Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni concesse alla RLM della Salute e medicina Consiglio Nazionale delle Ricerche of Australia (sovvenzione # 606658).

1. Colture Cellulari (3-7 giorni prima BBB Assembly) 1.1. Primarie cellule cerebrali umane endoteliali microvascolari (BEC) BECs stati ottenuti commercialmente. Le cellule sono state prodotte dalla dissociazione dispasi del normale tessuto corteccia cerebrale umana e purché congelati a passaggio 3 (&lt;12 raddoppi popolazione). <ol><li> Substrato: navi Coat tessuto-coltura con &quot;Fattore Allegato&quot; secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Mantenimento delle cellule: Mantenere BECs in mezzo completo contenente siero. Per la sperimentazione, la cultura BECs in terreno privo di siero completo. Mantenere le cellule in un umidificata al 5% di CO 2, 21% O 2 incubatore a 37 ° C Nota: In alternativa ai reagenti specializzati, 0.1% (w / v) di gelatina può servire come reagente di rivestimento mentre DMEM/F-12 supplementato con 15 mM HEPES, 10% (v / v) di siero fetale bovino (FCS), 2 mM L-glutammina, 50 mcg/ Ml di gentamicina, 20 ug / ml di eparina e 20 ug / ml cellule endoteliali supplemento di crescita possono essere utilizzati per la manutenzione BEC. </li><li> Sub-coltura per la sperimentazione: BECs confluenti Spalato con un rapporto di 1:03-01:06, a seconda del tempo previsto per un uso successivo (3-7 giorni). Modificare il terreno di mantenimento ogni 3 giorni. Utilizzare BEC fino a 15 passaggi. </li></ol> 1.2. SVG umano fetale astrogliali Cell-linea SVG cellule fetali umane astrogliali 22 sono stati originariamente derivati ​​da colture primarie di cervello fetale umano trasformato con la replica carenti virus delle scimmie 40. <ol><li> Manutenzione: cellule Culture SVG in mezzo essenziale minimo con la soluzione salina bilanciata di Earle supplementato con 20% (v / v) FCS (stessa percentuale siero utilizzato per mantenere i loro genitori pile 22), 2 mM L-glutammina, 50 U / ml di penicillina e 50 streptomicina mcg / ml. Mantenere le cellule in un umidificata al 5% di CO 2, O 2 21% </sub&gt; incubatore a 37 ° C. </li><li> Sub-coltura per la sperimentazione: SVG confluenti Spalato con un rapporto da 1:5 a 1:10 a seconda del tempo previsto per un uso successivo (3-7 giorni). Rimozione di tripsina non è necessaria a causa dell&#39;elevato contenuto di siero nel mezzo. Cambia il mezzo ogni 3 giorni. Usare SVG fino a 20 passaggi. </li></ol> 2. Montaggio e Coculturing di umani in vitro BBB Model (giorno 0) Commento: L&#39;essere umano in vitro modello di contatto BBB viene preparato secondo protocolli pubblicati 13,23, con modifiche. 2.1. Rivestimento di Inserti <ol><li> Posizionare gli inserti di tessuto-cultura (6,5 millimetri di diametro con poliestere membrana porosa, a 3 micron pori-size) nei pozzetti della piastra da 24 pozzetti in dotazione. Ricoprire la superficie luminale degli inserti <s> </s> durante la notte in un incubatore umidificato a 37 ° C con ratto collagene I (20 mg / cm 2; 50 pl di 132 mcg/ Ml di collagene I in 0,02% acido acetico in acqua Milli-Q (MQH 2 O)). Lavare gli inserti tempo (sia dal lato abluminale e luminale) con MQH 2 O per rimuovere l&#39;acido residuo. Nota: membrana basale dei capillari cerebrali non contiene collagene I, ma soprattutto laminine, isoforme di collagene di tipo IV, nidogens, e proteoglicani eparan solfato 9. Per questo motivo, alcuni ricercatori utilizzano agenti di rivestimento quali collagene IV, fibronectina 13, o Matrigel (BD Biosciences) 16 per una più autentica modellazione BBB. </li></ol> 2.2. SVG semina sul lato inferiore (abluminale) membrana di superficie <ol><li> Invertire l&#39;inserto e montare intorno al bordo della membrana porosa un breve pezzo di tubo in silicone elastico (&quot;tubo esterno&quot;; ~ lunga 10 mm 8 mm diametro interno 1,6 mm Parete), essenzialmente creando un nuovo pozzo di sopra della superficie abluminale (Figura 2A). </li><li> La parte inferiore del nee dell&#39;insertods da sigillare per evitare perdite media. In primo luogo, preparare un tappo (Figura 2A e 2B) in un tubo di silicone (&quot;tubo interno&quot; definito; ~ lunghezza 8 3,2 mm di diametro interno 1,6 mm Parete; Figura 2B), sigillato ad una estremità con un cono di tenuta di plastica (~ 3mm lungo; preparata tagliando il fondo di una reazione a catena 0,2 ml della polimerasi (PCR) tubo; Figura 2B). Questo cono sigilla non solo il lume tubi interni, ma anche allarga il suo bordo per stretto raccordo nell&#39;inserto. Successivamente, utilizzando una pinza sterile, inserire la spina silicone nella cavità luminale e farlo avanzare fino a raggiungere fino ad ~ 1-2 mm dalla membrana (Figura 2A). </li><li> Avanti, sementi 4 x 10 4 cellule SVG in 200 microlitri SVG terreno di mantenimento (section 1.2.2 sopra) direttamente nel silicone ben al di sopra della superficie della membrana abluminale (Figura 2A). Consentire SVG di aderire per almeno 4 ore in incubatrice. Nota: Per preservare la sterilità trasportare gli inserti assemblati tra due piastre da 6 pozzetti (una piastra capovolta rispetto all&#39;altra; Figura 2C) per minimizzare l&#39;esposizione all&#39;aria non filtrata durante la procedura. Tubi di silicone e le spine vengono lavati in etanolo e sterilizzati in autoclave per un uso successivo. Nota: Usare tappi (paragrafo 2.2.2) solo per inserti con membrana pori di dimensioni superiori a 1 micron. Membrane con diametro dei pori ≤ 1 micron raramente perdite e richiedono solo il raccordo del tubo in silicone esterno (punto 2.2.1). Inoltre, alcuni agenti di rivestimento diversi da collagene I (vedi nota la sezione 2.1) possono impedire leakiness anche attraverso 3 micron pori. Determinare questo empiricamente. </li><li> Al fine di monitorare lo stato di aderenza delle vostre astrociti, seminare in parallelo ina 96 pozzetti un volume identico standard della astrociti cellule sospensione. Questo bene ha la stessa superficie dell&#39;inserto 6,5 millimetri (0,33 cm 2) e permettere una più facile visualizzazione di cellule al microscopio a contrasto di fase rispetto alla membrana inserto. Quando si osserva sufficiente aderenza del astrociti nel controllo a 96 pozzetti, astrociti hanno adeguatamente aderito anche alla membrana inserto. </li><li> Quando gli astrociti hanno sufficientemente aderito nel controllo a 96 pozzetti, trasferire le assemblee di inserimento alla cappa coltura tissutale (vedi nota sopra) e rimuovere delicatamente il tubo in silicone esterno e le spine. Inserti tornare alla (cioè verticale) orientamento normale nei pozzetti forniti contenenti 800 ml / pozzetto di BEC terreno di mantenimento (precedente paragrafo 1.1.2). </li></ol> 2.3. Semina del BECs in Aula al di sopra delle astrociti Luminal Seed 2x10 4 BECs in 200 microlitri sulla superficie luminale collagene rivestita e restituire l&#39;inserts nell&#39;incubatrice. 2.4. Coculturing Coculture gli inserti SVG / BEC-teste di serie per 3 giorni in BEC mezzo senza cambiare supporto prima sperimentazione. 3. La sperimentazione del Modello BBB umano (3 ° giorno) <ol><li> Per stimolare le vitro BBB prime cellule di lavaggio a sostituendo media abluminale e luminali con 600 ml e 100 ml di serum-free BECs medio, rispettivamente. </li><li> Aspirare nuovamente il mezzo luminale e sostituirlo con 100 ml di terreno privo di siero con agenti stimolanti. Nota: se è necessaria la stimolazione della camera abluminale (per attivare la vitro BBB dal vano astrociti), aspirare il terreno abluminale e sostituirlo con 600 ul di mezzo privo di siero con agenti stimolanti. </li><li> Verifichiamo ogni gruppo sperimentale in triplice copia (quindi, se non si esegue la stimolazione del lume, che richiede 3 x 100 ml, si consiglia di diluire il re<html> agenti alle loro concentrazioni finali in 350 ml di terreno privo di siero per gruppo per ridurre al minimo gli errori di pipettaggio tra pozzi). </li><li> Eseguire paracellular standard e / o saggi transcellulare permeabilità di traccianti marcati 16,24 (per quest&#39;ultimo usiamo isotiocianato di fluoresceina (FITC) coniugato con albumina) e / o misura di TEER 13,16,25 come precedentemente descritto. </li></ol> Per tenere conto di variazioni nella permeabilità basale tra esperimenti, analizzare variazioni di permeabilità relativa ad un inserto rivestito senza cellule (che serve come riferimento per la permeabilità massima) e al gruppo trattato con veicolo utilizzando la formula: permeabilità (% max) = ( valore di permeabilità di inserto sperimentale - valore medio permeabilità del gruppo veicolo) / (valore di permeabilità dell&#39;inserto blank - valore medio permeabilità del gruppo veicolo) X 100. 4. Visualizzazione di celle porosi Membrane nt &quot;&gt; Commento: cellule non colorati sulle membrane inserti sono difficili da osservare per contrasto di fase o di contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopio in quanto la membrana è abbastanza opaco e interferisce con la trasmissione della luce Per affrontare questo problema abbiamo sviluppato diverse procedure di colorazione delle celle. inserti, che migliorano notevolmente l&#39;aspetto delle cellule sulla membrana. Generalmente, macchia le membrane inserto mentre ancora attaccati l&#39;inserto, nei pozzetti. Le membrane devono essere rimossi solo al termine della procedura di colorazione per scopi di montaggio. 4.1. Ematossilina colorazione <ol><li> Fissare con inserti ghiacciata 4% (w / v) paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 130 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7.2) per 20 min. Risciacquare una volta in PBS. </li><li> Immergere l&#39;inserto in soluzione ematossilina 0,1% di Mayer per 2 min. </li><li> Lavare delicatamente l&#39;inserto con acqua di rubinetto (immergendo gli angoliERT in un bicchiere contenente acqua di rubinetto e pipettando delicatamente l&#39;acqua in eccesso). Trasferire l&#39;inserto alla soluzione di Scott acqua di rubinetto (2 g / L NaHCO3, 20 g / L MgSO4) per ~ 20 secondi finché il colore blu desiderato sviluppa. Lavare nuovamente l&#39;inserto con acqua di rubinetto (punto 4.1.3). Un eosina opzionale può essere introdotto qui immergendo l&#39;inserto in soluzione eosina 1% per 10 secondi seguita da un lavaggio con acqua del rubinetto. </li><li> Air-asciugare la membrana inserto. Usando un bisturi (taglio attorno al bordo membrana) rimuovere la membrana e montarlo su un vetrino per l&#39;imaging in campo chiaro Nota: Se di-N-butylphthalateinxylene (DPX) mezzo di montaggio è utilizzato lavare l&#39;inserto con 100% di etanolo seguito da xilene prima di rimuovere e montare la membrana. </li></ol> 4.2. Microscopio Elettronico a Scansione (SEM) <ol><li> Fissare con inserti ghiacciata 4% (w / v) in PBS PFA per 20min. Lavare tre volte in PBS. </li><li> Post-fissare le membrane per 30 min a 1% (w / v) Tetrossido di osmio in MQH 2 O. </li><li> Lavare inserti in acqua (punto 4.1.3) e disidratare in un gradiente crescente di etanolo (50%, 70%, 90% per 5 minuti ciascuno, poi 3x con il 100% di etanolo per 10 min per intervallo). </li><li> Trattare inserti disidratati con un misto di esametildisilazano (HMDS): etanolo (1:02 poi 2:01 per 5 min). </li><li> Trattare gli inserti con il 100% HMDS per 5 minuti, asciugare e conservare in condizioni essiccati. </li><li> Rimuovere la membrana con un bisturi (taglio attorno al bordo della membrana). Esaminare membrane mediante microscopia elettronica a scansione. </li></ol> 4.3. Immunofluorescenza <ol><li> Fissare con inserti ghiacciata 4% (w / v) in PBS PFA per 20 min, lavare una volta in soluzione salina tamponata con Tris (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM NaCl, 0,22 micron filtrato). </li><li> Eseguire immunocolorazione delle cellule sulla membrana inserto come descritto in precedenza 26. </li><li> Rimuovere la membrana con un bisturi (taglio intorno al bordo della membrana) e montarlo sul agdiapositiva lass con mezzo di montaggio fluorescenza. Esaminare membrana mediante microscopia a fluorescenza. </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nat. Med. 14, 731-737 (2008).</li><li>Yepes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-type+plasminogen+activator+induces+opening+of+the+blood-brain+barrier+via+the+LDL+receptor-related+protein.">Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein.</a> J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).</li><li>Abu Fanne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+permeability+and+tPA-mediated+neurotoxicity.">Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity.</a> Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+receptor-mediated+induction+of+matrix+metalloproteinase+by+tissue+plasminogen+activator.">Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator.</a> Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hemorrhagic+transformation+after+tissue+plasminogen+activator+reperfusion+therapy+for+ischemic+stroke.">Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke.</a> Stroke. 35, 2726-2730 (2004).</li><li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+better+use+of+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke.">How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke.</a> Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).</li><li>Acheampong, P., Ford, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+alteplase+in+the+treatment+of+ischaemic+stroke.">Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke.</a> Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).</li><li>Derex, L., Nighoghossian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+haemorrhage+after+thrombolysis+for+acute+ischaemic+stroke:+an+update.">Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).</li><li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+treatment--light+at+the+end+of+the+tunnel.">Stroke treatment--light at the end of the tunnel.</a> Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).</li><li>Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+Stroke+in+the+2010s.">Reversing Stroke in the 2010s.</a> Stroke. 40, 3156-3158 (2009).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Song, L., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+that+maintain+expression+and+cytoskeletal+association+of+tight+junction-associated+proteins.">Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La ricerca medica in patologie cerebrali soffre molta difficoltà traslazionale. Nella zona di ictus ischemico acuto, per esempio, molti farmaci che hanno mostrato una grande promessa in modelli animali fallito alla clinica 38,39. Le ragioni di questi risultati deludenti sono diversi e comprendono l&#39;infedeltà dei sistemi di test preclinici per lo scenario tratto umano e sovrastima dei risultati ottenuti da studi su animali 21. Una strategia per migliorare il valore predittivo dei risultati pre...

Il BBB è un&#39;interfaccia specializzata tra la circolazione del sangue periferico e il sistema nervoso centrale, fondamentalmente responsabile del mantenimento dell&#39;emostasi cervello. Esso comprende cerebrali cellule endoteliali microvascolari distinti (BECS) funzionalmente influenzato da pochi componenti cellulari e acellulari (sotto) per formare un gateway stretto e dinamico nel cervello. In condizioni fisiologiche la BBB limita il passaggio di cellule del sangue, componenti del plasma e sostanze nocive, tutti potenzialmente neurotossico, nel cervello. In parallelo, la BBB scambia selettivamente ioni principali e nutrienti (glucosio e amminoacidi) e dei prodotti di scarto del metabolismo tra il cervello e la circolazione di mantenere con precisione l&#39;ambiente cervello 1,2. Negli ultimi anni sta diventando evidente che fallimento della BBB verifica in una varietà di patologie cerebrali croniche, come le malattie neurodegenerative infiammatorie o anormalità (come morbo di Alzheimer e multiple sclerosi rispettivamente) 3, nonché in condizioni acute come l&#39;ictus ischemico 4. Le proprietà uniche BBB di cellule endoteliali cerebrali (BECS) sono in gran parte indotte dal loro ambiente cerebrale 5, ed in particolare dagli astrociti 6,7. Vi è una crescente comprensione che altri tipi di cellule, come i periciti 8, neuroni e microglia 1,3, così come la membrana basale 9, supportano BECs e formano insieme una unità funzionale definita &quot;unità neurovascolare&quot; (NVU) che simultaneamente coppie neuronale richieste metaboliche ai loro capillari che riforniscono 10. Il coinvolgimento della BBB in situazioni patologiche alla base di numerosi tentativi di sviluppare modelli in vitro di BBB per aiutare nella ricerca di BBB-correlato 11,12. Questi modelli mirano a simulare il più vicino possibile in vivo caratteristiche BBB secondo il principio NVU. In vitro </em&gt; Modelli BBB genere si basano su un monostrato di BEC-tight-junction di formatura (principalmente da bovini 13, umano 14, 15 ratto, topo 16 e suini 17,18 origini), coltivate su una membrana porosa con astrociti di supporto (ampiamente recensione di Deli et al. 2005 11). Astrociti possono essere coltivate in condizioni di non-contatto sul fondo di una coltura di tessuti e, separato da BECs (coltivate sulla superficie superiore della membrana) dal mezzo di coltura pur comunicanti BECs tramite fattori solubili 16. In modelli più avanzati che meglio ricordano la struttura anatomica della BBB in vivo, astrociti sono mantenute in condizioni di contatto e coltivate direttamente sul lato opposto della membrana in prossimità BECs 13,15,17 (Figura 1). Questa configurazione consente il contatto fisico tra BEC e astrociti, stabilita quando progetto astrocitiloro processi attraverso la membrana porosa. Importante, per un vero contatto a verificarsi i pori devono essere ≥ 1μm di diametro, dal momento che astrociti finali piedi non può passare attraverso dimensioni dei pori più piccoli (cioè 0,4 micron) 14,15. In particolare, i sistemi di contatto BBB sono dimostrate in alcuni studi di essere superiore alle loro controparti non-contatto per quanto riguarda il loro trans-endoteliale resistenza elettrica (TEER) e valori di permeabilità endoteliali dei vari traccianti 13,17,18. Un&#39;ulteriore dimensione della portata media è stato recentemente inserito in una serie di modelli in vitro BBB per applicare forze di taglio all&#39;endotelio più stretta simulazione del sistema vascolare cerebrale 12,19. Un ostacolo tecnico da superare nella generazione di un modello di contatto BBB è la semina di astrociti contro gravità sulla superficie abluminale della membrana porosa. Protocolli precedenti 13,20, dove astrociti erano semplicemente seminate in una goccia di supporti in cima a unInserto convertito, ammesso volte solo a breve seeding (vale a dire 10 min 13 o 2 ore 20), che sono stati trovati nelle nostre mani per essere insufficiente per l&#39;adesione delle cellule corretta. Usando questo metodo di base, un periodo più lungo attacco astrociti richiede un monitoraggio costante degli inserti di frequente apertura dell&#39;incubatore (causando sbalzi di temperatura, pH e umidità) ed è anche incline a semina delle cellule irregolare a causa di perdita di mezzi di comunicazione attraverso i pori, soprattutto se pori più grandi di 1 um sono impiegati. Qui, descriviamo un protocollo generale per la preparazione di un modello di contatto BBB. La nostra procedura prevede un metodo alternativo per cellula-semina su inserti invertiti, che affronta le limitazioni di cui sopra. Il metodo permette di adesione indisturbata degli astrociti sulla superficie della membrana abluminale, in un incubatore equilibrata, per un periodo di tempo prolungato. Come risultato, una semina uniforme di astrociti si ottiene che aumenta la qualità barrierae riduce al minimo le variazioni di permeabilità basali tra inserti. Come l&#39;uso di cellule umane è importante per la ricerca umana rilevanti 21, abbiamo inoltre dimostriamo in questo articolo l&#39;utilizzo specifico di una nuova combinazione di BECs umani primari e immortalata astrociti umani per l&#39;istituzione di un modello BBB contatto umano con un elevato throughput capacità di screening . Poiché la visualizzazione di cellule su membrane porose può essere difficile, abbiamo anche particolare tecniche di colorazione che possono aiutare a determinare la confluenza e la morfologia delle cellule sulle membrane porose. Infine, rappresentiamo come il nostro modello BBB umano può essere utilizzato per esaminare l&#39;effetto del tessuto di tipo plasminogeno (t-PA) - un enzima trombolitico che serve come opzione di trattamento unico per l&#39;ictus ischemico acuto - sul BBB.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-210</td>
			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

La barriera ematoencefalica (BBB) ​​comprende impermeabili ma adattabili capillari cerebrali che controllano saldamente l&#39;ambiente cervello. Fallimento della BBB è stato implicato nell&#39;eziologia di molte patologie cerebrali, creando la necessità di sviluppare umano in vitro BBB per assistere nella ricerca clinicamente rilevante. Tra i numerosi modelli BBB finora descritti, statica (assenza di flusso), contattare modello BBB, dove astrociti e cellule endoteliali cerebrali (BECS) vengono co-coltivate sui lati opposti di una membrana porosa, è emerso come un sistema ancora autentica semplificato per simulare l&#39; BBB con elevato throughput capacità di screening. Tuttavia, la produzione di tale modello presenta alcune sfide tecniche. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di un modello di BBB contatto umano utilizzando una nuova combinazione di BECs umani primari ed astrociti umani immortalati. In particolare, i dettagli di un metodo innovativo per la cella-semina su inserti rovesciati così come specificato inserit tecniche di colorazione e esemplificano come usiamo il nostro modello per la ricerca BBB-correlati.

Al fine di stabilire un essere umano, modello di contatto BBB abbiamo dovuto coltivare SVG e BECs sulle membrane porose con un 3 micron pori di dimensioni, indicato per consentire il passaggio di astrociti finali piedi per il contatto con le cellule endoteliali 14,15,27,28. Una rappresentazione schematica del modello di contatto completo è illustrato nella Figura 1 (illustrazione a sinistra). La principale sfida tecnica presentata da un sistema di contatto è la necessità di inizializzare a...

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Istituzione di modelli umani della barriera emato-encefalica (BBB) ​​può beneficiare la ricerca sulle condizioni del cervello connesse con il fallimento BBB. Descriviamo qui una tecnica migliorata per la preparazione di un modello BBB contatto, che consente coculturing di astrociti e cellule endoteliali cervello sui lati opposti di una membrana porosa.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.2K Views.  Monash University.  Istituzione di modelli umani della barriera emato-encefalica (BBB) ​​può beneficiare la ricerca sulle condizioni del cervello connesse con il fallimento BBB. Descriviamo qui una tecnica migliorata per la preparazione di un modello BBB contatto, che consente coculturing di astrociti e cellule endoteliali cervello sui lati opposti di una membrana porosa. 

Video: Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Costante pressione controllata metodo di estrusione per la preparazione del Nano di dimensioni vescicole lipidiche

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Ricerca

Bioingegneria

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinazione del tasso di trasporto di xenobiotici e nanomateriali attraverso la placenta con il<em&gt; Ex vivo</em&gt; Umano Modello perfusione placentare

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Un metodo migliore per la preparazione di tipo I collagene della pelle

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

Alisia Preparazione ganglia per analisi elettrofisiotiche e molecolari di singoli neuroni

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Ottimizzare Allegato di cellule staminali mesenchimali umane su Poli (ε-caprolattone) elettrofilate Filati

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

In Vitro permeazione di ferritine FITC-caricati attraverso un Rat barriera emato-encefalica: un modello per studiare la consegna di Nanoformulated Molecole

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

Lucifero Giallo - Un Robusto Indicatore di Permeabilità Paracellulare in un Modello Cellulare della Barriera Sangue-Cervello Umano

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

Microarray di bioparticelle per l'analisi chemiotattica e molecolare dello sciame neutrofilo umano in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...