L'immunofluorescenza indiretta consente di rilevare proteine di riparazione del DNA, foto di reclutamento spaziale e temporale e aiuta a interrogare le interazioni proteicheproteine nel sito di danni al DNA. A seguito del danno al DNA, le proteine di riparazione del DNA vengono reclutate nell'insulto del DNA mentre la loro concentrazione aumenta localmente, e formano gruppi chiamati focolai che possono essere visualizzati dall'immunofluorescenza indiretta su campioni fissi. Questa tecnica può essere utilizzata per rilevare i focolai proteici, nonché per quantificare la colocalizzazione del presente nelle cellule.
Questo può aiutare a spiegare la sequenza di eventi necessari per la formazione complessa e per la riparazione del DNA. particolari interazioni con la proteinaproteina possono essere implicate da tali esperimenti. A dimostrare la procedura sarà Barbara De La Pena, una foto Postdoc di grande talento del mio laboratorio Begin coltivando 40.000 cellule HeLa in ogni piastra di pozzo ben oltre 12 con una coverlip di vetro rotonda di 18 millimetri all'80% di confluenza.
Dopo aver esposto le cellule a quattro irradiazioni gamma grigie, lavarle due volte con un millilitro di PBS. Quindi rimuovere completamente il PBS e aggiungere 200 microlitri di NDB a ciascun pozzo. Incubare le cellule per due minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere l'NDB.
Tieni presente che il tempo di incubazione può variare a seconda della linea cellulare, ma generalmente non deve superare i due minuti. Lavare le cellule con un millilitro di PBS. Quindi rimuovere completamente il PBS e aggiungere 200 microlitri del 4%PFA a ciascun pozzo per la fissazione delle celle.
Incubare le cellule per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere il PFA e aggiungere un millilitro di PBS ad ogni pozzo. Rimuovere completamente il PBS e quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di blocco a ciascun pozzo e incubare le cellule per due ore a temperatura ambiente o da 16 a 18 ore a quattro gradi Celsius.
diluire l'anticorpo primario e il tampone di diluizione e vortice fino a quando ben miscelato in una scatola di umidità e qui un pezzo di parafilm e aggiungere 10 microlitri di anticorpo primario in una singola goccia. Allineare un bordo del coverslip dal pozzo con la goccia e abbassarlo lentamente sul parafilm che diffonde il liquido. incubare il coverslip per due ore a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione lavare il coperchio scivola tre volte in PBS per un minuto per lavaggio. diluire l'anticorpo secondario e il tampone di diluizione e vortice fino a quando ben miscelato applicare 10 microlitri di anticorpo secondario su ogni coverlip come descritto in precedenza e incubarlo per due ore a temperatura ambiente protetta dalla luce. Lavare il coperchio scivola tre volte con PBS e una volta con acqua per un minuto per lavaggio.
Quindi montarli su vetrini con un supporto di montaggio a base di glicerolo contenente coperchi di tenuta DAPI con smalto trasparente e lasciarli asciugare per 20 minuti. Posizionare una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo 60 x e utilizzare DAPI per localizzare i nuclei attraverso l'oculare per l'acquisizione di immagini XYZ, aprire il software di acquisizione e impostare il tipo di scanner come galvano il tipo di scanner come andata e getta e 512 per 512 dimensioni dell'immagine. Nel pannello PMT impostare la modalità su MEDIA VBM su frame e scansione sequenziale su linea.
Successivamente impostare i rilevatori di colorante e calore impostare il canale uno su DAPI e SD uno, il canale due su alexafluor 488 e HSD tre e il canale tre ad alexafluor a 647 e HSD quattro selezionare su per Z.To regolare l'immagine dal vivo, premere il pulsante live sulla finestra dal vivo e regolare la messa a fuoco. Quindi utilizzare la finestra degli strumenti PMT per impostare la sensibilità all'intensità del laser, il guadagno e l'offset per le pile z, selezionare start-to-end e 15 fette. Selezionare la cartella per salvare le immagini e premere il pulsante Start di LSM per iniziare ad acquisire.
Al termine, premere il pulsante di fine serie per completare l'acquisizione dell'immagine. Aprire il software di analisi, quindi premere la finestra degli strumenti batch e selezionare le immagini da analizzare. Passare alla finestra degli strumenti di analisi e selezionare la proiezione, che mostrerà la proiezione di intensità massima da 15 fette.
Nell'impostazione di output di input selezionare il batch e la cartella di output creati. Premere il processo per l'elaborazione delle immagini ed esportare le immagini come file TIFF. Eseguire la quantificazione nucleare con cellprofiler secondo le indicazioni manoscritte.
Le cellule non trattate con la radiazione presentano pochissimi segni di esposizione gamma H2AX. In assenza di proteine essenziali di riparazione del DNA, l'accumulo di gamma H2AX può essere osservato durante le rotture del DNA. L'accumulo di rotture non ripaatrici può portare le cellule a diventare pre ipotoniche indicate dai nuclei gamma h2AX solidi.
Dopo l'irradiazione, i nuclei presentano un gran numero di rotture a doppio filamento a cui la gamma H2AX si localizza estremamente rapidamente. Mentre in assenza di una radiazione si osservano pochi focolai in assenza di radiazioni, il numero di fuochi è stato quantificato in due quattro e 16 ore dopo una radiazione e per il controllo delle radiazioni NOA. A seconda della questione biologica sollevata e del tipo di dati richiesti, diverse opzioni di plottaggio dovrebbero essere considerate La colocalizzazione può essere studiata multiplexando gli anticorpi primari sollevati in diverse specie animali e utilizzando anticorpi secondari, etichettati con fluorofori distinti.
Sovrapposizione di verde e rosso, dà origine a hotspot gialli, le due proteine di interesse sono presenti negli stessi pixel. L'analisi quantitativa della colocalizzazione può essere ottenuta con un approccio basato su oggetti o con un approccio statistico che esegue analisi basate sui coefficienti di correlazione di intensità. Una combinazione di anticorpi primari allevati in diverse specie animali, può essere utilizzata in questo protocollo.
Assicurarsi che gli anticorpi siano compatibili e non interferiscano tra loro. È necessario impostare in modo appropriato l'anticorpo secondario da utilizzare rispetto a ciascuno degli anticorpi primari e considerare una particolare sovrapposizione spettrale quando si seleziona la minore forza da utilizzare. La colocalizzazione o le proteine indicano possibili interazioni dirette.
Questo può essere verificato mediante precipitazione granulare nelle cellule o mediante put down diretto utilizzando proteine purificate in vitro.
