Questo lavoro è stato supportato dall'Agenzia della Repubblica Ceca, progetto P302-12-G157 Grant. Esperimenti sono stati supportati anche dalla CZ09 di programma di ricerca ceco-norvegese, che è sorvegliato da fondi norvegesi e dal Ministero della pubblica istruzione, gioventù e Sport della Repubblica Ceca (concessione numero: 7F14369).

<ol>
	<li>Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+damage+to+cellular+DNA:+direct+and+photosensitized+reactions.">Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions.</a> Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).</li><li>Cooke, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+detection+of+UV-induced+DNA+damage+and+repair.">Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair.</a> J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).</li><li>Lahtz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+irradiation+does+not+induce+detectable+changes+in+DNA+methylation+directly+following+exposure+of+human+cells.">Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).</li><li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+chromosome+aberrations+in+the+human+interphase+nucleus+by+visualization+of+specific+target+DNAs+with+radioactive+and+non-radioactive+in+situ+hybridization+techniques:+diagnosis+of+trisomy+18+with+probe+L1.84.">Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84.</a> Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).</li><li>Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+UV+microirradiation+of+interphase+nuclei+and+post-treatment+with+caffeine.+A+new+approach+to+establish+the+arrangement+of+interphase+chromosomes.">Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes.</a> Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).</li><li>Bartova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Oct4+protein+to+UV-damaged+chromatin+in+embryonic+stem+cells.">Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).</li><li>Stixova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1beta-dependent+recruitment+of+UBF1+to+irradiated+chromatin+occurs+simultaneously+with+CPDs.">HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs.</a> Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).</li><li>Stixova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microscopy+techniques+used+for+comparison+of+UVA-+and+gamma-irradiation-induced+DNA+damage+in+the+cell+nucleus+and+nucleolus.">Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus.</a> Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).</li><li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+is+recruited+to+various+types+of+DNA+damage.">Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage.</a> J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).</li><li>Bartova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coilin+is+rapidly+recruited+to+UVA-induced+DNA+lesions+and+gamma-radiation+affects+localized+movement+of+Cajal+bodies.">Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies.</a> Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).</li><li>Franek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Image+Acquisition+and+Analytical+Techniques+for+Studies+of+Living+Cells+and+Tissue+Sections.">Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).</li><li>Lemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+conventional+fluorescent+markers+for+far-field+fluorescence+localization+nanoscopy+allows+resolution+in+the+10-nm+range.">Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range.</a> J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).</li><li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fixed+to+FRAP:+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells.">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).</li><li>Lakowitz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+and+polarization-resolved+imaging+in+cell+biology.">Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology.</a> Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li><li>Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+cellular+proteins+that+bind+to+wild-type+but+not+mutant+p53.">Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Binding+protein+53BP1+is+required+for+DNA+damage+responses+and+tumor+suppression+in+mice.">p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice.</a> Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+order+in+HeLa+cells+changes+during+mitosis+and+early+G1,+but+is+stably+maintained+during+subsequent+interphase+stages.">Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages.</a> J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+silhouette+of+individual+cells+in+S/G2/M+phases+with+fluorescence.">Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence.</a> Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).</li><li>Sorokin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+movement+and+morphology+of+UBF1-positive+nucleolar+regions+are+changed+by+gamma-irradiation+in+G2+phase+of+the+cell+cycle.">Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle.</a> Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).</li><li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET:+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors.">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).</li><li>Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+detectors+improved+time-lapse+confocal+microscopy+of+PML+and+53BP1+nuclear+body+colocalization+in+DNA+lesions.">Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions.</a> Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).</li><li>Suchankova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+kinetics+of+DNA+repair+protein+accumulation+at+DNA+lesions+and+cell+cycle-dependent+formation+of+gammaH2AX-+and+NBS1-positive+repair+foci.">Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci.</a> Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).</li><li>B&#225;rtov&#225;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+is+recruited+to+irradiated+chromatin+in+late+S+phase+and+is+most+pronounced+in+G2+phase+of+the+cell+cycle.">PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle.</a> Protoplasma. , (2017).</li><li>Krejci, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Translational+Modifications+of+Histones+in+Human+Sperm.">Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm.</a> J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).</li><li>Chou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+localization+screen+reveals+poly+(ADP+ribose)-regulated+recruitment+of+the+repressive+polycomb+and+NuRD+complexes+to+sites+of+DNA+damage.">A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).</li><li>Sustackova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation-dependent+nuclear+arrangement+and+recruitment+of+BMI1+protein+to+UV-damaged+chromatin.">Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin.</a> J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).</li><li>Smirnov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+replication+and+transcription+domains+in+nucleoli.">Separation of replication and transcription domains in nucleoli.</a> J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).</li><li>Bastiaens, P. I., Squire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+spatial+resolution+of+biochemical+processes+in+the+cell.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell.</a> Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).</li><li>Day, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+interactions+using+Forster+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Methods. 66 (2), 200-207 (2014).</li><li>Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+multiphoton+cryomicroscopy.">High-resolution multiphoton cryomicroscopy.</a> Methods. 66 (2), 230-236 (2014).</li></ol>

Gli autori dichiarano che non esistono senza conflitti di interesse.

Tecniche di microscopia rappresentano strumenti fondamentali in laboratori di ricerca. Qui, una breve descrizione dei metodi utilizzati per lo studio del reclutamento di proteine e cinetica alle lesioni del DNA è presentato. Abbiamo notato soprattutto la nostra esperienza sperimentale nel campo della locale microirradiation di cellule viventi, e discutiamo lo studio della cinetica della proteina di interazione proteina-proteina e FRAP alle lesioni del DNA di candeggio accettore FRET28 e sua avanzata modifica FRET-FLIM (Figura 4A-D). I metodi qui illustrati sono strumenti essenziali per una vera comprensione di processi di riparazione del DNA, soprattutto la cinetica della proteina in sistemi cellulari viventi, come controllato da avanzati microscopi confocali6,7,8, 28. Questi metodi sono di immensa utilità per la medicina del futuro nel trattare con gli effetti della radioterapia su tessuti o che caratterizza la morfologia delle cellule del tumore. Per ottimizzare questo metodo, ci piacerebbe consigliamo di iniziare con ben noto interattori della proteina, come mostrato in Figura 4.
È noto che il reclutamento di proteine a lesioni del DNA è altamente dinamico e tempo-dipendente; così, l'applicazione di time-lapse microscopia confocale dopo irradiazione delle cellule è necessaria non solo nel campo della scienza di base, ma anche in cliniche26. Lesioni del DNA localmente indotte a causa di laser microirradiation9,28,29 rappresentano regioni genomiche, dove è possibile studiare il legame proteico di reclutamento, proteina-proteina o proteina-DNA e interazione. Il punto di partenza di questi metodi è che l'assunzione di proteine esogene deve essere verificata dagli anticorpi adatti a livello endogeno. Successivamente, il passaggio fondamentale di tali esperimenti è che over-transfected le cellule in grado di fornire risultati falsi-positivi; così, la decisione migliore è quello di stabilire linee cellulari che esprimono stabilmente le proteine fluorescente con tag di interesse. Inoltre, a causa degli effetti fototossici dei laser utilizzati per acquisizione di immagini, o le condizioni per la scansione devono essere ottimizzate o Trolox composto deve essere dissolto nel medium di coltura delle cellule. Inoltre l'eliminazione del passo del presensitization prima di irradiazione si consiglia. Dopo microirradiation locale, riparazione del DNA deve procedere tale che le cellule subiscono la mitosi (Figura 3A-B e Video 3). Induzione di apoptosi dopo irradiazione del laser è un processo meno prezioso dalla vista del DNA ottima riparazione23. È anche evidente che alcune proteine di riparazione del DNA riconoscano il danno del DNA solo nelle fasi di ciclo cellulare specifico (ad es., Bártová et al. 30). Pertanto, l'uso del sistema cellulare HeLa-Fucci, mostrando le cellule nelle singole fasi di interfase, è uno strumento utile per gli studi del DNA danno risposta. Inoltre, le fasi del ciclo cellulare possono essere riconosciuti secondo il modello di distribuzione nucleare della proteina PCNA31.
È noto che i metodi FRAP e FRET rappresentano strumenti molto utili per indagare le caratteristiche delle proteine che vengono reclutate per DNA lesioni7,8,32. Inoltre, la tecnica FLIM32 possono rivelare informazioni sui dinamici cambiamenti conformazionali delle proteine che si accumulano a lesioni del DNA. L'utilizzo di questo metodo è importante perché FLIM misura dinamici processi cellulari direttamente; quindi, l'intensità di fluorescenza allo steady-state è misurato nel tempo. FLIM approcci aumento del contrasto dell'immagine eliminando la fluorescenza di fondo. Questo è un vantaggio di misura FRET-FLIM rispetto ai convenzionali candeggio accettore FRET. Le durate di fluorescenza misurate di FLIM fornire informazioni circa le frazioni di proteine fluorescente e mostrare come eterogenico sonde sono dovuti a condizioni ambientali. FLIM è anche il migliore e più affidabile approccio biofisico all'esecuzione FRET per interazione proteina-proteina in vita cellule32,33.
Presi insieme, tutti i metodi descritti hanno il potenziale per rivelare nuovi meccanismi di risposta al danno del DNA in cellule umane, che è importante soprattutto per approcci radioterapeutici. Ad esempio, FLIM multifotonica è stato applicato per ottenere immagini ad alta risoluzione in medicina, dove si chiama tomografia multifotonica34. Questo metodo altamente sofisticato al microscopio può essere applicato nelle cliniche per la diagnosi di cancro utilizzando campioni di istochimici e analizzato con alta risoluzione. Metodi FLIM possono inoltre fornire una precisa analisi delle superfici delle cellule del tumore secondo loro autofluorescenza. Uno svantaggio del metodo di FLIM-FRET è lo sfondo di un software altamente sofisticato, che deve essere pienamente compreso da parte dell'operatore di microscopio. Ulteriore rilevanza biologica dei dati FLIM, in generale e nei processi di riparazione del DNA, sarà certamente rivelato nel prossimo futuro.

Danno del DNA porta alla comparsa di lesioni del DNA che consiste della pirimidina del cyclobutane (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine e single-strand o double-strand breaks1,2. Γ-raggi sono la forma di radiazione ionizzante con la più alta energia e alta penetranza, così questa fonte di radiazione è ampiamente usata in radioterapia3. D'altra parte, sperimentalmente indotto danni al DNA causati da UV laser imita naturale esposizione ai raggi UV. Microirradiation UVA, come un metodo microscopico, rappresenta uno strumento sperimentale per lo studio di danno del DNA in cellule viventi individuali. Microirradiation è stato usato per la prima volta 40 anni fa per rivelare l'organizzazione delle regioni del cromosoma4,5. Questa tecnica è altamente dipendente le proprietà funzionali di microscopi confocali o i limiti tecnici di nanoscopia moderno. Per indurre lesioni del DNA, le cellule possono essere presensitized da 5' bromodeossiuridina (BrdU) o Hoechst 33342 prima dell'irradiazione UV. Bártová et al. 6 precedentemente descritto il passo presensitization e recentemente abbiamo ottimizzato questa tecnica microirradiation al fine di evitare la morte cellulare o apoptosi. Ad esempio, l'uso di un laser UV 405 nm (senza Hoechst 33342 presensitization) porta all'induzione del doppio-filo di 53BP1-positivi (DSBs) a scapito di dimeri di pirimidina cyclobutane (CPDs). D'altra parte, presensitization passi combinati con UV microirradiation inducono livelli molto elevati di CPDs e DSBs contemporaneamente7,8. Questa metodologia è difficile da applicare allo studio di una singola via di riparazione del DNA.
Con microirradiation, è possibile analizzare l'assunzione di proteine, cinetica e interazione alle lesioni del DNA in cellule viventi. Un esempio di questo metodo è stato pubblicato da Luijsterburg et al. 9 per eterocromatina proteina 1 β e ci ha mostrato recentemente per la prima volta che il fattore di pluripotenza Oct4 e una proteina connessa con corpi di Cajal, coilina, sono reclutati per le lesioni del DNA indotto da UV6,10. Cinetica della proteina in queste lesioni del DNA possono anche essere studiati utilizzando il FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)11,12,13 o FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) tecniche14 ,15. Questi metodi hanno il potenziale per rivelare semplice diffusione delle proteine alle lesioni del DNA o interazioni proteina-proteina. Uno strumento utile per ulteriore caratterizzazione delle proteine è FLIM (fluorescenza Lifetime Imaging microscopia) o la sua combinazione con FRET tecnologia (FRET-FLIM)16. Questi metodi consentono lo studio dei processi in cellule che sono stabilmente viventi o transitoriamente esprimenti la proteina di interesse contrassegnati da una molecola fluorescente17. Qui, è riportato un esempio del tempo di decadimento esponenziale (τ) per proteina GFP-etichettato p53 e il suo partner di interazione, mCherry-etichetta 53BP1, giocando un ruolo importante nel DNA danni risposta18,19 . Il parametro τ, la durata del fluorocromo fornito da calcoli di FLIM, è specifico per una tintura di fluorescenza determinata, le sue abilità di associazione e il suo ambiente cellulare. Pertanto, questo metodo può mostrarci distinzioni tra sottopopolazioni di proteina, le loro capacità di associazione e le loro proprietà funzionali dopo, ad esempio, il danno del DNA.
Qui, un contorno di approcci metodologici delle tecniche di microscopia avanzata che viene utilizzato nel nostro laboratorio per studiare il reclutamento di proteine specifiche del tempo, cinetica, diffusione e interazioni proteina-proteina nel sito della cromatina microirradiated è presentato. La metodologia dettagliata per l'induzione di lesioni locali del DNA in cellule viventi e una descrizione delle metodologie utili per studi di eventi relativi a DNA-danno alle lesioni del DNA localmente indotte causate da laser UV sono forniti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES-D3 [D3]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11632TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa -Fucci cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td>P03-0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30180.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES Cell FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTG (1-Thioglycerol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>XC-A4122/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>XC-T1717/100</td>
			<td>dilute with 1 &#215; PBS in ratio 1:6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7866</td>
			<td>cultivation of mESCs D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35m+A15:I35m Grid-500</td>
			<td>Ibidi GmbH</td>
			<td>81166</td>
			<td>microscopic dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2% Gelatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td>dilute in destille water and autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-p53 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-PCNA plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universit&#228;t Darmstadt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-53BP1 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>19835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metafecetene</td>
			<td>Biontex Laboratories GmbH</td>
			<td>T020&#8211;2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#215; PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>for transfection use 1 &#215; PBS diluted in nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#8217;-deoxy-uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11296736001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White-light laser</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>355-nm laser</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>laser power 80 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405-nm laser</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>laser power 50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunofluorescence staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>631-1580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943 1 LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2194854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin from quillaja bark</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>53BP1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21083</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluore 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories Ltd</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced confocal microscopy techniques to study protein-protein interactions and kinetics at dna lesions

Microirradiation locale con laser rappresenta uno strumento utile per gli studi del DNA-riparazione-processi in cellule vive. Qui, descriviamo un approccio metodologico per l'analisi cinetica della proteina alle lesioni del DNA nel corso del tempo o proteine interazioni su localmente microirradiated della cromatina. Mostriamo anche come riconoscere le singole fasi del ciclo cellulare usando il sistema cellulare di Fucci per studiare la cinetica di cellula-ciclo-dipendente della proteina alle lesioni del DNA. Una descrizione metodologica dell'uso di due laser UV (355 nm e 405 nm) per indurre diversi tipi di danno del DNA inoltre è presentata. Solo il microirradiated di cellule dal laser del diodo di 405 nanometro procedeva normalmente attraverso mitosi ed erano privi di dimeri di pirimidina cyclobutane (CPDs). Mostriamo anche come cellule di microirradiated possono essere risolto in un punto determinato momento per eseguire immunodetection di proteine endogene di interesse. Per gli studi di riparazione del DNA, descriviamo inoltre l'uso di metodi biofisici compreso FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) e FLIM (fluorescenza Lifetime Imaging microscopia) nelle cellule con spontaneamente d'avvenimento i fuochi di danni del DNA. Mostriamo anche un'applicazione di FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) negli studi sperimentali delle interazioni proteina-proteina.

Usando la microscopia confocal avanzata, abbiamo osservato un accumulo di proteine 53BP1 e mCherry-PCNA mCherry-etichettate alle lesioni del DNA. Analisi sono state eseguite da microirradiation locale di cellule viventi. Per riconoscere i modelli di distribuzione nucleare delle proteine correlate a DNA-repair in fasi del ciclo cellulare individuale, abbiamo usato il sistema cellulare di Fucci, mediante il quale è possibile determinare il G1, primi S, e G2 fasi della cella ciclo (Figura 1). L'applicazione biologica del modello cellulare Fucci che abbiamo pubblicato in Suchankova et al. 26 dimostra che 53BP1 è stato reclutato per lesioni del DNA localmente indotte nelle fasi G1, S e G2 del ciclo cellulare, che è stato associato con la funzione di questa proteina durante fine non-omologo unendo (NHEJ), uno dei principali meccanismi responsabili del riparazione di rotture a doppio filamento. D'altra parte, questo sistema sperimentale ci ha mostrato il livello cellulare individuo che la proteina PCNA, che è legata alla via riparazione per ricombinazione omologa (HRR), riconosce DSBs nelle fasi di fine S e G2 del ciclo cellulare 27. Per gli studi sulle macchine di riparazione del DNA, abbiamo ottimizzato anche condizioni di irraggiamento al fine di garantire che le colture cellulari hanno continuato a subiscono la mitosi dopo l'esposizione a laser UV (Figura 3). Microirradiated cellule che subiscono la mitosi dimostrano che, in queste condizioni sperimentali, proventi di riparazione del DNA in maniera relativamente fisiologica e le cellule non sono stati feriti dai laser, che a più alta intensità inducono apoptosi. Qui, indichiamo anche come applicare analisi FRET-FLIM alla caratterizzazione delle proteine di riparazione del DNA. Questa tecnologia avanzata permette di studiare locale interazioni della proteina-proteina nel nucleo della cellula o, in alternativa, interazioni della proteina nelle regioni nucleolare come il nucleolo, lamina nucleare o cluster di eterocromatina. Per i principianti in questa tecnologia, vorremmo consigliamo di ottimizzare questa tecnica FRET-FLIM utilizzando ben noto interattori della proteina come p53 e 53BP1 (fig. 4A-C). In generale, una conoscenza dell'interazione proteina-proteina conduce alla comprensione di come i complessi della proteina regolano processi come replica, attivazione del gene, silenziamento o la riparazione del DNA. Inoltre, uno strumento molto utile per gli studi di cinetica della proteina è il metodo FRAP, che mostra le caratteristiche di diffusione locale della proteina e mobilità (Figura 4). Presi insieme, qui forniamo istruzioni metodologiche per l'applicazione di tecniche di microscopia confocale avanzata nel DNA riparazione studi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55999/55999fig1.jpg"> 
Figura 1: formazione di foci di riparazione del DNA può essere studiata in cellule HeLa-Fucci che esprimono RFP-cdt1 (rosso) nelle fasi G1/inizio S e GFP-geminina (verde) nelle fasi S/G2 del ciclo cellulare. Lesioni del DNA spontaneamente d'avvenimento positive per proteina 53BP1 (blu; Alexa 405 colorazione), sono stati studiati in G1 (rosso), primi S (arancio; espressione di GFP-geminina e RFP-cdt1) e G2 (verde) fasi del ciclo cellulare. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55999/55999fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55999/55999fig2.jpg"> 
Figura 2: reclutamento di PCNA mCherry-etichetta alle lesioni del DNA nel corso del tempo. (A) cellule che esprimono mCherry-PCNA (rosso), si trovavano su un piatto di griglia microscopio in regioni selezionate (grigio). Dopo la fissazione e immunostaining, cellule irradiate (frecce gialle) sono state situate in base alle coordinate registrate (vedere la lettera grigia K come esempio) (Aa-c). La cornice gialla e frecce (annuncio) Visualizza la cella che è stata ingrandita in pannelli Ae-f e microirradiated. (B) accumulo di mCherry-PCNA (rosso) è stato studiato in cellule HeLa, che esprimono GFP-etichettato istone H2B (verde). Le cellule sono state controllate immediatamente dopo microirradiation locale per fino a 35 min (Vedi Video 1). (C) Microirradiated cellule sono state analizzate mediante microscopia confocale 3D e accumulo di proteine alle lesioni del DNA (per esempio, mCherry-53BP1) è stato trovato in tutte le tre dimensioni (x-y, - z, x e y-z), anche se solo la parte centrale del nucleo della cellula era microirradiated (vedere rotazione 3D-cell nelle proiezioni 3D Video 2 in Figura 2). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55999/55999fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55999/55999fig3.jpg"> 
Figura 3: cellule microirradiated da un diodo laser 405 nm procedere normalmente durante il ciclo cellulare. (A) dopo irradiazione utilizzando un laser a diodi di 405 nm, cellule HeLa (stabilmente esprimenti GFP-istone H2B; verde) subiscono la mitosi (Vedi anche Video 2). Cornici e frecce gialle indicano irradiati ROI nelle celle selezionate. Cornici bianche Visualizza mitosi. (B) alle stesse condizioni sperimentali, mitosi in cellule irradiate inoltre è stata osservata da microscopia di lasso di tempo in cellule HeLa che esprimono GFP-H2B (verde) e transitoriamente esprimendo mCherry-PCNA (rosso). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55999/55999fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55999/55999fig4.jpg"> 
Figura 4: analisi FLIM e FRET-FLIM di GFP-p53 e mCherry-53BP1. Fluorescenza risonanza Energy Transfer (FRET) rilevato da FLIM e applicazione di Fluorescence Recovery After Photobleaching(FRAP) alle varie lesioni del DNA. ( A-C) Media (n = 10) vite di GFP-etichettato p53 in assenza e in presenza di acceptor (mCherry-53BP1), misurata in tutta nonreplicating nuclei delle cellule HeLa. (A) curve di decadimento fluorescenza rappresentativo e residui studiato in cellule HeLa transitoriamente che esprimono GFP-p53 (solo donatore, τD) o GFP-p53 e mCherry-53BP1 (donatore-accettore, τDA). (B) media durata (τ1 - τ3) e ampiezze (A1 -3) di (un) GFP-p53 e (b) mCherry-53BP1 misurato nei nuclei delle cellule HeLa intero. Χ2 valori inoltre sono stati calcolati e sono mostrati. (C) sintesi di efficienza di apprensione per il ben noti interattori GFP-p53 e mCherry-53BP1. Scala bar = 4-5 µm. FRET-FLIM risultato visualizzando ~ 35% FRET efficienza per interazione ben noto partner GFP-etichettato p53 e 53BP1 mCherry-etichetta. (D) Cinetica di recupero di mCherry-53BP1 studiato alle lesioni del DNA spontaneamente (curva verde) e lesioni del DNA indotto UVA (curva blu). mCherry alle lesioni del DNA era sbiancato al livello dello sfondo (disperso forma di proteina di mCherry-53BP1 protein), e la fluorescenza di fondo è stato sottratto da ogni valore. DATA, mostrato come intensità di fluorescenza relativa di mCherry-53BP1, sono presentati come mezzi ± errore standard. Test t di Student ha rivelato una differenza statisticamente significativa tra i due tipi di lesioni del DNA (* Mostra p ≤ 0.05). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55999/55999fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55999/55999video1.jpg"> 
Video 1: assunzione della proteina PCNA mCherry-etichetta (fluorescenza rossa) a lesioni del DNA indotte da microirradiation locali in HeLa cellule stabilmente esprimenti GFP-etichettato dell'istone H2B (fluorescenza verde). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55999/Video1.rar">Per favore clicca qui per scaricare questo video.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/55999/55999video2.jpg"> 
Video 2: accumulo di proteina mCherry-etichetta 53BP1 (fluorescenza rossa) alle lesioni del DNA indotte da locale microirradiation in cellule HeLa. Il nucleo cellulare è mostrato nello spazio 3D utilizzando una modalità di software che consente la visualizzazione di rotazione delle cellule nello spazio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55999/Video2.rar">Per favore clicca qui per scaricare questo video.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/55999/55999video3.jpg"> 
Video 3: Microirradiated HeLa delle cellule che esprimono GFP-etichettato istone H2B (verde fluorescenza) procedere attraverso mitosi. La regione irradiata è caratterizzata dallo svuotamento di GFP-H2B (regioni nere sono irradiati strisce all'interno dei nuclei delle cellule). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55999/Video3.rar">Per favore clicca qui per scaricare questo video.</a>

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Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

advanced-confocal-microscopy-techniques-to-study-protein-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  Institute of Biophysics of the Czech Academy of Sciences. Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

Video: Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Ricerca

Biologia

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caratterizzazione di calcificazione eventi utilizzando dal vivo ottica ed elettronica Microscopia tecniche in un tubeworm Marine

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Studio delle interazioni proteina-proteina nella ricerca di autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) provide accurate information about PPIs in live cells. FLIM-FRET relies on measuring the fluorescence lifetime decay of a FRET donor at each pixel of the FLIM image, providing quantitative and accurate information about PPIs and their spatial cellular organizations. We propose here a detailed protocol for FLIM-FRET measurements that we applied to monitor PPIs in live Pseudomonas aeruginosa in the particular case of two interacting proteins expressed with highly different copy numbers to demonstrate the quality and robustness of the technique at revealing critical features of PPIs. This protocol describes in detail all the necessary steps for PPI characterization - starting from bacterial mutant constructions up to the final analysis using recently developed tools providing advanced visualization possibilities for a straightforward interpretation of complex FLIM-FRET data.

We describe here a protocol to characterize protein-protein interactions between two highly-differently expressed proteins in live Pseudomonas aeruginosa using FLIM-FRET measurements. The protocol includes bacteria strain constructions, bacteria immobilization, imaging and post-imaging data analysis routines.

Misurazioni FLIM-FRET delle interazioni proteina-proteina nei batteri vivi.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

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Imaging interazioni proteina-proteina In vivo