Questo metodo dimostra la trasfezione basata sull'elettroporazione delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie utilizzando il sistema di trasposone della bella addormentata, una prova dell'espressione transgenica e della secrezione proteica. La combinazione del sistema di trasposone della bella addormentata nel bosco e dell'elettroporazione consente un'efficiente trasfezione delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie, nonché l'espressione transgenica stabile e persistente e la secrezione proteica. L'obiettivo generale è quello di stabilire una terapia di addizione genica basata su cellule per il trattamento delle malattie degenerative della retina, che richiede una secrezione stabile e persistente della proteina terapeuticamente attiva.
A dimostrare la procedura saranno Anne Freialdenhoven e Antje Schiefer, assistenti tecnici medici del laboratorio. Per preparare il DNA plasmidico per l'elettroporazione primaria delle cellule RPE umane, utilizzare uno spettrofotometro a microvolume per quantificare il contenuto di DNA plasmidico e regolare la concentrazione a 250 nanogrammi per microlitro in Tris-HCL da 10 millimolari. Mescolare un volume di 250 nanogrammi per microlitro di DNA plasmidico della trasposasi SB100X con 16 volumi di 250 nanogrammi per microlitro di DNA plasmidico derivato dal fattore di trasposone dell'epitelio pigmentato.
Aggiungere due microlitri della miscela di plasma risultante in un tubo di microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri di blocco sicuro su ghiaccio e riempire un tubo tampone con tre millilitri di tampone E.Quindi inserire il tubo nella stazione di pipetta fino a quando non si sente un clic e impostare il dispositivo di trasfezione su 1.100 volt, una larghezza di impulso di 20 millisecondi e due impulsi. Per preparare le celle per l'elettroporazione. In primo luogo, controllare la morfologia delle colture cellulari RPE primarie tramite microscopia a contrasto di fase per valutarne la crescita e la confluenza.
Trattare le cellule con 500 microlitri di 0,05% di tripsina EDTA per pozzetto per sette-15 minuti nell'incubatore di coltura cellulare. Quando le cellule si sono staccate, raccogliere le cellule mediante centrifugazione, risospendere le cellule in un millilitro di PBS e centrifugare da una a 10 volte 10 alle quattro aliquote cellulari per reazione di trasfezione. Risospendere i pellet in 11 microlitri di tampone R per tubo e aggiungere due microlitri della miscela plasmidica preparata a ciascun tubo.
Inserire la testa di una pipetta di trasfezione in una punta di trasfezione da 10 microlitri fino a quando il morsetto non raccoglie completamente lo stelo di montaggio del pistone e carica la cella e la soluzione plasmidica nella punta di trasfezione. Inserire la pipetta di trasfezione nel tubo tampone posto all'interno della stazione di pipetta fino a quando non si sente un clic e premere start per iniziare il processo di elettroporazione. Dopo la trasfezione, rimuovere con cautela la pipetta di trasfezione dalla stazione di pipetta e pipettare immediatamente la soluzione cellulare e plasmidica nei pozzetti preparati della piastra di coltura cellulare.
Per purificare le proteine di fusione del fattore derivate dall'epitelio pigmentato marcato da supernatanti di coltura cellulare RPE. In primo luogo, utilizzare una punta di taglio smussato per raccogliere un'aliquota da 30 microlitri di liquame NTA di nichel per campione e pellettare la resina NTA di nichel mediante centrifugazione. Risospendere con cautela la resina nichel NTA con 200 microlitri di tampone di incubazione One X e pellettare la soluzione con un'ulteriore centrifugazione due volte.
Dopo la seconda centrifugazione, risospendere accuratamente i pellet di resina di nichel NTA con 40 microlitri di tampone di incubazione Four X per campione. Quindi mescolare 55 microlitri di un'aliquota di liquame NTA di nichel pretrattato con 260 microlitri di tampone di incubazione Four X e 900 microlitri di ogni coltura cellulare RPE transefcted surnatant. Incubare la miscela su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente per 60 minuti e pellettare nuovamente le miscele di resina NTA nichel.
Risospendere con cura il pellet in 175 microlitri di tampone di incubazione One X e centrifugare le miscele altre due volte. Dopo la seconda centrifugazione risospendere accuratamente i pellet di resina di nichel NTA in 30 microlitri di tampone Elution per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente con agitazione e centrifugare nuovamente i campioni. Quindi raccogliere con cura i surnatanti e mescolarli con il tampone campione Two X SDS per l'analisi del sangue occidentale delle proteine purificate.
Le cellule RPE primarie coltivate isolate dagli occhi dei donatori umani dimostrano una tipica morfologia del ciottolo indipendentemente dall'età del donatore, dal tempo di isolamento post-mortem o dal tempo di coltivazione. L'applicazione di impulsi elettrici a breve termine a cellule RPE umane primarie. L'uso del sistema di trasfezione capillare non influisce negativamente sulla morfologia epiteliale.
L'analisi del sangue occidentale dei supernatanti primari di colture cellulari RPE primarie trasfettate dimostra la secrezione di fattori derivati dall'epitelio pigmentato a livelli costanti senza silenziamento transgenico per più di 500 giorni. Come osservato in questa analisi del sangue occidentale rappresentativa del terreno di coltura cellulare da trasfezioni eseguite in serie, un tasso di secrezione del fattore derivato dall'epitelio pigmentato universalmente più alto si osserva a 21 giorni dopo la trasfezione. In una cultura perseguita, la secrezione elevata di PEDF a lungo termine dura per almeno 165 giorni.
Inoltre, la quantificazione basata su ELISA rivela un aumento di 20 volte della secrezione totale del fattore derivato dall'epitelio pigmentato nelle cellule RPE umane primarie trasfettate rispetto alle rispettive cellule di controllo non trasfettate. Questo incremento è stato confermato anche al livello di espressione genica al quale l'espressione totale di PEDF è stata aumentata di oltre 30 volte. Quando si tenta questo protocollo, è importante utilizzare cellule epiteliali pigmentate la cui morfologia corrisponde allo stato In Vivo.
Inoltre, ricordarsi di aspirare la soluzione cellulare nella punta di trasfezione senza bolle d'aria. Le cellule stabilmente trasfettate possono essere utilizzate in diversi modelli Ex Vivo o In vivo per verificare la funzionalità di questa terapia di aggiunta genica basata su cellule.
