Name: a method for growing bio-memristors from slime mold
Uploaded: 2017-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
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Questa ricerca è stata finanziata dalla scuola di scienze umanistiche dell'Università di Plymouth e Performing Arts. Gli autori desidera ringraziare Functionalize per la fornitura di campioni del loro PLA conduttivo.

1. fabbricazione di un recipiente stampato 3D <ol><li>Chambers, coperchi e base <ol><li>carico un 3D stampante con polistirene antiurto (HIPS) utilizzando l'interfaccia della stampante per impostare la temperatura di stampa letto a 85 ° C e l'estrusore a 230 ° C. Quando le temperature sono raggiunte, allentare il braccio della puleggia folle, inserire il filamento e spingere verso il basso fino a quando non inizia a estrudere dalla fine della calda. Quindi, serrare nuovamente il braccio della puleggia folle filamento e rimuovere il materiale estruso.</li>
		<li>Importare il file di modello di recipiente 3D STL in una stampa 3D affettare software, che normalmente può essere raggiunta passando alla scheda file e selezionando le opzioni di importazione/Apri ( Figura 2).</li>
		<li>Se affettare software offre alta e bassa impostazioni di stampa di qualità, selezionare alta qualità garantendo al contempo che sia selezionato il profilo materiale corretto. 
		Nota: Se stampa recipienti diversi in una sola volta, assicurarsi che il software è impostato per stampare ogni oggetto uno alla volta. Se viene saltato questo passaggio, la qualità di stampa può essere ridotta, che probabilmente causerà problemi di tolleranza durante il montaggio le parti insieme.</li>
		<li>Una volta completata la stampa, attendere che la temperatura di stampa letto è inferiore a 50 ° C per rimuovere le parti.</li>
		<li>Delicatamente con una spazzola di filo sottile, deselezionare il socket di elettrodo di eventuali imperfezioni che possono causare ostruzioni durante il montaggio della camera con un elettrodo.</li>
	</ol></li> <li>Elettrodi <ol><li>sostituire il filamento fianchi per un filamento di pulizia ed eseguire un sacco di materiale attraverso la testina di stampa.</li>
		<li>Caricare la stampante con un filamento di acido (PLA) elettricamente conduttivo polilattico che ha una resistività di volume o meno 0.75 Ω-cm.</li>
		<li>Impostare la temperatura di stampa letto a 60 ° C e l'estrusore a 230 ° C (Vedi punto 1.1.1 per l'orientamento).</li>
		<li>Quando le temperature sono raggiunte, estrudere parecchi centimetri del filamento attraverso la testina di stampa. Questo processo contribuirà a garantire che tutte le particelle dalle sessioni precedenti vengono rimossi.</li>
		<li>Utilizzando una stampa 3D affettare software, caricare il file STL elettrodo ( Figura 3).</li>
		<li>Nelle impostazioni di stampa, specificare quanto segue: altezza di strato = 0,16 mm, lo spessore del guscio = 1,7 mm, spessore della parte inferiore/superiore = 0,74 mm, densità di riempimento = 100% ( Figura 4).</li>
		<li>Se stampa parecchi elettrodi in una sola volta, impostare la stampante per stampare uno alla volta.</li>
		<li>Una volta stampato, lasciare gli elettrodi sul letto di stampa fino a quando si saranno raffreddate a temperatura ambiente. In questo modo la parte non diventare deformata e deformata.</li>
	</ol></li> <li>Montaggio presa <ol><li>Slot un elettrodo in ciascuna delle due camere. Se passo 1.1.5 è stata completata correttamente, gli elettrodi dovrebbero andare negli alloggiamenti senza molta forza.</li>
		<li>Utilizzando un bisturi affilato, tagliare un pezzo di 10 mm di cloruro di polivinile (PVC) tubo (diametro interno 4 mm e diametro esterno 6 mm) avendo cura di assicurare che ogni fine è tagliato dritto ed in modo pulito.</li>
		<li>Smuoverlo con ogni estremità del tubo del PVC 10 mm oltre il bordo dei due elettrodi.</li>
		<li>Una volta collegato, le due camere di clip nella base.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparazione del recipiente e il p. polycephalum inoculazione <ol><li>preparazione media 2% agar <ol><li>mettere 2 g di agar microbiologica non-sostanza nutriente polvere in un flacone di vetro da 250 mL.</li>
		<li>Aggiungere 100 mL di acqua deionizzata e mescolare bene.</li>
		<li>Autoclave la bottiglia per 12-15 minuti a 121 ° C o posto in un bagno di acqua bollente per 15-20 min.</li>
	</ol></li> <li>Impostazione il substrato di agar nel recipiente &#39; chambers s <ol><li>sciogliere l'agar utilizzando un bagno d'acqua o un forno a microonde.</li>
		<li>Riempire una pipetta 2ml con agar fuso.</li>
		<li>Riempire ogni del recipiente &#39; chambers s passando la punta della pipetta circa 5 mm di sopra della base interna e lentamente riempiendo i pozzetti fino al fondo del collegamento tubo foro.</li>
		<li>Immediatamente dopo aver riempito i pozzetti, mettere un coperchio su ciascuno degli alloggiamenti e accantonato il recipiente fino a quando l'agar ha fissato e raggiunto la temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Il p. polycephalum inoculazione <ol><li>inserire un fiocco di avena in ciascuna delle due camere.</li>
		<li>Rimuovere un blob di 2 mL di pseudopodi da un affamato (circa 12 h) cultura del plasmodium e inserirlo in una delle due camere. Per promuovere la crescita rapida, cercare di prendere il protoplasma dai più attivi anteriore dell'organismo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chua, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memristor-The+Missing+Circuit+Element.">Memristor-The Missing Circuit Element.</a> IEEE Transactions on Circuit Theory. 18 (5), 507-519 (1971).</li><li>Trefzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memristor+in+a+Nutshell.">Memristor in a Nutshell.</a> Guide to Unconventional Computing for Music. , 159-180 (2017).</li><li>Strukov, D. B., Snider, G. S., Stewart, D. R., Williams, R. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questa carta ha presentato un metodo per la coltivazione memristors fuori il mixomicete il p. polycephalum. L'organismo è cresciuto all'interno di recipienti di stampati 3D che sono stati progettati per superare alcuni dei limiti che sono associati all'implementazione del bio-memristors. Tali limitazioni includono il tempo di setup, tempo di crescita del campione e mancanza di standardizzazione per le condizioni di crescita di campione a campione e osservazioni elettriche.
Il nostro recipiente è stato rivelato nel 2015 nel materiale pubblicitario stampato per il 2016 penisola Arts Contemporary Music Festival (PACMF) e il rispettivo sito Web15. Qui, la nostra tecnologia è stata usata per sviluppare un sistema di musica interattiva di hardware-bioware ibrido che è stato in grado di generare gli accompagnamenti musicali per un musicista dal vivo. In riferimento14, abbiamo riportato sul test approfonditi del nostro ricettacolo e confrontato i risultati contro precedenti approcci9,10. A seguito di questi sviluppi, un altro gruppo di ricercatori successivamente esplorato creando ambienti di crescita per lo studio thermistive proprietà16 dell'organismo, ma queste non sono le stesse proprietà di memristive. Ci sono, tuttavia, solo stati due altri tentativi di sviluppare un approccio controllato ad attuare il p. polycephalum memristors13,17. In questi esperimenti, pozzi sono stati realizzati in un materiale simil-gel biocompatibile elastomero chiamato polidimetilsilossano (PDMS), e gli elettrodi sono stati creati utilizzando vari metalli o poly(3,4-ethylenedioxythiophene):poly(styrene sulfonate) (PEDOT:PSS). Anche se questi materiali sono abitualmente utilizzati in elettronica, microfluidica e ingegneria bionico, sono costosi e richiedono alcune competenze da utilizzare. Ad esempio, PEDOT:PSS ha bisogno di rivestimento per rotazione e anti-doping per migliorare la sua conducibilità. Di conseguenza, le tecniche sono fuori portata per le persone che non hanno accesso a risorse specialistiche. I recipienti presentati in questo articolo utilizzano metodi e materiali che sono facilmente accessibili e poco costoso. Inoltre, il design offre un ambiente ospitale per il plasmodio all'habitat, che è in contrasto con gli altri il p. polycephalum memristor prototipi dove è stato effettuato nessun tentativo di mantenere viva la cella per qualsiasi durata di tempo.
Fino ad ora, è stato difficile ottenere misure coerenti I-V utilizzando metodi precedenti per la coltura dell'organismo su piastre di Petri (Figura 5, sinistra). I nostri metodi sono migliorato significativamente questo scenario (Figura 6). I risultati del nostro recipiente test hanno dimostrato che il design ha ridotto il tempo di crescita, ha aumentato la durata della vita, standardizzata le risposte componente e creato un microambiente protetto per incapsulare l'organismo. Inoltre, il dispositivo fornisce mezzo fattibile per integrare l'organismo come un componente di uno schema elettrico.
Il metodo proposto consente di attenuare una serie di questioni legate alla sfruttando il p. polycephalum memristors all'interno di impianti elettrici. Esistono, tuttavia, limiti che richiedono un'ulteriore ricerca e sviluppo. In primo luogo, condensazione può raccogliere sulla superficie interna del tubo di collegamento se i recipienti sono sottoposti ad un rapido cambiamento di temperatura o se viene applicata una tensione elevata per lunghi periodi. Quest'ultimo è dovuto la resistenza dell'organismo alta causando energia elettrica per essere trasferito in calore. Se significativa, la condensa può creare un percorso di resistente basso tra i due elettrodi alle estremità del tubo di raccordo. Questa limitazione può essere gestita efficacemente assicurando che la memristors non siano sovraccaricati. In secondo luogo, la resistenza complessiva di memristors prodotta utilizzando il metodo proposto può variare da componente a componente. Tale fenomeno può essere un risultato dell'approccio non limitando il diametro esterno del tubo protoplasmatico. Di conseguenza, gli utenti potrebbero dover incorporare un processo di calibrazione nella loro applicazione della memristors.
Grazie a questa metodologia, possiamo ora cominciare a studiare i processi biologici che provocano le osservazioni memristive nel p. polycephalum. È probabile che tali processi hanno parametri dinamici che potremmo essere in grado di sfruttare per aumentare l'utilizzo dell'elemento. Abbiamo iniziato in esecuzione alcuni esperimenti preliminari in cui sono alterate concentrazioni di ioni extracellulari a rivedere se canali ionici voltaggio-dipendenti svolgono un ruolo nella memristance.
I recipienti presentati sono stati progettati esclusivamente per il p. polycephalum memristors di esecuzione. Questi dispositivi sono probabili, tuttavia, avere usi di là di quella di implementazione di un singolo componente. Ad esempio, in riferimenti12,18, il tubo protoplasmica è stato studiato come un filo biologico autoassemblanti e ripristino automatico. In entrambe queste indagini, i ricercatori hanno espresso che era necessario ulteriore lavoro per stabilire metodi di coltivazione il tubo protoplasmica secondo uno schema. I recipienti ha presentato in questa carta forniscono un metodo di delineare la produzione del tubo tra due, o potenzialmente più punti. La figura 7 Mostra due fotografie che illustrano che i recipienti possono essere utilizzati per crescere sani tubi alle lunghezze più di 100 mm. In riferimento18, è stata studiata la funzione di trasferimento del tubo protoplasmatica. Risultati da questa indagine hanno indicato che l'agar richiesto per coltivare i tubi può causare un problema se l'organismo è stato quello di essere integrato in un impianto elettrico. Ciò è dovuto la capacità del substrato. I recipienti presentati qui ancora richiedono agar in modo da mantenere l'umidità alta. Tuttavia, con piccole modifiche al design di presa, è possibile creare un tubo staccabile. Questo set up può permettere per il tubo essere disconnessi dalle camere una volta che la crescita è completa e ritagliato in un impianto elettrico. Inoltre, una volta che la salute del tubo inizia a deteriorarsi, potrebbe essere ricollegato al nuovi alloggiamenti per cibo e tregua, finché ha riparato e può essere utilizzato nuovamente. Figura 8 Mostra una foto di tubi lunghi che sono stato disconnesso dalle camere. La ricerca futura è necessaria per studiare le proprietà elettriche del tubo protoplasmica senza l'agar e quando coltivate alle lunghezze usando il metodo proposto.

I computer odierni sono costruiti utilizzando i tre elementi fondamentali circuito passivo due terminali: il condensatore, la resistenza e l'induttore. Sono in grado di dissipare o immagazzinare energia, generando non solo elementi passivi. Questi elementi sono stati stabiliti in 18th e 19° secolo e sono collegati attraverso le equazioni di Maxwell. Ciascuno di questi componenti di tre circuito in termini di loro relazione tra due variabili di quattro circuito definiamo vale a dire, corrente (I), tensione (V), carica (Q) e flusso-sollevatore (φ). La carica è integrale nel tempo della corrente e legge di Faraday definisce la tensione come integrale nel tempo del flusso. Così, un condensatore è definito da una relazione tra tensione e carica, un resistore è definito da una relazione tra tensione e corrente, e l'induttore è definito da un rapporto tra flusso e corrente. Per oltre un secolo, questi elementi sono stati una pietra miliare dell'elettronica. Tuttavia, esse rappresentano soltanto tre delle possibili coppie di quattro relazione tra le variabili di circuito, lasciando flusso-sollevatore e carica scollegato. Nel 1971, Leon Chua ha pubblicato una carta1 dove Egli postulò che c'era un quarto elemento manca che collegava le due variabili rimanenti, che chiamò il memristor. Il memristor può essere descritto come un resistore che ricorda la sua storia, quindi la contrazione 'resistore di memoria'. Questo funzioni di elemento, modificando la sua resistenza in funzione dell'entità della tensione applicata in precedenza e la sua durata. Inoltre, il memristor trattiene l'ultimo stato di resistenza una volta che la tensione non è più applicata. A differenza del condensatore, resistore e induttore, comportamento di memristor è non lineare, che è evidente nel suo profilo-V dove un ciclo di isteresi pizzicato è formato sotto una tensione CA. Questo ciclo prende la forma di una figura di Lissajous contenente due oscillazioni perpendicolari di Stati di alta e bassa resistenza. Prima teoria di memristance formalizzato di Chua, altri ricercatori avevano riferito sugli effetti di resistenza di memoria a determinate frequenze quando sperimentando materiali come i polimeri e ossidi metallici, insieme a sviluppare dispositivi elettrici presso il micrometro scala2. Tuttavia, in molti casi, questi effetti sono stati considerati indesiderabili. Ci sono voluti quasi quarant'anni per la formalizzazione di Chua essere collegato a un dispositivo fisico e per i ricercatori iniziare a sviluppare metodi di sfruttare gli effetti memristive. Un team presso i laboratori di HP è riuscito a fabbricare un dispositivo memristive 20083 che ha acceso di enorme interesse per l'elemento.
Informatici hanno un vivo interesse per il memristor dovuto esso è accreditato come il primo elemento di combinare le capacità di elaborazione e di memoria in una singola unità. Visualizza anche i comportamenti che sono analoghi a determinati processi neurologici come Spike-Timing-Dependent plasticità (STDP)4, per citarne solo uno. Tali comportamenti sono dando vita a prospettive di costruzione di tecnologie di elaborazione del cervello-come che rilasciano la distinzione tra memoria e unità centrale di elaborazione (o CPU)5. In contrasto con gli approcci popolari per sviluppare memristors (utilizzando TiO2, ad esempio), la nostra ambizione è di sviluppare un organico bio-memristor. Inoltre, siamo interessati a come questo componente può fornire i mezzi di esplorazione paradigmi oltre gli approcci convenzionali per dispositivi informatici ingegneria; ad esempio, applicazioni creative nel campo della Computer Music6.
Memristance è un effetto che i ricercatori hanno recentemente scoperto in tutta una gamma di sistemi biologici. Ad esempio, la proprietà memristive sono stati osservati in aloe vera piante7 e pelle umana8, per citare ma due. Queste scoperte indicano che è possibile implementare dispositivi di elaborazione e memoria su substrati biologici. Sfruttando sistemi organici all'interno di tecnologia potrebbe consentire noi per esplorare concetti eccitante come l'auto-assemblaggio, ripara di auto, a basso impatto ambientale e auto-alimentazione. Prima che possiamo indagare queste opportunità, tuttavia, parecchie sfide devono essere affrontate. Molti dei sistemi biologici che hanno proprietà memristive hanno notevoli vincoli che limitano la loro sopravvivenza come componente elettronico effettivo. Ad esempio, una foglia di aloe vera7 ha bisogno di luce, ha una durata limitata e sarebbe difficile da integrare in un circuito. Inoltre, parecchi altri in vivo memristive fenomeni, come il sudore umano condotti8, non sono opzioni attualmente fattibile per lo sviluppo di sistemi per l'uso di fuori del laboratorio e nei sistemi elettronici tutti i giorni. Tuttavia, di tutti i fenomeni di memristive, c'è un potenziale candidato: il p. polycephalum.
Il plasmodio di p. polycephalum è un sistema unicellulare amorfo che è stato scoperto per agire come un componente di memristive9,10. Questo organismo è un candidato ideale per la ricerca in elettronica hardware-wetware ibrido per una serie di motivi. In primo luogo, l'organismo è non patogeni, macroscopico e non richiede l'uso di attrezzature specialista, che rende accessibile ai non-biologi e ingegneri il plasmodio. In secondo luogo, la cella è amorfa, costituisce reti di filo-come vene e crescerà sulla maggior parte dei substrati (Figura 1). Queste proprietà consentono la morfologia della cellula essere facilmente delineati per conformi a uno schema elettrico convenzionale. C'è anche una ricerca che dimostra che il plasmodio possa vivere per oltre quattro anni11, e che le sue vene possono agire come autoriparante percorsi conduttivi12. Diversi studi di laboratorio hanno confermato memristive abilità9,10,13 dell'organismo e ora i tempi sono maturi per esplorare il suo potenziale.
L'idea di usare P. memristors polycephalum è relativamente nuovo. Di conseguenza, non ci sono nessun standard stabiliti per la misurazione e osservando le sue proprietà elettriche. Tale mancanza di uniformità nelle procedure sperimentali all'interno dello stesso gruppo di ricerca e tra gruppi può essere il motivo che ci sono incongruenze tra pubblicato risultati9,10. È probabile che tale variazione è più prominente nella movimentazione e le condizioni di crescita di campione. Così, abbiamo bisogno di stabilire metodi per la produzione e collaudo il p. polycephalum memristors dove i fattori che potrebbero causare errori sono meglio controllato e monitorato.  Inoltre, abbiamo bisogno di creare metodi di implementazione il p. polycephalum memristors che consentono stabile e facile integrazione nel sistema elettrico.
Il metodo presentato in questa carta fornisce una piattaforma per l'esplorazione delle applicazioni pratiche di p. polycephalum memristors fornendo mezzi di incorporare l'organismo come un componente in un disegno schematico elettrico. È probabile che queste tecniche si rivolge agli ingegneri che desiderano per esplorare usi reali dei sistemi hardware-wetware ibridi. Inoltre, è accessibile ai non esperti (ad esempio, gli appassionati di prototipazione elettronica open source) che può essere interessate a sperimentare con aspetti dell'informatica non convenzionale ma hanno trovato difficoltà a trovare i prototipi di adattarsi alle loro esigenze. Alcune applicazioni potenziali possono includere modelli probabilistici sfruttando la memristors chiodare il comportamento, lo sviluppo di approcci per eseguire l stateful di esecuzioneoperazioni Logic e modellazione processi neurologici per l'archiviazione di informazioni e elaborazione.

<table><tbody><tr><td>Conductive PLA filament 2.85mm</td><td>Functionalize</td><td>FE_1LB_2.85MM</td><td>Conductive 3D Printing Filament</td></tr><tr><td>HIPS Filament 3mm 1KG (black)</td><td>NuNus</td><td>104856</td><td>3D printing filament</td></tr><tr><td>Cleaning Filament, 3mm, 0.1 kg, Natural</td><td>3D Prima</td><td>3DPCLEAN300</td><td>3D cleaning filament</td></tr><tr><td>Lulzbot Taz 5</td><td>Lulzbot</td><td>TAZ 5</td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Agar powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0504</td><td>Non-nutrient microbiological Agar powder</td></tr><tr><td>4mm ID x 6mm OD Clear PVC Tubing Pipe Hose 5 Metres</td><td>Amazon</td><td>B008NC4JUO</td><td>Roll of PVC tubing</td></tr><tr><td>Physarum polycephalum Plasmodium, Living, Plate</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>156193</td><td>Plasmodium culture.</td></tr><tr><td>Oat Flakes</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td></td><td>Oak flakes to feed the Plasmoidum</td></tr><tr><td>Cura</td><td>Lulzbot</td><td>Cura LulzBot Edition</td><td>https://www.lulzbot.com/cura</td></tr><tr><td>230 Programmable Voltage Source</td><td>Keithley Instruments</td><td></td><td>Voltage source instrument.</td></tr><tr><td>617 Programmable Electrometer</td><td>Keithley Instruments</td><td></td><td>Electrometer to measure low currents.</td></tr></tbody></table>

a method for growing bio-memristors from slime mold

La nostra ricerca è rivolta a ottenere una migliore comprensione delle proprietà elettroniche di organismi al fine di progettare nuovi sistemi bioelettronici e architetture di calcolo basati sulla biologia. Questo specifico documento si concentra su sfruttando la muffa di melma unicellulare Physarum polycephalum sviluppo bio-memristors (o biologica memristors) e dispositivi di bio-informatica. Il memristor è un resistore che possiede memoria. È il 4 ° circuito passivo fondamentale elemento (le altre tre sono il resistore, il condensatore e l'induttore), che sta spianando la strada per la progettazione di nuovi tipi di sistemi informatici; ad esempio, i computer che potrebbe abbandonare la distinzione tra il deposito e un'unità centrale di elaborazione. Quando applicato con una tensione alternata, la corrente vs tensione caratteristica di un memristor è un ciclo di isteresi pizzicato. È stato indicato che il p. polycephalum produce cicli di isteresi pizzicato sotto tensione in corrente alternata e visualizza comportamento adattivo che è paragonabile con il funzionamento di un memristor. Questa carta presenta il metodo che abbiamo sviluppato per l'implementazione di bio-memristors con il p. polycephalum e introduce lo sviluppo di un recipiente alla cultura dell'organismo, che facilita la distribuzione come un componente del circuito elettronico. Il nostro metodo ha dimostrato di ridurre i tempi di crescita, aumentare la durata della vita del componente e standardizzare le osservazioni elettriche.

Per produrre risultati rappresentativi, abbiamo istituito 5 campioni usando il metodo esatto descritto sopra. Per un controllo, 5 campioni sono stati anche organizzati utilizzando il metodo descritto nei primi il p. polycephalum memristor indagini9,10. Qui, abbiamo posizionato due elettrodi distanziati ad una distanza di ~ 10 mm all'interno di piastre di Petri da 60 mm. Ogni elettrodo è costituito da un cerchio (~ 20 mm di diametro) di filo di rame stagnato (16 corrisponde a 0,2 mm) riempita di un 2% non-sostanza nutriente deionizzata agar (~ 2 mL). Tutti i campioni sono stati controllati tramite immagini time-lapse di rivedere il tempo di crescita. Qui, i campioni di 5 recipiente collegato i due elettrodi all'interno di 10 h di inoculazione. Il più veloce di questi si è sviluppato in meno di 2 h, e la più lunga era h 10, con il tempo medio di crescita medio attraverso tutti i 5 campioni di 7 h 24 min. Quattro dei campioni di controllo prodotto un collegamento tubo protoplasmatico e uno propagato fuori l'elettrodo di inoculazione ma asciugata prima ha fatto il collegamento desiderato. Il più veloce dei campioni di controllo effettuata la connessione all'interno di 19 h mentre il più lento ha preso 36 h, con un tempo medio di crescita attraverso campioni di controllo di 26 h 15 min. Questi dati mostrano una diminuzione significativa nel tempo di crescita per memristors coltivati con il metodo proposto.
Il profilo dei-V di un memristor è la sua caratteristica più distintiva. Come tale, abbiamo effettuato misure I-V sui campioni per produrre risultati rappresentativi per questa carta. Qui, misure di corrente istantanee sono state fatte in ogni punto di una sinusoide di tensione 160-passo. Ogni passaggio di tensione aveva un tempo di sosta statica di 2 s. misure elettriche sono stati realizzati utilizzando una sorgente di tensione programmabile 230 e un elettrometro programmabile 617. Questi dispositivi sono stati selezionati in quanto sono in grado di sourcing tensione e presa misure a risoluzioni elevate. Gli esperimenti sono stati condotti a temperatura ambiente in una stanza non illuminata.
Figura 6 Mostra curve tipiche V prodotte dalle prove il p. polycephalum memristors. Figura 6C e 6D Visualizza Piazzole con le misurazioni rappresentative da componenti implementati nei piatti Petri. Utilizzando questo metodo i risultati mostrano che, anche se le curve misurate sullo stesso campione sono morfologicamente simili, isteresi variano fortemente da campione a campione. Tale variazione include la posizione di punti di rischio, la grandezza dei lobi sia positivi che negativi e la simmetria tra misurazioni nei domini tensione positiva e negativa. Così, curve I-V misurate su memristors utilizzando il metodo di Petri non sono l'impronta di un memristor 'ideale', perché pizzico punti non sono a zero di tensione e corrente. Figura 6a e 6b Visualizza grafici con misurazioni rappresentative da memristors cresciuta nei recipienti. Le posizioni dei punti di pizzico e lobo dimensioni di questi cicli di isteresi sono relativamente costanti sia in curve curve discreti campione testate sotto tensione diverse gamme e passaggi di tempo di campione a campione. Di conseguenza, curve I-V presa erano più che ricorda dell'impronta di un memristor 'ideale', dove i punti di rischio erano sempre singolare e quasi costantemente a zero tensione e corrente. Tuttavia, anche se l'isteresi, la morfologia simile campione per campione, c'era variazione di resistenza complessiva tra i campioni. .
Dopo le misurazioni iniziali V sono state completate, le prove sono state effettuate su ogni campione una volta al giorno fino a quando non hanno non presentato nessun curve di memristive. Dei campioni di 4 controllo, 2 prosciugato entro 2 giorni di test iniziale, mentre i restanti 2 ha continuato a registrare curve pizzicate per altri 2 giorni. I campioni di recipiente mantenuto loro memristance per almeno 7 giorni, con 3 campioni superiore a quella. Nel corso del tempo, ciascuna delle provette protoplasmica dell'esempio recipiente è diventato più spessa e c'era una diminuzione della resistenza complessiva, con alcuni campioni di misura nell'A x 10-04 gamma per 10 V corre contro A x 10-05 nei loro test precedenti.
Si rinvia all'articolo di Braund14 per risultati sui test approfonditi del recipiente presentato.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig1.jpg"> 
Figura 1: Una fotografia di una cultura 2 giorno-vecchio di plasmodium di p. polycephalum. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56076/56076fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig2.jpg"> 
Figura 2: Uno screenshot del file STL recipiente dopo averli caricati nel software per affettare. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56076/56076fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig3.jpg"> 
Figura 3: uno screenshot del file STL elettrodo dopo averli caricati nel software per affettare. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56076/56076fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig4.jpg"> 
Figura 4: Uno screenshot della configurazione delle impostazioni per la stampa del modello STL elettrodo.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig5.jpg"> 
Figura 5: Due fotografie che ritraggono il p. polycephalum memristors implementato in una capsula Petri (a sinistra) e utilizzando il metodo presentato in questa carta (a destra). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56076/56076fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig6.jpg"> 
Figura 6: Quattro grafici-V che sono state prodotte da due memristors cresciuta nei recipienti (a, b) e due implementato in capsule di Petri (c, d). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56076/56076fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig7.jpg"> 
Figura 7: Fotografie che mostrano il recipiente utilizzato per crescere tubi alle varie lunghezze.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56076/56076fig8.jpg"> / > Figura 8: una fotografia che mostra protoplasmica tubi disconnesse dalle camere a.

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A Method for Growing Bio-memristors from Slime Mold

Un metodo per la coltivazione Bio-memristors da muffa di melma

Questo documento introduce un metodo migliore per la coltivazione bio-memristors fuori il plasmodio di Physarum polycephalum. Tale metodo ha dimostrato di ridurre i tempi di crescita, aumentare la durata della vita del componente, standardizzare le osservazioni elettriche e creare un ambiente protetto che può essere integrato nei circuiti convenzionali.

Our research is aimed at gaining a better understanding of the electronic properties of organisms in order to engineer novel bioelectronic systems and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K Views.  Plymouth University. Questo documento introduce un metodo migliore per la coltivazione bio-memristors fuori il plasmodio di Physarum polycephalum. Tale metodo ha dimostrato di ridurre i tempi di crescita, aumentare la durata della vita del componente, standardizzare le osservazioni elettriche e creare un ambiente protetto che può essere integrato nei circuiti convenzionali.

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Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial culture device that continuously monitors bacterial growth and dynamically adjusts the drug concentration to constantly challenge the bacteria as they evolve to acquire drug resistance. The device features a working volume of ~10 ml and is fully automated and equipped with optical density measurement and micro-pumps for medium and drug delivery. To validate the platform, we measured the stepwise acquisition of trimethoprim resistance in Escherichia coli MG 1655, and integrated the device with a multiplexed microfluidic platform to investigate cell morphology and antibiotic susceptibility. The approach can be up-scaled to laboratory studies of antibiotic drug resistance, and is extendible to adaptive evolution for strain improvements in metabolic engineering and other bacterial culture experiments.

We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

Progettazione e l&#39;uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Ricerca

Genetica

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

Risposta chemiotattica di microrganismi marini a livelli di nutrienti Micro-Scale

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Biologia

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Bioingegneria

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire of dynamical motifs, which underlie most diverse brain functions, can emerge out of a fixed topological and modular organization of brain circuits. Compared to in vivo studies of neuronal circuits which present intrinsic experimental difficulties, in vitro preparations offer a much larger possibility to manipulate and probe the structural, dynamical and chemical properties of experimental neuronal systems. This work describes an in vitro experimental methodology which allows growing of modular networks composed by spatially distinct, functionally interconnected neuronal assemblies. The protocol allows controlling the two-dimensional (2D) architecture of the neuronal network at different levels of topological complexity.
A desired network patterning can be achieved both on regular cover slips and substrate embedded micro electrode arrays. Micromachined structures are embossed on a silicon wafer and used to create biocompatible polymeric stencils, which incorporate the negative features of the desired network architecture. The stencils are placed on the culturing substrates during the surface coating procedure with a molecular layer for promoting cellular adhesion. After removal of the stencils, neurons are plated and they spontaneously redirected to the coated areas. By decreasing the inter-compartment distance, it is possible to obtain either isolated or interconnected neuronal circuits. To promote cell survival, cells are co-cultured with a supporting neuronal network which is located at the periphery of the culture dish. Electrophysiological and optical recordings of the activity of modular networks obtained respectively by using substrate embedded micro electrode arrays and calcium imaging are presented. While each module shows spontaneous global synchronizations, the occurrence of inter-module synchronization is regulated by the density of connection among the circuits.

This manuscript describes a protocol to grow in vitro modular networks consisting of spatially confined, functionally inter-connected neuronal circuits. A polymeric mask is used to pattern a protein layer to promote cellular adhesion over the culturing substrate. Plated neurons grow on coated areas establishing spontaneous connections and exhibiting electrophysiological activity.

Design, Trattamento delle superfici, Cellular placcatura, e Coltura di neuronali modulari reti composte di circuiti funzionalmente interconnessi

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Neuroscienze

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the cognitive powers of the brain with comparable efficiency and density. To date, silicon-based three-terminal transistors and two-terminal memristors have been widely used in neuromorphic circuits, in large part due to their ability to co-locate information processing and memory. Yet these devices cannot achieve the interconnectivity and complexity of the brain because they are power-hungry, fail to mimic key synaptic functionalities, and suffer from high noise and high switching voltages. To overcome these limitations, we have developed and characterized a biomolecular memristor that mimics the composition, structure, and switching characteristics of biological synapses. Here, we describe the process of assembling and characterizing biomolecular memristors consisting of a 5 nm-thick lipid bilayer formed between lipid-functionalized water droplets in oil and doped with voltage-activated alamethicin peptides. While similar assembly protocols have been used to investigate biophysical properties of droplet-supported lipid membranes and membrane-bound ion channels, this article focuses on key modifications of the droplet interface bilayer method essential for achieving consistent memristor performance. Specifically, we describe the liposome preparation process and the incorporation of alamethicin peptides in lipid bilayer membranes, and the appropriate concentrations of each constituent as well as their impact on the overall response of the memristors. We also detail the characterization process of biomolecular memristors, including measurement and analysis of memristive current-voltage relationships obtained via cyclic voltammetry, as well as short-term plasticity and learning in response to step-wise voltage pulse trains.

Soft, low-power, biomolecular memristors leverage similar composition, structure, and switching mechanisms of bio-synapses. Presented here is a protocol to assemble and characterize biomolecular memristors obtained from insulating lipid bilayers formed between water droplets in oil. The incorporation of voltage-activated alamethicin peptides results in memristive ionic conductance across the membrane.

Assemblaggio e caratterizzazione biomolecolare Memristors costituito da membrane lipidiche drogato con scanalatura dello ione

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the microscale&#8213;to create micro-environments for microbial chemotaxis experiments. To create chemical pulses, we developed a system to introduce amino acid sources near-instantaneously by photolysis of caged amino acids within a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chamber containing a bacterial suspension. We applied this method to the chemotactic bacterium, Vibrio ordalii, which can actively climb these dynamic chemical gradients while being tracked by video microscopy. Amino acids, rendered biologically inert (&#39;caged&#39;) by chemical modification with a photoremovable protecting group, are uniformly present in the suspension but not available for consumption until their sudden release, which occurs at user-defined points in time and space by means of a near-UV-A focused LED beam. The number of molecules released in the pulse can be determined by a calibration relationship between exposure time and uncaging fraction, where the absorption spectrum after photolysis is characterized by using UV-Vis spectroscopy. A nanoporous polycarbonate (PCTE) membrane can be integrated into the microfluidic device to allow the continuous removal by flow of the uncaged compounds and the spent media. A strong, irreversible bond between the PCTE membrane and the PDMS microfluidic structure is achieved by coating the membrane with a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) followed by plasma activation of the surfaces to be bonded. A computer-controlled system can generate user-defined sequences of pulses at different locations and with different intensities, so as to create resource landscapes with prescribed spatial and temporal variability. In each chemical landscape, the dynamics of bacterial movement at the individual scale and their accumulation at the population level can be obtained, thereby allowing the quantification of chemotactic performance and its effects on bacterial aggregations in ecologically relevant environments.

A protocol for the generation of dynamic chemical landscapes by photolysis within microfluidic and millifluidic setups is presented. This methodology is suitable to study diverse biological processes, including the motile behavior, nutrient uptake, or adaptation to chemicals of microorganisms, both at the single cell and population level.

Generazione di paesaggi chimici dinamici e controllati per studiare il comportamento microbico

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, biomimetic surfaces mimicking the microstructure of leaf surface, were used to study the effects of leaf microstructure on leaf-environment interactions. However, no such tool exists for roots. We developed a tool allowing the synthetic mimicry of the root surface microstructure into an artificial surface. We relied on the soft lithography method, known for leaf surface microstructure replication, using a two-step process. The first step is the more challenging one as it involves the biological tissue. Here, we used a different polymer and curing strategy, relying on the strong, rigid, polyurethane, cured by UV for the root molding. This allowed us to achieve a reliable negative image of the root surface microstructure including the delicate, challenging features such as root hairs. We then used this negative image as a template to achieve the root surface microstructure replication using both the well-established polydimethyl siloxane (PDMS) as well as a cellulose derivative, ethyl cellulose, which represents a closer mimic of the root and which can also be degraded by cellulase enzymes secreted by microorganisms. This newly formed platform can be used to study the microstructural effects of the surface in root-microorganism interactions in a similar manner to what has previously been shown in leaves. Additionally, the system enables us to track the microorganism&#8217;s locations, relative to surface features, and in the future its activity, in the form of cellulase secretion.

Biomimetics has been previously used as a tool to study leaf-microorganism interactions. However, no such tool exists for roots. Here, we develop a protocol to form synthetic surfaces mimicking root surface microstructure for the study of root-environment interactions.

Replica biomimetica della microstruttura superficiale della radice mediante alterazione della litografia morbida

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Applicazioni della stampa 3D per dispositivi di coltura cellulare neuronale su microscala

Two-Photon Polymerization 3D-Printing of Micro-scale Neuronal Cell Culture Devices

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, and realistic synaptic connectivity are missing. The latter limits the study of structure and function in the context of compartmentalization and diminishes the significance of cultures in neuroscience. Approximating ex vivo the structured anatomical arrangement of synaptic connectivity is not trivial, despite being key for the emergence of rhythms, synaptic plasticity, and ultimately, brain pathophysiology. Here, two-photon polymerization (2PP) is employed as a 3D printing technique, enabling the rapid fabrication of polymeric cell culture devices using polydimethyl-siloxane (PDMS) at the micrometer scale. Compared to conventional replica molding techniques based on microphotolitography, 2PP micro-scale printing enables rapid and affordable turnaround of prototypes. This protocol illustrates the design and fabrication of PDMS-based microfluidic devices aimed at culturing modular neuronal networks. As a proof-of-principle, a two-chamber device is presented to physically constrain connectivity. Specifically, an asymmetric axonal outgrowth during ex vivo development is favored and allowed to be directed from one chamber to the other. In order to probe the functional consequences of unidirectional synaptic interactions, commercial microelectrode arrays are chosen to monitor the bioelectrical activity of interconnected neuronal modules. Here, methods to 1) fabricate molds with micrometer precision and 2) perform in vitro multisite extracellular recordings in rat cortical neuronal cultures are illustrated. By decreasing costs and future widespread accessibility of 2PP 3D-printing, this method will become more and more relevant across research labs worldwide. Especially in neurotechnology and high-throughput neural data recording, the ease and rapidity of prototyping simplified in vitro models will improve experimental control and theoretical understanding of in vivo large-scale neural systems.

Autore in primo piano: Reti neuronali modulari per l'analisi delle funzioni cerebrali

3D printing at the micrometer scale enables rapid prototyping of polymeric devices for neuronal cell cultures. As a proof-of-principle, structural connections between neurons were constrained by creating barriers and channels influencing neurite outgrowth, while the functional consequences of such manipulation were observed by extracellular electrophysiology.

Stampa 3D a polimerizzazione a due fotoni di dispositivi di coltura cellulare neuronale su microscala

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, ...