Colture cellulari Inserti <ol><li> Rivestimento di inserti colture cellulari Nota importante: Evitare di toccare la membrana degli inserti colture cellulari. <ol><li> Aggiungere 100 microlitri soluzione fibronectina (vedi 1.1.1) per ciascun inserto di coltura cellulare (Figura 1A) e un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto (controllo ottico bene). Incubare per almeno 3 ore a 37 ° C. Dopo soluzione di incubazione aspirare fibronectina. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di sospensione HBMEC agli inserti di coltura cellulare e il controllo ottico bene. Aggiungere 600 microlitri ECM-b mezzo al compartimento inferiore della cellainserti coltura. Incubare per 3 - 4 giorni a 37 ° C / 5% di CO 2 fino integrità della barriera (Figura 1B) viene raggiunto, controllare la crescita cellulare mediante valutazione microscopica del HBMEC nel controllo ottico bene. Nota: non è consigliabile la crescita delle cellule al di là di quattro giorni. </li><li> Opzionale: Per simulare condizioni infiammatorie aspirare il terreno dal compartimento inferiore e sostituirla con ECM-b mezzo integrato con 500 U / ml di IFN-γ / TNF-α 24 h prima del saggio di migrazione. </li></ol></li></ol> 3. Controllo di qualità con Evans Blue nel Giorno del saggio Trasmigrazione <ol><li> Preparazione della soluzione di blu Evans <ol><li> Per preparare PBS / B27 soluzione della miscela 10 mL PBS con supplemento B27 200 microlitri utilizzando una provetta da centrifuga 15. Diluire soluzione madre blu Evans (20 mg / ml di PBS) 1: 1000 con PBS / B27. </li></ol></li><li> Evans saggio di permeabilità blu <ol><li> Aspirare il terreno dal vano inferiore, seguita da vano superioredi un inserto di coltura cellulare contenente un confluenti HBMEC monostrato. Aggiungere 100 ml di Evans soluzione blu per l&#39;inserto coltura cellulare. </li><li> Aggiungere 600 microlitri di PBS / B27 al vano inferiore e incubare per 60 min a 37 ° C / 5% di CO 2. Rimuovere con attenzione l&#39;inserto di coltura cellulare con pinze. </li></ol></li><li> misurazione blu Evans <ol><li> Rimuovere PBS / B27 dal compartimento inferiore e trasferire 100 microlitri ciascuno a due pozzetti di una polistirolo nero 96 pozzetti a fondo piatto. Inserire piatto in un lettore di piastre Tecan Pro Infinite M200 e determinare z-posizione ottimale. </li><li> Misura eccitazione di Evans blue utilizzando rispettive impostazioni (ad esempio: eccitazione: 620 nm, emissione: 680 nm, banda di eccitazione: 9 nm, emissione di banda: 20 nm, valorizzazione 175x, 25 lampeggia, tempo di integrazione: 20 ms). </li><li> Per determinare funzioni di barriera HBMEC confronta le acquisiti dati con una curva standard raffigurante Evans blu permeazione attraverso HBMEC a tempi diversi dopo semecellule ing (Figura 1B, destra). </li></ol></li></ol> 4. Migrazione Assay <ol><li> Preparazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). <ol><li> Aggiungere 10 ml RPMI in una provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere 200 microlitri B27 supplemento. Contare le cellule PBMC e centrifugare a 300 xg per 5 min. Risospendere PBMC ad una concentrazione finale di 5 x 10 6 cellule / ml RPMI / B27. </li></ol></li><li> Set-up del test di migrazione <ol><li> Aspirare mezzo dal compartimento inferiore, seguita da scompartimento superiore di inserti colture cellulari contenenti confluenti HBMEC monostrati (Figura 1A). Per donatore aggiungere 100 microlitri di sospensione PBMC ciascun agli inserti coltura cellulare ed anche ad un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti a (controllo in vitro). </li><li> Aggiungere 600 microlitri RPMI / B27 al vano inferiore degli inserti colture cellulari e 500 microlitri al PBMC del controllo in vitro e incubare 6 ore a 37 ° C / 5% di CO 2. </li&gt; </ol></li><li> La raccolta delle migrata PBMC <ol><li> Estrarre l&#39;inserto coltura cellulare utilizzando una pinza e risciacquare con cura il fondo con 400 microlitri di PBS senza toccare la membrana. Scartare dell&#39;inserto coltura cellulare. </li><li> Aggiungere 20 ml fluorosfere conteggio del flusso (circa 1.000 perline / mL) al vano inferiore della coltura cellulare inserire nonché al controllo in vitro e mescolare bene. Trasferire 1 ml di sospensione risultante PBMC di citometria a flusso tubi. </li></ol></li></ol> 5. Citometria a Flusso <ol><li> preparazione del campione <ol><li> Centrifuga PBMC a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpo aggiungendo anticorpi fluorocromo coniugato a 100 microlitri citometria a flusso tampone (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) per campione. Per i risultati presentati di seguito 1 ml CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 ml CD56-PC7, 1 ml CD8-A700, e 1 ml CD16-A750 sono stati utilizzati per campione. </li><li> Risospendere PBMC in 100 microlitri della soluzione di anticorpi e incubare per 30 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di citometria a flusso di buffer e centrifugare a 300 xg per 5 min. </li></ol></li><li> acquisizione del campione <ol><li> Risospendere PBMC nella quantità richiesta (variabile a seconda del citometro a flusso utilizzato) della citometria a flusso tampone. </li><li> Acquisire macchiato PBMC usando un citometro a flusso con una sonda attiva tra 525 e 700 nm per rivelare fluorosfere conteggio flusso (eccitazione 488 nm, emissione 525 - 700 nm). (Le seguenti operazioni sono un esempio, se si utilizza un flusso Gallio citometro operato con software Kaluza G:. (1) Avviare il computer (2) Quando il sistema operativo è completamente caricato, avviare il citofluorimetro premendo il tasto &quot;citometro a pulsante&quot; . (3) Caricare il rispettivo protocollo di acquisizione premendo il tasto &quot;protocollo aperto&quot;. (4) Scegliere il protocollo richiesto e selezionare &quot;aperto&quot;. (5) Duplicate il protocollo per ogni campione cliccando con il dirittopulsante del mouse sul protocollo visibile nel carosello virtuale e un clic sinistro sul campo &quot;duplicato&quot;. (6) Etichettare ogni campione nella lista di campioni. (7) Trasferire i campioni alle posizioni indicate della giostra e avviare l&#39;acquisizione.) </li></ol></li><li> L&#39;analisi dei campioni <ol><li> Aprire il flusso risultante citometria dati utilizzando il relativo software. Determinare il numero di sottopopolazioni di interesse per trasmigrata PBMC così come le cellule in vitro da pozzetti di controllo e il flusso fluorosfere conteggio utilizzando il rispettivo software di analisi. (Un esempio della strategia di gating è dato nella parte risultati (Figura 1 C: Per analizzare la trasmigrazione di sottoinsiemi cellule NK, selezionare prima linfociti in un canale laterale scatter (SSC) rispetto a canale forward scatter plot (FSC) linfociti sono. poi visualizzati in una CD3 contro trama CD56 e CD56 + CD3 -. Le cellule NK sono selezionati per distinguere tra sottogruppi NK-cellule, le cellule NK vengono visualizzati inun CD56 contro CD16 e CD56 CD16 trama brillante dim / - così come CD56 CD16 dim + cellule NK vengono selezionate. Inoltre, fluorosfere conteggio flusso sono scelti da un terreno FSC rispetto SSC e successivamente visualizzato in una trama di un canale con emissione tra 525 e 700 nm in funzione del tempo per determinare il loro numero.) </li><li> Per calcolare il numero totale di cellule di ciascun campione, normalizzare il numero di cellule rilevata utilizzando fluorosfere conteggio flusso: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Determinare la percentuale di cellule migrate come rapporto tra cellule migrate totali e cellule totali nel controllo in vitro. </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

Qui vi presentiamo una tecnica per indagare la trasmigrazione dei linfociti attraverso la barriera emato-encefalica umana. In vitro analisi della migrazione dei linfociti al sistema nervoso centrale è importante per studiare i processi fondamentali di linfociti stravaso, potenziali alterazioni correlati alla malattia, e nuovi approcci terapeutici. Diverse modifiche del modello di barriera emato-encefalica sono possibili. Ad esempio, le cellule del compartimento superiore potrebbero...

migrazione dei linfociti dal sangue nei tessuti è cruciale per la sorveglianza immunitaria. Una sequenza di interazioni molecolari specifici assicura portale di stravaso specifico in piccolo intestino, pelle, linfonodi, il sistema nervoso centrale (SNC), e altri tessuti 1. Alterazioni nella migrazione dei linfociti sono coinvolti nella fisiopatologia di diverse malattie larghe diffusione 2. Migrazione nel CNS immuno-privilegiato è strettamente regolato e di conseguenza alterazioni di questo processo sono coinvolti nelle patologie del SNC sono collegati come encefalomielite 3, neuromielite ottica, ictus, e la sclerosi multipla (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Pertanto, è importante studiare linfociti stravaso di capire meglio la malattia fisiopatologia e di sviluppare strumenti per un<html> melioration di malattia onere 8, 9, 10, 11, 12. Linfociti migrano nel SNC tramite percorsi distinti. Stravaso attraverso venule postcapillari nello spazio subaracnoideo attraverso la barriera sangue fluido cerebrospinale all&#39;interno del plesso coroide e attraverso la barriera emato-encefalica sono stati descritti 1, 13, 14, 15. Migrazione attraverso la barriera ematoencefalica è condotta dall&#39;interazione di linfociti con cellule endoteliali 14. Contrariamente alle cellule endoteliali in periferia, cellule endoteliali del SNC esprimono elevate quantità di molecole di giunzione strette, così strettamente limitando la quantità di cellule e proteine ​​in grado di attraversare la barriera emato-encefalicalass = &quot;xref&quot;&gt; 16. l&#39;infiammazione in allentamento delle giunzioni strette e induce l&#39;espressione di molecole di adesione; quindi, aumentando la migrazione dei linfociti nel SNC 1, 17, 18. Lo stravaso attraverso la barriera emato-encefalica è un processo a più fasi. Linfociti cordicella per le cellule endoteliali e quindi rotolare lungo l&#39;endotelio in un processo principalmente mediato da selectine 1, 15. Successivamente, le interazioni tra chemochine secrete dall&#39;endotelio ed i rispettivi recettori per chemochine espressi sui linfociti inducono cambiamenti conformazionali di integrine, promuovendo così ferma adesione alle cellule endoteliali 1. Infine, linfociti sia strisciare lungo la barriera endoteliale contro il flusso di sangue prima trasmigranti nello spazio perivascolare, o stallo immediatamente e direttamente trasmigrate al sito della ditta adesione 1, 19, 20. Tutte queste fasi di linfociti stravaso possono essere analizzate in vitro con tecniche distinti 21. Time-lapse microscopia video viene utilizzato per studiare il tethering iniziale e rotolamento 15. Saggi di adesione forniscono informazioni dettagliate su arresto ditta per endoteliali barriere 22. Saggi trasmigrazione come dimostrato qui consentono l&#39;analisi della trasmigrazione immuno-cella 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Utilizzando l&#39;umano in vitro di sangue modello encefalica, potremmo recentemente dimostrare che una più alta migrcapacità Atory di CD56 CD16 luminoso dim / - cellule NK rispetto al loro CD56 dim CD16 + controparti è riflessa da una predominanza di questo sottogruppo di cellule NK nel vano intratecale 21. Così, il nostro apparato sperimentale sembra essere adatto per simulare la situazione in vivo.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>without CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; or MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Fibronectin 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>from bovine plasma</td></tr><tr><td>T-25 cell culture flask</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth supplement</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>clear, 6.5 mm diameter, 3.0 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>96-well flat bottom plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x concentrated</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well black flat bottom plate</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Flow Count Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10-color flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>clone N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>clone 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>clone RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>clone B9.11</td></tr></tbody></table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

Linfociti stravaso nel sistema nervoso centrale (CNS) è fondamentale per la sorveglianza immunitaria. alterazioni correlati alla malattia di linfociti stravaso possono provocare alterazioni fisiopatologiche nel SNC. Così, l&#39;indagine della migrazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale è importante per capire le malattie infiammatorie del sistema nervoso centrale e di sviluppare nuovi approcci di terapia. Qui vi presentiamo un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana per studiare linfociti stravaso. cellule endoteliali microvascolari cerebrali umano (HBMEC) sono confluently coltivate su un tereftalato di polietilene poroso Transwell inserire per imitare l&#39;endotelio della barriera emato-encefalica. funzione di barriera è convalidato dal zonula occludere immunoistochimica, transendoteliale resistenza elettrica (TEER) misurazioni così come l&#39;analisi di Evans blue permeazione. Questo modello permette di indagine della diapedesi delle sottopopolazioni linfocitarie rari come CD56 CD16 luminoso dim / - cellule NK. Furthermminerale, gli effetti di altre cellule, citochine e chemochine, alterazioni legati alla malattia e distinti regimi di trattamento sulla capacità migratoria dei linfociti può essere studiato. Infine, l&#39;impatto degli stimoli infiammatori oltre a diversi regimi di trattamento sulla barriera endoteliale possono essere analizzati.

Risultati rappresentativi mostrano trasmigrazione di cellule NK e sottoinsiemi di cellule T usando il sangue-cervello modello barriera umana (Figura 1A) sono mostrate. L&#39;integrità del monostrato HBMEC stato convalidato dalla colorazione della molecola giunzioni strette ZO-1, misurazioni transendoteliale resistenza elettrica (Teer), ed Evans blu permeazione (Figura 1B). Dopo 3 - 4 giorni cultura HBMEC espresso molecola giunzioni strette ZO-1 ...

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Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

20.3K Views.  University Hospital Münster. Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro. 

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Ricerca

Bioingegneria

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medicina

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Immunologia e infezioni

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

Lucifero Giallo - Un Robusto Indicatore di Permeabilità Paracellulare in un Modello Cellulare della Barriera Sangue-Cervello Umano

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Valutazione della migrazione dei linfociti in un sistema di trasmigrazione Ex Vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Analisi di modelli di barriera emato-encefalica mediante colorazione in immunofluorescenza

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

Autore in primo piano: Promuovere l'uso della tecnologia dei chip tissutali per lo studio dei tessuti umani 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Utilizzo della piattaforma tissutale barriera MicroSiM (μSiM) per la modellazione della barriera emato-encefalica

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Visualizzazione basata su colorante fluorescente della rottura della barriera emato-encefalica nei topi

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

L'analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un

Riepilogo

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Utilizzo della piattaforma tissutale barriera MicroSiM (μSiM) per la modellazione della barriera emato-encefalica

Utilizzo della piattaforma tissutale barriera MicroSiM (μSiM) per la modellazione della barriera emato-encefalica

Utilizzo della piattaforma tissutale barriera MicroSiM (μSiM) per la modellazione della barriera emato-encefalica

Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve

Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve