This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia &amp; Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).

Questo protocollo aderisce alle linee guida del UCSF per l&#39;etica della ricerca umana. 1. Preparazione di T coltura cellulare, Isolamento di cellule T CD4 + e Th17 polarizzazione <ol><li> Al giorno 0, cappotto 6 pozzetti di coltura tissutale con 1,5 ml per pozzetto di anti-umana CD3 (2 ug / mL) e CD28 anti-umano (4 ug / ml) in PBS con calcio e magnesio per almeno 2 ore a 37 ° C. <ol><li> In alternativa, ricoprire le piastre per una notte a 4 ° C. Avvolgere le piastre in parafilm. </li></ol></li><li> Preparare le cellule mononucleate del sangue del cordone (CBMCs) di densità centrifugazione in gradiente le istruzioni del produttore. ATTENZIONE: Lavorare con cura e garantire la corretta dispositivi di protezione individuale (DPI) è indossare durante la manipolazione del sangue umano per evitare ogni rischio di esposizione ad agenti patogeni. </li><li> Una volta che le cellule mononucleate sono state isolate e lavati, eseguire isolamento delle cellule T CD4 + umano sele negativoction utilizzando un kit commerciale di cellule T CD4 + umana. NOTA: Se c&#39;è contaminazione globuli rossi dopo l&#39;isolamento di cellule mononucleate, una lisi dei globuli rossi opzionale può essere eseguita prima delle fasi di isolamento delle cellule T CD4 +. Risospendere le cellule mononucleari in 1 ml di tampone di isolamento (2% FBS in PBS). Aggiungere 5 ml di soluzione di lisi 1x. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere quindi 5 ml di tampone di isolamento e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C per sedimentare le cellule. <ol><li> Risospendere le cellule mononucleari ad una densità di 50 x 10 6 per 500 microlitri nel buffer isolamento in una nuova provetta 5 ml. </li><li> Aggiungere 100 ml di FBS e 100 microlitri della miscela di anticorpi per provetta poi incubare ciascun tubo a 4 ° C per 20 minuti in un agitatore orbitale per mescolare bene. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 3-4 mL di tampone isolamento per lavare le cellule. Centrifugare le cellule a 300 xg per 8 minuti a 4 ° C per sedimentare le cellule. aspirare accuratamente la supernatant. </li><li> Durante questo spin, pre-lavare le sfere magnetiche. Trasferire la quantità desiderata di perline magnetiche in un nuovo tubo (usato a 1: 1 con le cellule) e aggiungere un uguale volume di tampone di isolamento per lavare le perline. Mescolare bene con una micropipetta mL 1 e quindi inserire il tubo nel magnete per almeno 1 min. Con attenzione aspirare il surnatante. Risospendere le sfere magnetiche nello stesso volume inizialmente ceduto prima del lavaggio. </li><li> Risospendere le cellule in ciascuna provetta con 500 ml di tampone di isolamento e aggiungere 500 ml di perline magnetiche pre-lavati. </li><li> Incubare le cellule con le perline magnetiche per 15 minuti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) miscelare bene. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, pipettare accuratamente le cellule utilizzando una micropipetta 1 mL almeno 10 volte. Quindi aggiungere 3-4 ml di tampone isolamento e posizionare ciascun tubo nel magnete per 2 min. </li><li> Trasferire accuratamente le cellule T CD4 + negativamente selezionati che sonoil surnatante in una nuova provetta. </li></ol></li><li> Una volta che l&#39;isolamento delle cellule T CD4 + è stata completata, contare le cellule con un emocitometro e mantenere le cellule in ghiaccio. </li><li> Lavare le piastre rivestite con anticorpo due volte con PBS. Quindi aggiungere 1,5 mL di 2x mix di media Th17-polarizzazione in ciascun pozzetto: IFNy anti-umana (20 mg / ml), anti-IL-4 (20 mg / ml), TGF umana (10 ng / mL), umano IL-1β (40 ng / ml), IL-23 (40 ng / ml), IL-6 umana (50 ng / mL) tutti diluita in un mezzo di base privo di siero (integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 10 mM HEPES, 1 mM sodio piruvato e 100 pM 2-mercaptoetanolo). NOTA: Transfection e RNA interference fa il lavoro in supporto contenente siero. Lo scopo di utilizzare supporti privo di siero con questo protocollo è quello di ottenere una migliore produzione di IL-17A. </li><li> Centrifugare le cellule umane T CD4 + a 500 xg per 5 min a 4 ° C a pellet cellule. Aspirare accuratamente la supernatformica. Poi risospendere le cellule in base privo di siero e piastra le cellule ad una densità di 3 x 10 6 in 1,5 ml per pozzetto in modo che il volume finale è di 3 ml per pozzetto e citochine polarizzanti sono ora ad una concentrazione finale 1x. <ol><li> Posizionare le piastre in 5% CO 2, 37 ° C incubatore per due giorni. </li></ol></li></ol> 2. Le cellule elettroporazione di In Vitro polarizzato Th17 umana <ol><li> Il giorno 2, cappotto 48-pozzetti di coltura tissutale con 250 microlitri per pozzetto di anti-umana CD3 (2 ug / mL) e CD28 anti-umano (4 ug / ml) in PBS con calcio e magnesio per almeno 2 ore a 37 ° C. <ol><li> In alternativa, ricoprire le piastre per una notte a 4 ° C. Avvolgere le piastre in parafilm. </li></ol></li><li> Preparare piccoli RNA per la trasfezione. Per ogni trasfezione, aliquota 1 ml di 5 mM soluzione stock di siRNA in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Includi appropriata chimica-abbinato piccolo contr RNAolo. Tenere tutti i tubi in ghiaccio. </li><li> Lavare le piastre rivestite con anticorpo due volte con PBS. Quindi aggiungere 500 ml di 1X Th17-polarizzazione media per ogni pozzetto: IFNy anti-umana (10 mg / ml), anti-IL-4 (10 mg / ml), TGF umano (5 ng / mL), IL-umano 1β (20 ng / ml), IL-23 (20 ng / ml), IL-6 umana (25 ng / mL) tutti diluita in un mezzo di base privo di siero (integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 U / mL di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 10 mM HEPES, 1 mM sodio piruvato e 100 pM 2-mercaptoetanolo). </li><li> Dopo che le piastre di coltura e reagenti di trasfezione sono preparati, risospendere le cellule con 1 ml micropipetta, pipettando gentilmente ma assicurando che tutte le cellule sono staccate dal fondo dei pozzetti. Raggruppare le cellule in una provetta conica e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. NOTA: Per periodi più lunghi di cultura del protocollo di quattro giorni qui presentate, le cellule devono essere trasfettate circa ogni 3 giorni usando lo stesso protocollo. Passo 2.4 dovrebbe essere modificato tuttavia, poiché le cellule trattate con differenti piccoli RNA non dovrebbero essere convogliati. Tutte le condizioni in fase di test devono essere raccolti, contati e trasfettate separatamente. </li><li> aspirare accuratamente il surnatante e quindi risospendere le cellule in almeno 1 ml di PBS per lavare. Contare le cellule Th17 vive (ad esempio con un emocitometro utilizzando Trypan Blue esclusione per valutare la vitalità) e poi trasferire le cellule in una provetta. </li><li> Centrifugare a 500 xg per 5 min a temperatura ambiente per agglomerare le cellule. </li><li> Aspirare accuratamente il surnatante e quindi risospendere le cellule usando il tampone di risospensione fornito dal sistema di transfezione 10 microlitri kit ad una densità di 2,5-4 x 10 7 cellule per ml. Mantenere le cellule a temperatura ambiente. NOTA: Come linea guida, provare a preparare solo il maggior numero di cellule, come si può transfettate entro 30 min. lotti multipli possono essere confrontati. </li><li> Aggiungere 9 ml di cellule per 1 ml di piccoli RNA in ogni MicroCtubo entrifuge. Dispensare una volta per mescolare le cellule e piccoli RNA per trasfezione quindi caricare nella punta dell&#39;elettrodo pipetta. NOTA: Tipicamente, aggiungere 9,5 ml di sospensione cellulare per garantire il della miscela per evitare la creazione di bolle nella punta dell&#39;elettrodo pipetta prima trasfezione. </li><li> Riempire la vaschetta fornito con 3 ml di temperatura ambiente elettrolitico Buffer E. Posizionare la cuvetta all&#39;interno della stazione pipetta e quindi inserire la pipetta in posizione all&#39;interno della provetta. </li><li> elettroporazione immediatamente ogni 10 ml mix di cellule e piccoli RNA utilizzando i seguenti parametri: tensione ad impulsi 1,500-1,550 V, larghezza di impulso di 10 ms, e 3 impulsi totale sul dispositivo trasfezione. </li><li> Dopo l&#39;elettroporazione è completa, aggiungere direttamente la miscela di cellule per 500 ml di 1X Th17-polarizzante media in pozzetti preparati dei piastra di coltura. Piastre posto in un 5% di CO 2, 37 ° C incubatore per altri due giorni. NOTA: Lavare l&#39;elettrodo pipetta pipettandosu e giù in PBS tra ogni trasfezione. </li></ol> 3. Cellule raccolta Th17 umane <ol><li> Risospendere le cellule in coltura con una micropipetta, pipettando gentilmente ma garantire che tutte le cellule sono staccate dal fondo dei pozzetti. Preparare le cellule per analisi di espressione funzionale e / o geni. NOTA: Di routine, abbastanza cellule vengono ceduti da un singolo pozzo di cellule Th17 trasfettate da utilizzare per l&#39;analisi di citometria di flusso del marcatore di superficie e intracellulare di citochine e fattori di trascrizione colorazione o per la preparazione di RNA per l&#39;analisi di espressione genica. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Na&#239;ve+CD4++T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets.">Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Schumann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+knock-in+primary+human+T+cells+using+Cas9+ribonucleoproteins.">Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo protocollo fornisce un metodo migliorato per la consegna di piccoli RNA in cellule Th17 umane. Sebbene le cellule Th17 umane sono stati usati qui, questo metodo di elettroporazione con piccoli RNA può essere utilizzato con altri sottoinsiemi helper umana primaria T, come Th1, Th2 e Tregs. Esso non funziona bene per le cellule T CD4 + naive quindi le cellule devono essere attivati in coltura prima della trasfezione. Per questo protocollo, abbiamo prima ottimizzato il sistema di coltura in vitro in<...

Cellule T CD4 + sono orchestrators cruciali della risposta immunitaria adattativa. Naive cellule T CD4 + sono capaci di svilupparsi in diversi cellule T effettrici (es Th1, Th2, Th17, ecc), ciascuno con la propria serie di citochine e fattori di trascrizione caratteristici, a seconda del microambiente locale 1. Le decisioni lignaggio che le cellule T fanno sono fondamentali sia per l&#39;immunità protettiva e la tolleranza per sé. Cellule Th17 sono un sottogruppo di cellule T conosciuti per combattere batteri extracellulari e funghi, ma le loro risposte improprie sono anche implicati nella patogenesi di più malattie autoimmuni e infiammatorie come la sclerosi multipla e psoriasi 2, 3. Cellule Th17 umane possono essere generati da cellule T CD4 + naive in vitro fornendo loro un appropriato ambiente polarizzazione 4. Vario<html> ci combinazioni delle citochine IL-1β, IL-23, TGF, e IL-6 sono stati utilizzati per lo sviluppo delle cellule Th17 umane. Cellule Th17 umane esprimono CCR6, un recettore delle chemochine che viene comunemente utilizzato per identificare questa popolazione cellulare e sono definite dall&#39;espressione del loro fattore di trascrizione principale, RORγt (codificata dal RORC) 5, 6. cellule Th17 hanno la capacità di esprimere molteplici citochine, ma IL-17A è la citochina effettore lignaggio definizione prodotta da queste cellule. Abbiamo esaminato l&#39;espressione di tutti i tre marcatori Th17-associato (CCR6, RORγt, IL-17A) per valutare la robustezza della nostra analisi umana Th17 in vitro differenziazione. Inoltre, abbiamo coltivato le cellule T CD4 + umane in condizioni non polarizzante, in cui sono stati aggiunti citochine o anticorpi bloccanti al mezzo di coltura da usare come controllo negativo in quanto espressione di questi marcatori Th17 dovrebbe essere molto bassa o assente. ve_content &quot;&gt; Un modo per studiare il normale sviluppo delle cellule T umane e la biologia è quello di manipolare l&#39;espressione genica durante il loro sviluppo. A breve RNA interferenti (siRNA) sono sintetici piccole molecole di RNA che hanno come target mRNA codificanti proteine ​​e possono essere utilizzati per ridurre l&#39;espressione genica specifica . I microRNA (miRNA) sono endogeni non codificanti piccoli RNA noti per modulare l&#39;espressione genica post-trascrizionale. miRNA hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante sia murine e biologia delle cellule T umane, anche in cellule Th17 7, 8, 9. e &#39; è fondamentale avere metodi affidabili di manipolare piccola attività di RNA nelle cellule T umane per studiare i loro effetti sulla espressione genica e, infine, sulla biologia delle cellule T umano. Qui, descriviamo un protocollo facile da usare, affidabile e coerente che abbiamo sviluppato per l&#39;introduzione piccoli RNA sintetici e acidi nucleici bloccati (LNA, chimicamente modificati acidi nucleici con maggiore stabilità)nelle cellule del sistema immunitario, e in particolare nelle cellule Th17 umane. Ci sono diversi metodi alternativi di introdurre piccoli RNA in cellule di mammifero, che generalmente rientrano in chimici, biologici o fisici categorie 10. metodi chimici comunemente usati, tra trasfezioni base di lipidi e trasfezioni calcio-fosfato, si basano sulla creazione di complessi chimico-DNA che vengono più efficacemente assorbiti dalle cellule. In generale, i metodi chimici non sono efficienti per la trasfezione di cellule T primarie. Il metodo biologico più comune è quella di utilizzare un vettore virale (ad esempio retrovirus o lentivirus), che inserisce direttamente RNA estraneo in un host come parte del suo ciclo di replica naturale. trasduzione virale richiede in genere più tempo per completare, soprattutto quando si tiene conto in tempo per la clonazione molecolare di plasmidi provirale. Inoltre, i vettori di trasduzione virali possono essere potenzialmente dannosi per i ricercatori umani. L&#39;elettroporazione è una m fisicoetodo di indurre permeabilizzazione della membrana sottoponendo cellule di impulsi di alta tensione, permettendo agli acidi nucleici di entrare transientemente nella cella dove possono agire per suo bersaglio. strumenti elettroporazione tradizionali non sono stati efficaci per trasfezione linfociti primari. Tuttavia, ottimizzato generazione elettroporazione accanto ha dimostrato di essere in grado di trasfettare cellule T ad altissima efficienza, specialmente quando il materiale da transfettate è piccolo RNA. La prossima generazione termine è genericamente usato per differenziare le due piattaforme più recenti (ad esempio, neon, Amaxa) dalle macchine tradizionali elettroporazione. Inoltre, questo metodo è facilmente scalabile per schermi di throughput moderati con fino a circa 120 piccoli RNA in un singolo esperimento, spesso utilizzando reagenti convalidati sintetici. Soprattutto, trasfezioni successo può essere raggiunto in appena 16 h dopo l&#39;attivazione delle cellule T. Lo svantaggio di questo metodo, tuttavia, è che non comporti stabile incorporati genomicasu, ed è quindi transitoria. Quindi, vale la pena lo sforzo supplementare per creare un costrutto di espressione stabile che può essere confezionato in un vettore virale ed espresso con successo in cellule T nei casi in cui è richiesta l&#39;espressione a lungo termine di un piccolo RNA. Abbiamo utilizzato un trasfezione prossima generazione (ad esempio, neon) per fornire diversi strumenti semplice o doppio filamento di RNA o LNA oligonucleotidici per scopi diversi 11, 12, 13. RNA interferenza efficiente può essere indotta nel topo primaria e cellule T umane usando RNA corto interferenti doppio filamento (siRNA). Questo protocollo descrive condizioni ottimizzate per l&#39;utilizzo di questa tecnica in cellule Th17 umane. Oltre a siRNA, disponibili in commercio imita miRNA sintetiche e inibitori possono essere utilizzati per studiare guadagno miRNA e perdita di funzione. imita miRNA sono molecole di RNA a doppio filamento molto simili a siRNA, ma designed con la sequenza dei miRNA maturi endogeni. inibitori miRNA sono chimicamente modificati RNA e / o LNA basato oligonucleotidi cavo rigido che si legano a miRNA nativi e antagonizzano la loro funzione. Abbiamo scoperto che tutti questi strumenti possono essere utilizzati efficacemente in coltura i linfociti T primari, compreso ma non limitato alle cellule Th17 umane.

<table><tbody><tr><td>anti-human IL-17A PE</td><td>ebioscience</td><td>12-7179-42&amp;nbsp;</td><td>Clone: eBio64DEC17</td></tr><tr><td>anti-human IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>Clone: 4S.B3</td></tr><tr><td>anti-human CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>Clone: SK3</td></tr><tr><td>mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>Clone: 11A9</td></tr><tr><td>anti-human RORgt AF647</td><td>BD biosciences</td><td>563620</td><td>Clone: Q21-559</td></tr><tr><td>anti-human CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>Clone: 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>For intracellular transcription factor flow cytometry staining</td></tr><tr><td>Hu FcR Binding Inhibitor Purified</td><td>ebioscience</td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>10981</td><td>&quot;Serum-Free Base Media&quot;</td></tr><tr><td>MACS CD28 pure functional grade, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>Clone: 15E8</td></tr><tr><td>anti-human CD3 Purified</td><td>UCSF monoclonal antibody core</td><td>N/A</td><td>Clone: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF purified anti-human IL-4</td><td>Biolegend</td><td>500815</td><td>Clone: MP4-25D2</td></tr><tr><td>anti-human IFNg, functional grade purified</td><td>ebioscience</td><td>16-7318-85</td><td>Clone: NIB42</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-23</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-1&amp;beta;</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human TGF-&amp;beta;1</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-6</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Control Pool, Non-targeting #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human RORC</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human PTPRC</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell Isolation Kit</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Next generation electroporation instrument</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System 10 &amp;mu;L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Resuspension Buffer T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Provided in kit (MPK1096)</td><td>&quot;Transfection Resuspension Buffer&quot;</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07801</td><td>Density Gradient Medium</td></tr><tr><td>costar 6-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>costar 48-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>Must make 1x solution with distilled water prior to use</td></tr></tbody></table>

small rna transfection in primary human th17 cells by next generation electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Il primo passo per lo sviluppo di un sistema affidabile di electroporating successo cellule Th17 umane era di generare robusta in vitro differenziato colture di cellule Th17 umane. Le cellule T coltivate in condizioni Th17 polarizzabili espresso il recettore delle chemochine CCR6 e il fattore di trascrizione RORγt (Figura 1A, sinistra). Questi marcatori non sono stati espressi quando le cellule T sono state coltivate in condizioni non polarizzante (THN) <strong...

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Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K Views.  University of California, San Francisco. Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Video: Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

Alta efficienza, sito-specifica trasfezione di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Bioingegneria

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Trasfezione altamente efficiente di umani THP-1 da macrofagi Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately understood, thus impeding the establishment of defined treatments. Cell-based additive gene therapies for the increased expression of a protective factor are considered as a promising option to medicate neurodegenerative diseases, such as age-related macular degeneration (AMD). We have developed a method for the stable expression of the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF), which is characterized as a neuroprotective and anti-angiogenic protein in the nervous system, into the genome of primary human pigment epithelial (PE) cells using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Primary PE cells were isolated from human donor eyes and maintained in culture. After reaching confluence, 1 x 104 cells were suspended in 11 &#181;L of resuspension buffer and combined with 2 &#181;L of a purified solution containing 30 ng of hyperactive SB (SB100X) transposase plasmid and 470 ng of PEDF transposon plasmid. Genetic modification was carried out with a capillary electroporation system using the following parameters: two pulses with a voltage of 1,100 V and a width of 20 ms. Transfected cells were transferred into culture plates containing medium supplemented with fetal bovine serum; antibiotics and antimycotics were added with the first medium exchange. Successful transfection was demonstrated in independently performed experiments. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) showed the increased expression of the PEDF transgene. PEDF secretion was significantly elevated and remained stable, as evaluated by immunoblotting, and quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-mediated transfer allowed for a stable PEDF gene integration into the genome of PE cells and ensured the continuous secretion of PEDF, which is critical for the development of a cell-based gene addition therapy to treat AMD or other retinal degenerative diseases. Moreover, analysis of the integration profile of the PEDF transposon into human PE cells indicated an almost random genomic distribution.

We have developed a protocol to transfect primary human pigment epithelial cells by electroporation with the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF) using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Successful transfection was demonstrated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR), immunoblotting, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Modificazione genetica basata sull'elettroporazione delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie utilizzando il sistema di trasposone della bella addormentata nel bosco

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Medicina

<meta charset="utf8"></head><body>Differenziazione cellulare Th17 da cellule T CD4+ naive mediante citometria a flusso

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ottenere la differenziazione in vitro ad alta purezza delle cellule Th17 utilizzando la modulazione della concentrazione di citochine

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

Differenziazione in vitro di cellule T CD4+ naive in cellule Th17 patogene nel topo

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

<meta charset="utf8"></head><body>Trasduzione retrovirale dell'RNA guida per l'editing genico nella differenziazione Th17

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>Targeting genico retrovirale mediato da CRISPR/Cas9 per lo studio della differenziazione Th17 in vitro

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

Targeting genico retrovirale mediato da CRISPR/Cas9 per lo studio della differenziazione Th17 in vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione

Riepilogo

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Modificazione genetica basata sull'elettroporazione delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie utilizzando il sistema di trasposone della bella addormentata nel bosco

Differenziazione in vitro di cellule T CD4⁺ naive in cellule Th17 patogene nel topo

Differenziazione in vitro di cellule T CD4⁺ naive in cellule Th17 patogene nel topo

Differenziazione in vitro di cellule T CD4⁺ naive in cellule Th17 patogene nel topo

Targeting genico retrovirale mediato da CRISPR/Cas9 per lo studio della differenziazione Th17 in vitro