Questo lavoro è stato supportato da MRC, EU FP7, lolla, Wellcome Trust e Parkinson UK. Vorremmo anche ringraziare la signora Johanna Buchler per il suo contributo delle immagini confocal e i membri del laboratorio per il loro contributo costruttivo sul manoscritto e metodologia.

tutti gli esperimenti con topi e ratti sono stati approvati e condotti utilizzando le procedure di pianificazione 1 coperti sotto l'atto di casa ufficio animali (procedure scientifiche) 1986. La ricetta di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) può essere trovata nella tabella 1.
 1. acuta Hippocampal Fetta preparazione <ol><li>rimuovere il cervello del mouse più velocemente possibile, utilizzando una spatola e forbici per tagliare il cranio e inserirlo nella gelida affilate, ossigenato (95% O 2, 5% CO 2), alto-saccarosio ACSF (~ 100 mL).</li>
	<li>Posto nel cervello del topo su una piastra di Petri e rimuovere il cervelletto e una piccola sezione della corteccia frontale con un bisturi prima hemisecting giù la linea mediana del cervello.</li>
	<li>Posizionare i due emisferi sul lato che è stato appena tagliato e incollare ogni emisfero sul palco di un vibratomo.</li>
	<li>Tagliare 200-300 µm di spessore sezioni della regione completa di interesse. In caso di ippocampo, dovrebbero ottenere circa 3-4 fette per emisfero.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta di Pasteur plastica, trasferire le fette in una camera sommersa ossigenato (95% O, 2, 5% CO 2) ACSF. Mantenere a 34 ° C per 30 min. 
	Nota: Il trattamento delle fette con attivi agenti farmacologici, quali proteine ricombinanti di Dkk1, può essere eseguito in questa fase aggiungendo gli agenti alla fetta camera.</li>
	<li>Rimuovere le fette dalla camera utilizzando un pennello, inserirli in una piastra a 24 pozzetti e difficoltà per 20 min a 1 h in paraformaldeide al 4% (saccarosio PFA)/4% a temperatura ambiente (TA). 
	Attenzione: PFA è tossico, indossare una protezione appropriata.</li>
	<li>Lavare le fette tre volte in 1X PBS (10 min. ciascuno). 
	Nota: Il protocollo può essere sospesa qui per 1-2 giorni, finché le fette sono conservate a 4 ° C in 1X PBS.</li>
</ol> 2. Immunofluorescenza per marcatori sinaptiche Nota: le ricette di tutti i buffer utilizzati possono essere trovate nella tabella 2.
<ol><li>Sostituire il PBS con tampone di blocco/permeabilizing (tabella 2) nei pozzetti fetta e incubare a temperatura ambiente per 4-6 h.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo policlonale cavia contro vGlut1 1:2,000 il fattore di diluizione nel buffer blocco/permeabilizzazione. 
	Nota: vGlut1 è un indicatore per la pre-sinaptica eccitatoria visualizzazione terminal. Per l'identificazione di sinapsi eccitatorie post-sinaptiche, utilizzare un anticorpo policlonale contro PSD-95 e diluito 1: 500 nella stessa soluzione. Utilizzare un volume minimo di 300 µ l in ogni pozzetto. Per identificare la posizione anatomica dell'ippocampo, utilizzare un anticorpo che può anche identificare la struttura neuronale, come MAP2 o tubulina. Lavorare fuori le concentrazioni corrette di tutti gli anticorpi primari per i marcatori sinaptici di scelta (pre- e post-sinaptico) e diluito in tampone fresco blocco/permeabilizing.</li>
	<li>Incubare le fette nella soluzione anticorpo primario durante la notte (o per 1-2 giorni) a 4 ° C. uso a scuotimento con vigoroso movimento.</li>
	<li>Lavare le fette tre volte in PBS (10 min. ciascuno).</li>
	<li>Diluire la 1: 500 appropriati anticorpi secondari in tampone bloccante. Ad esempio, quando si utilizza l'anticorpo di cavia vGlut1, applicare un anticorpo secondario che riconosce la componente di cavia (ad es., asino anti-porcellino d') coniugata ad un fluorophore specifico. Quando si utilizza l'anticorpo di coniglio di PSD-95, applicare un anticorpo secondario che riconosce la componente di coniglio (ad es., anti-coniglio di asino) coniugata ad un fluorophore specifico diverso.</li>
	<li>Incubare le fette in questa soluzione per 2-3 h a RT. Accertarsi che le fette siano protetti dalla luce, come gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce.</li>
	<li>Lavare le fette tre volte in PBS (10 min. ciascuno).</li>
	<li>Attentamente togliere le fette dalla piastra 24 pozzetti utilizzando un pennello e metterli in modo uniforme su vetrini pre-etichettate. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sopra ogni fetta e quindi posizionare delicatamente il vetrino coprioggetti sopra le fette. Evitare la formazione di bolle d'aria. Fate attenzione ad per usare abbastanza liquido di montaggio (300-400 µ l), come una quantità insufficiente può portare a secco fette.</li>
	<li>Lasciare asciugare per un minimo di 1-2 giorni a RT e mantenere le diapositive al riparo dalla luce.</li>
	<li>Archiviare le diapositive a 4 ° C nel breve termine, ma per l'archiviazione a lungo termine, conservare a -20 ° C.</li>
</ol> 3. Analisi e acquisizione di immagini confocal <ol><li>Imaging mediante microscopia a scansione laser confocale.
	<ol><li>Identificare la regione dell'ippocampo essere imaged (ad es., il cornu ammonis 1 e 3 (CA1, CA3) o il giro dentato (DG)) per mezzo di un 10x o 20x obiettivo.</li>
		<li>Cambiamento di un x 40 o 63 x obiettivo a immersione in olio per assicurarsi che l'anatomia della fetta è intatto identificando neurites continuo e organizzato la struttura. Utilizzare un indicatore di un neurone, quali MAP2, come riferimento ( Figura 1A).</li>
		<li>Successivamente, passare a un 60 x obiettivo a immersione in olio (NA = ~1.3 - 1.4) e regolare le impostazioni per ciascun canale per ottenere segnale ottimale e contrasto. Impostare l'intensità di ogni laser per evitare la saturazione dei pixel di utilizzando l'opzione alto / basso contrasto. 
		Nota: Queste impostazione verrà dipendono il microscopio utilizzato, ma fare riferimento alla Tabella materiali per le impostazioni di risparmio energia di laser utilizzati in Figura 2, Figura 3, e Figura 4. Per risultati ottimali, utilizzare una risoluzione di 1024 x 1024 pixel. Le impostazioni dovrebbero rimanere costante durante le diverse condizioni dell'esperimento stesso. Zoom aggiuntivi possono essere applicati se necessario.</li>
		<li>Valutare la profondità dove la colorazione è anche e acquisire la serie di immagini di almeno 8 equidistante (250 nm) aerei. Poi prendere 3 pile adiacenti immagini rappresentative provenienti dalla stessa zona di interesse per fetta. 
		Nota: La profondità può variare da una sezione a altra ma sempre dovrebbe essere circa 2-5 µm dalla superficie della fetta.</li>
		<li>Ripetere l'acquisizione in almeno 3 fette per condizione e da 6-8 animali per gruppo di trattamento.</li>
	</ol></li> <li>Image analysis. 
	Nota: Utilizzare un software di analisi di immagine automatizzato (Vedi la Tabella materiali). Si noti che alcuni sistemi richiedono una licenza, mentre altri sono gratuiti, come ad esempio ImageJ. Il software utilizzato deve analizzare le immagini in 3D tenendo conto di tutti i piani dello stack imaged. Fare riferimento alla Tabella materiali per i dettagli del software utilizzato nell'analisi di immagine ( Figura 1).
	<ol><li>Uso un protocollo di soglia di intensità abitudine-basata per identificare tutti i puncta sinaptica e indicatori di un neurone, che manualmente sono ottimizzati e selezionati all'interno del software [vedi Tabella materiali per lo specifico software utilizzato in questo protocollo]. 
		Nota: Il software identifica un'intensità minima e massima per ogni fluoroforo e associa una percentuale di intensità per ogni oggetto riconosciuto. Si noti che la percentuale di intensità varierà secondo il fluoroforo utilizzato e l'anticorpo contro il marcatore sinaptico.</li>
		<li>Per marcatori sinaptici, garantire che dimensione filtri (&#62; 0.1 µm 3 e &#60; 0.8µm 3) sono selezionati all'interno del software e applicate all'immagine. Regolare i parametri per garantire che gli oggetti selezionati non sono sovrapposte. Escludere qualsiasi oggetto che sono troppo grandi o troppo piccoli per essere considerati puncta sinaptica (Vedi Figura 2B). 
		Nota: Una volta ottimizzato, gli stessi valori di soglia vengono quindi applicati a tutte le immagini all'interno di un determinato esperimento.</li>
		<li>Quantificare il numero medio, intensità e volume delle singola puncta sinaptica (pre- o post-sinaptico) utilizzando i protocolli ottimizzati soglia selezionati all'interno del software. Normalizzare il numero puncta al volume del campo dell'immagine (all'incirca 16.928 µm 3 nel sistema utilizzato qui). Normalizzare l'intensità puncta sinaptica per l'intensità del marcatore neuronale riferimento. 
		Nota: Le sinapsi sono definite come la co-localizzazione tra marcatori sia pre- che post-sinaptici. Una volta i protocolli di soglia per pre- e post-sinaptico puncta hAve è stato stabilito, il software dovrebbe identificare la co-localizzazione dei puncta sinaptica come la sovrapposizione di 1 pixel o più in un unico piano. 
		Nota: Per l'analisi statistica, confermare di che tutti i set di campioni seguano la normalità e l'omogeneità delle varianze, come determinato da Lilliefords e test χ2, rispettivamente. Campioni che presentano una distribuzione normale e l'omogeneità delle varianze dovrebbero essere analizzati con test parametrici, come descritto di seguito. Ad esempio, puncta sinaptica eccitatoria analisi devono essere eseguita utilizzando un one-way ANOVA con blocco e replica. Ogni singolo esperimento dovrebbe essere considerata come un blocco; in genere esistono tre esperimenti indipendenti, ciascuno con 1-3 topi da ogni condizione.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> Figura 1: analisi dei puncta sinaptica utilizzando l'analisi dell'immagine software. (A) Screenshot della personalizzazione di protocollo soglia di intensità. L'esempio fornito è per PSD-95, in cui i puncta selezionato hanno una dimensione definita di &#62; 0,1 µm 3 e &#60; 0,8 µm 3 e presenti oggetti sovrapposti ridotta a icona. Si noti che l'immagine mostrata è per un aereo confocale abilitare la visualizzazione più facile dei puncta sinaptica e selezione dei parametri precisi. (B) Screenshot dell'analisi uscita dal software (dopo la selezione del protocollo ottimizzato). Un esempio di crudo puncta sinaptica numeri misurazioni basate sul volume. Questi valori vengono poi esportati ad un software di foglio di calcolo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> Figura 2: controllo di qualità delle impostazioni fetta e parametro per puncta sinaptica. Immagini confocal (A) rappresentative (obiettivo 40x) della regione di interesse: il CA1 strato radiato (sr) e strato oriens (così) di una fetta hippocampal sono identificati dalla macchiatura MAP2. Barra della scala = immagini Confocal di 2 µm. (B) (60 x obiettivo e un'ulteriore 1.3 X ingrandimento del software di acquisizione) del CA1 strato radiato, con eccitanti marcatori-vGlut1 (verde) e PSD-95 (rosso)-da fette hippocampal. Nota l'identificazione dei puncta chiaro pre- e post-sinaptico. Puncta superiore a 0,8 µm 3 sono esclusi dalla quantificazione (frecce bianche). Barra della scala = 2 µm (C) confocale immagini (60 x obiettivo e un'ulteriore 1.3 X ingrandimento del software di acquisizione) del CA1 strato radiato, con eccitanti marcatori-vGlut1 (verde)-dal criostato-taglio sezioni hippocampal dai cervelli intero risolto in PFA. Si noti la presenza di fori grandi e irregolari, ragruppata vGlut1 colorazione. Barra della scala = 2 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<ol><li>Malenka, R. C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+and+LTD%3A+an+embarrassment+of+riches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LTP and LTD: an embarrassment of riches.</a> Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).</li>
<li>Arendt, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19390859">Synaptic degeneration in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).</li>
<li>Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic cell adhesion.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694(2012).</li>
<li>Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+an+excitatory+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The architecture of an excitatory synapse.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).</li>
<li>Dobie, F. A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+synapse+dynamics%3A+coordinated+presynaptic+and+postsynaptic+mobility+and+the+major+contribution+of+recycled+vesicles+to+new+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation.</a> J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).</li>
<li>Jackson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tau+increases+amyloid+beta+plaque+size+but+not+amyloid+beta-mediated+synapse+loss+in+a+novel+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease.</a> Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).</li>
<li>Heck, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+automated+3D+detection+of+synaptic+contacts+reveals+the+formation+of+cortico-striatal+synapses+upon+cocaine+treatment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).</li>
<li>Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+levels+of+PSD95+and+two+associated+proteins+and+increased+levels+of+BCl2+and+caspase+3+in+hippocampus+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment%3A+Insights+into+their+potential+roles+for+loss+of+synapses+and+memory%2C+accumulation+of+Abeta%2C+and+neurodegeneration+in+a+prodromal+stage+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).</li>
<li>Harwell, C. S., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptophysin+depletion+and+intraneuronal+Abeta+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+from+huAPP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 44(2016).</li>
<li>Marzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+Synapse+Degeneration+by+Restoring+Wnt+Signaling+in+the+Adult+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus.</a> Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).</li>
<li>Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dysfunction+in+neurodevelopmental+disorders+associated+with+autism+and+intellectual+disabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).</li>
<li>Janezic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficits+in+dopaminergic+transmission+precede+neuron+loss+and+dysfunction+in+a+new+Parkinson+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).</li>
<li>Caricasole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Dickkopf-1%2C+a+negative+modulator+of+the+Wnt+pathway%2C+is+associated+with+neuronal+degeneration+in+Alzheimer%27s+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain.</a> J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).</li>
<li>De Ferrari, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+genetic+variation+within+the+low-density+lipoprotein+receptor-related+protein+6+and+late-onset+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).</li>
<li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+LRP6-mediated+Wnt+signaling+contributes+to+synaptic+abnormalities+and+amyloid+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease.</a> Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).</li>
<li>Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Secreted+Wnt+Antagonist+Dickkopf-1+Is+Required+for+Amyloid+beta-Mediated+Synaptic+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss.</a> J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).</li>
<li>Rosi, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Dickkopf-1+expression+in+transgenic+mouse+models+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease.</a> J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).</li>
<li>Budnik, V., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+during+synaptic+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling during synaptic development and plasticity.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).</li>
<li>Ciani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+tunes+neurotransmitter+release+by+directly+targeting+Synaptotagmin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1.</a> Nat Commun. 6, 8302(2015).</li>
<li>Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnts+in+action%3A+from+synapse+formation+to+synaptic+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance.</a> Front Cell Neurosci. 7, 162(2013).</li>
<li>Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+in+neuronal+differentiation+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling in neuronal differentiation and development.</a> Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).</li>
<li>Galli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+Wnt+signalling+triggers+striatal+synaptic+degeneration+and+impaired+motor+behaviour+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice.</a> Nat Commun. 5, 4992(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La valutazione precisa del numero di sinapsi è essenziale nel campo delle neuroscienze. Qui, indichiamo come valutare la densità delle sinapsi nella regione CA1 strato radiato di fette hippocampal come sistema modello. Singolo-sezione EM10dimostra il significato per quanto riguarda i metodi esistenti nel nostro recente articolo di ricerca sull'effetto della carenza di Wnt nell'ippocampo e dove abbiamo anche valutato il numero di sinapsi. La grandezza di perdita di sinapsi sono simili tra single-sezione EM e la fetta di cervello metodo descritto qui10. Quindi, questa scoperta dimostra l'accuratezza e l'affidabilità della tecnica.
Importante, una limitazione di singolo-sezione EM e di immunostaining sinapsi, come presentato qui, è l'impossibilità di stimare con precisione il numero di sinapsi assoluta per una regione specifica del cervello. Infatti, è importante identificare le modifiche morfologiche globale, quanto le variazioni di volume totale potrebbero influire numero sinaptica. Un'altra limitazione è che alcuni anticorpi sono meno efficienti alle regioni del cervello intatto, parzialmente a causa della estrema densità di connessioni sinaptiche di colorazione. Abbiamo sperimentato la qualità superiore di colorazione di vGlut1 e gephyrin utilizzando questa fetta preparazione e successiva fissazione di PFA per un massimo di 1 h, rispetto alla fissazione immediata dell'intero cervello in PFA (Figura 2). Quest'ultimo ha portato alla macchiatura sinaptica ragruppata, con buchi nel tessuto. Tuttavia, la penetrazione dell'anticorpo di vGlut1 è ancora limitata in entrambi i metodi (un paio di decine di micron). Non ci ha fatto superare questa limitazione, anche con l'anticorpo aumentata incubazione, ma fornendo la penetrazione dell'anticorpo è maggiore la profondità totale che è imaged, non ci dovrebbe essere alcuna influenza sul risultato finale. Inoltre, si dovrebbe prestare particolare attenzione a garantire che la colorazione è anche durante l'intero stack acquisita.
Nel nostro studio, abbiamo voluto distinguere eccitatori da sinapsi inibitorie. Di conseguenza, abbiamo scelto vGlut1/PSD-95 e vGAT/gephyrin, rispettivamente, come queste proteine sono altamente espressi nell'ippocampo del topo adulto e sono specifiche per ogni sinapsi sottotipo4,5. Altri marcatori sinaptiche eccitatorie ed inibitorie avrebbe potuto essere utilizzati per identificare ogni sinapsi rispettivi, come recettori arricchito ad ogni sinapsi, tra cui i recettori NMDA ed AMPA per eccitanti e recettori GABAA per sinapsi inibitorie. Altri neurotrasmettitori o neuromodulatori possono essere identificati anche con il nostro protocollo, assicurando che gli anticorpi specifici sono disponibili, come mostrato per sinapsi dopaminergica nel corpo striato22. Inoltre, riducendo lo spessore di ogni fetta a 120 µm può parzialmente superata la bassa quantità di campioni ottenuti con fettine acute, che è di importanza fondamentale per gli studi nelle strutture del cervello piccolo come l'amigdala.
Applicazioni future del nostro protocollo potrebbero essere attuate nello studio delle diverse aree del cervello e disturbi. Ad esempio, nel corpo striato (una regione del cervello associata con il morbo di Parkinson), una combinazione di vGlut2/PSD-95 o vGlut1/PSD-95 potrebbe essere utilizzata per distinguere tra le sinapsi eccitatorie da afferenze provenienti dalla corteccia o talamo, rispettivamente22.
In conclusione, abbiamo indicato un metodo affidabile per esaminare il numero di sinapsi in tessuti cerebrali utilizzando marcatori pre- e post-sinaptici per definire una sinapsi. Fasi critiche prevedono la preparazione di fette hippocampal buone, un tempo di fissazione di fino a 1 h in PFA, l'applicazione di abbastanza liquido di montaggio, l'uso di anticorpi affidabili, le impostazioni di acquisizione immagine appropriata e rilevazione rigorose puncta sinaptica. In definitiva, questo metodo è relativamente veloce ed è facilmente riproducibile da qualsiasi laboratori che hanno accesso ad un microscopio confocale.

Il cervello umano è composto di circa 1014 sinapsi. Numero di sinapsi è strettamente regolato durante lo sviluppo e la maturazione del sistema nervoso centrale (CNS). Durante lo sviluppo, il numero di sinapsi è modulata da sinaptogenesi e potatura per formare reti di un neurone funzionali. Apprendimento e memoria sono supportati dal regolamento del numero di sinapsi e forza, un processo conosciuto come potenziamento sinaptico e depressione1. D'importanza, la stabilizzazione delle sinapsi mature è essenziale per il mantenimento di connessioni di rete neuronale. Inoltre, i deficit nella densità sinaptica sono stati segnalati nelle fasi iniziali di malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (annuncio)2. Pertanto, la capacità di identificare accuratamente e valutare il numero di sinapsi è fondamentale ai fini della valutazione della patologia e fisiologia del cervello.
La massima densità e natura compatta delle sinapsi rendono difficile per stimare il loro numero preciso nelle aree del cervello intatto. Sinapsi chimiche nel SNC sono costituite da due neuroni nell'apposizione vicina, separati da un cleft sinaptico3. Il terminale pre-sinaptica, o bouton sinaptico, emerge da un assone e consiste di vescicole accumulate, che contengono i neurotrasmettitori che definiscono la specificità di una sinapsi — vale a dire, glutammato e acido gamma - aminobutirrico (GABA) per eccitanti e inibitorio sinapsi, rispettivamente. Le membrane delle vescicole contengono vescicolari trasportatori specifici per ogni neurotrasmettitore: trasportatore vescicolare glutammato (vGlut) per il glutammato e il trasportatore vescicolare di GABA (vGAT) per GABA. Il terminale post-sinaptico è una struttura molto densa composta da diverse proteine, tra cui i recettori, molecole di adesione e proteine impalcatura. In sinapsi eccitatorie, proteina di densità-95 post-sinaptica (PSD-95) è il più abbondante dell'impalcatura proteina4, modulante eccitanti N-methyl-D-aspartate(NMDA-) e recettore di acido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) funzione, considerando che gephyrin ancore recettori inibitori al terminale post-sinaptico inibitorio5. Nel complesso, la specificità delle proteine ai compartimenti pre- e post-sinaptici aiuti la differenziazione e identificazione di sottotipi di sinapsi.
La valutazione del numero di sinapsi può essere eseguita con diverse tecniche. Il più comune è l'uso di microscopia elettronica (EM), che consente l'analisi della sinapsi in aree cerebrali compatta e intatta con alto ingrandimento e risoluzione. Tuttavia, questa tecnica è molto costosa, richiede preparazione del campione complicato e richiede molto tempo. Altre tecniche includono l'uso della matrice tomografia6, che ha un grande svantaggio in quanto richiede attrezzature specializzate e costose per eseguire l'analisi. Inoltre, linee transgeniche che esprimono specifici marcatori sinaptici sono utili a valutare la sinapsi numero7, ma la generazione di nuove linee può essere restrittiva e costoso, e la sovraespressione di proteine può causare indesiderato fuori bersaglio fenotipi.
A causa di queste limitazioni e per semplicità, molti ricercatori valutano numero di sinapsi esaminando i livelli della proteina sinaptica totale. Tuttavia, la perdita di sinapsi può essere osservato prima di cambiamenti sostanziali nella proteina, come risultati rimodellamento sinaptici strutturali nella dispersione di apposizione pre- o post-sinaptica, con Nessuna degradazione di proteine sinaptiche. Inoltre, in annuncio, i livelli della proteina sinaptica sono ridotti seguente sinapsi degenerazione o morte di un neurone8,9. La quantificazione dei livelli totali non consente questa distinzione. Così, c'è la necessità di sviluppare un metodo affidabile, accessibile e accurato per la valutazione del numero di sinapsi nel cervello.
In questo articolo, descriviamo come accuratamente identificare e determinare il numero delle sinapsi usando la microscopia di immunofluorescenza nelle fette hippocampal del cervello del roditore. Le sinapsi sono definite dalla colocalizzazione di marker pre- e post-sinaptico che appaiono in una distribuzione punctata. Dimostriamo la validità di questa tecnica attraverso lo studio di Wnt segnalazione nel cervello. WNT sono proteine secrete importanti per la formazione, la eliminazione e la manutenzione delle sinapsi. L'induzione in vivo di un antagonista secreto della cascata della Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), porta alla perdita sinaptica eccitatoria preservando sinapsi inibitorie nell' ippocampo10. Illustriamo l'identificazione e il conteggio delle sinapsi eccitatorie ed inibitorie nelle fette hippocampal da un topo adulto esprimendo Dkk1 ed evidenziare la trasferibilità di questa tecnica ad altri tipi di preparazioni di coltura di tessuti.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5905</td><td>vGlut1 (1:2000)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-046</td><td>PSD-95 (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Synaptic Systems</td><td>131 004</td><td>vGAT (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Synaptic Systems</td><td>147011</td><td>Gephyrin (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>MAP2 (1:10000)</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Jackson Laboratories</td><td>706-545-148</td><td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab175470</td><td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>SouthernBiotech</td><td>00-4958-02</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>PerkinElmer</td><td>NA</td><td>Volocity</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>203</td><td>No 11</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td>1446875</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BOC</td><td>NA</td><td>Cylinder</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Thermo</td><td>7107</td><td>08-1.0mm thick</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>iDkk1 mice</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&amp;alpha; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&amp;alpha; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for solutions:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Ca&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Mg&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma</td><td>K3375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid</td><td>Sigma</td><td>107360</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Millipore</td><td>S30-100ml</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

Nel cervello, le sinapsi sono specializzate giunzioni tra neuroni, determinare la forza e la diffusione della segnalazione di un neurone. Il numero delle sinapsi è strettamente regolato durante lo sviluppo e la maturazione neuronale. D'importanza, i deficit nel numero di sinapsi possono portare a disfunzione conoscitiva. Pertanto, la valutazione del numero di sinapsi è parte integrante della neurobiologia. Tuttavia, come le sinapsi sono piccole e molto compatto nel cervello intatto, la valutazione del numero assoluto è impegnativa. Questo protocollo descrive un metodo per identificare e valutare le sinapsi nelle fette hippocampal del roditore, usando la microscopia di immunofluorescenza facilmente. Esso comprende una procedura a tre fasi per valutare le sinapsi in immagini di alta qualità di microscopia confocale analizzando la co-localizzazione di proteine pre- e postsinaptici nelle fette hippocampal. Viene inoltre spiegato come l'analisi viene eseguita e dà esempi rappresentativi da sinapsi sia eccitatori che inibitori. Questo protocollo fornisce una solida base per l'analisi delle sinapsi e può essere applicato a qualsiasi ricerca che studia la struttura e la funzione del cervello.

Perdita di sinapsi si presenta presto nella malattie neurodegenerative come l'annuncio e la malattia del Parkinson2,11,12. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di questi deficit rimangono capiti male. Le carenze nella segnalazione Wnt sono state associate AD13,14,15,16,17. WNT sono glicoproteine secrete e svolgono un ruolo essenziale nella formazione della sinapsi e la modulazione della trasmissione sinaptica18,19,20,21. Recentemente, abbiamo identificato Wnt come regolatori chiave di manutenzione sinaptica nel sistema nervoso maturo10,22. Per studiare con precisione l'impatto di segnalazione Wnt su sinapsi nell'ippocampo dei topi geneticamente modificati, abbiamo approfittato di una preparazione di fetta di cervello e microscopia confocale per valutare i cambiamenti nel numero di sinapsi. Abbiamo identificato fette sani in cui la struttura era ben conservato (Figura 2A). Inoltre, la selezione dei puncta sinaptica è stata definita con cura, con l'esclusione di grandi oggetti macchiati probabilmente rappresentano aggregati proteici (Figura 2B). Questo criterio è stato applicato a tutte le immagini, con gli stessi parametri di analisi rigoroso.
Abbiamo usato un sistema di modello transgenico che induce l'espressione dell'antagonista Wnt secreta Dkk1 in adulto di topi (iDkk1) sotto tetraciclina controllano (Vedi la Tabella materiali)10,22. Abbiamo dimostrato che il blocco di segnalazione Wnt nell'ippocampo adulto provoca perdita di sinapsi eccitatoria in particolare della regione CA1 strato radiato (Figura 3). Figura 3A illustra immagini rappresentative confocal di marker pre- e post-sinaptico eccitatorio (vGlut1 e PSD-95, rispettivamente) ha acquisito da fette hippocampal di iDkk1 topi esprimenti Dkk1 per due settimane, così come i rispettivi controlli. Abbiamo analizzato queste immagini utilizzando il software Volocity ed ha dimostrato una riduzione significativa del numero di sinapsi eccitatorie, quantificato mediante la co-localizzazione dei puncta vGlut1 e PSD-95-etichettato nella regione CA1 dell'ippocampo dei topi di iDkk1 che seguono la induzione di Dkk1 per due settimane (Figura 3B, * p &#60; 0.05; Test di Kruskal-Wallis; 6 topi per genotipo). Nel CA1 strato radiato, il numero di sinapsi eccitatoria puncta per 1.000 µm3 è stata ridotta da 500 a topi di controllo a 300 in topi iDkk1. Al contrario, espressione di Dkk1 indotta non ha colpito il numero delle sinapsi inibitorie (identificato con la co-localizzazione tra il pre- e post-sinaptico marcatori vGAT e gephyrin, rispettivamente), come mostrato nella Figura 4A-B (p &#62; 0.05; Test di Kruskal-Wallis; 3 topi per genotipo).
D'importanza, abbiamo effettuato un'analisi di potenza statistica per stimare il numero di animali necessari per generare questi risultati robusti e fette appropriato. Utilizzando R, abbiamo calcolato che sono stati necessari circa 35 fette per condizione (animali fette x 6 3 immagini x 3 = 36) per rilevare una dimensione di grande effetto (f = 0,4) con confidenza dell'80% (potenza = 0,8) in un one-way ANOVA con blocco e la replica, come descritto in passaggio 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Figura 3: perdita di sinapsi eccitatorie nelle fette hippocampal da topi iDkk1. (A) immagini confocal rappresentative dei CA1 strato radiato Visualizza sinapsi eccitatorie, identificati da co-localizzazione tra vGlut1 e PSD-95 (frecce bianche). Il pannello inferiore rappresenta un maggiore ingrandimento del rettangolo evidenziato. Scala bar = 2 µm. (B) la percentuale di sinapsi eccitatorie tra controllo e iDkk1 è stata quantificata utilizzando software menzionati nella Tabella materiali (* p &#60; 0.05; Test di Kruskal-Wallis; 6 topi per genotipo). I dati sono rappresentati ± SEM Questa figura è stata modificata da riferimento10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Figura 4: sinapsi inibitorie sono invariate nelle fette hippocampal da topi iDkk1. (A) immagini confocal rappresentative del CA1 strato radiato delle sinapsi inibitorie identificate tramite la co-localizzazione tra vGAT e gephyrin (frecce bianche). Il pannello inferiore rappresenta un maggiore ingrandimento del rettangolo evidenziato. Scala bar = 2 µm. (B) percentuale delle sinapsi inibitorie tra topi di controllo e iDkk1, come quantificato utilizzando il software Volocity (p &#62; 0.05; Test di Kruskal-Wallis; 3 topi per genotipo). I dati sono rappresentati ± SEM Questa figura è stata modificata da riferimento10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alta saccarosio ACSF componenti</td>
			<td>Concentrazione</td>
			<td>Note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido chinurenico</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido piruvico</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Aggiungere dopo ossigenazione della soluzione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Aggiungere dopo ossigenazione della soluzione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucosio</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccarosio</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera sommersa ACSF componenti</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Aggiungere dopo ossigenazione della soluzione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Aggiungere dopo ossigenazione della soluzione</td>
		
		<tr>
			<td>D-glucosio</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tabella 1: Composizione ACSF.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blocco/permeabilizing Buffer</td>
			<td>Concentrazione</td>
			<td>Note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siero di asino</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>0,50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1,37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA/4% saccarosio</td>
			<td></td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>Diluire da 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1.33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccarosio</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Buffer utilizzati per la macchiatura immunofluorescente.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices at JoVE.com

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Un protocollo per accuratamente identificare e analizzare le sinapsi nelle fette hippocampal mediante immunofluorescenza è descritto in questo articolo.

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K Views.  University College London. Un protocollo per accuratamente identificare e analizzare le sinapsi nelle fette hippocampal mediante immunofluorescenza è descritto in questo articolo.

Video: Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l&#39;invecchiamento e Amiloide Patologia

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Ricerca

Neuroscienze

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

<meta charset="utf8"></head><body>Misurazione dell'assorbimento del glutammato utilizzando L-[3H]-glutammato radiomarcato in fette trasversali acute ottenute da ippocampo resecato con roditori

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Misurazione dell'assorbimento di glutammato utilizzando L-[3H]-glutammato radiomarcato in fette trasversali acute ottenute da ippocampo resecato con roditori

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

Biochimica

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

L&#39;analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Ridurre al minimo l'ipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

<meta charset="utf8"></head><body>Preparazione di fette cerebrali acute dal polo dorsale dell'ippocampo da roditori adulti

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Preparazione di fette cerebrali acute dal polo dorsale dell'ippocampo da roditori adulti

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

Riepilogo

Esplora Altri Video

Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l'invecchiamento e Amiloide Patologia

Misurazione dell'assorbimento di glutammato utilizzando L-[³H]-glutammato radiomarcato in fette trasversali acute ottenute da ippocampo resecato con roditori

Misurazione dell'assorbimento di glutammato utilizzando L-[³H]-glutammato radiomarcato in fette trasversali acute ottenute da ippocampo resecato con roditori

L'analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

Ridurre al minimo l'ipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani

Preparazione di fette cerebrali acute dal polo dorsale dell'ippocampo da roditori adulti

Preparazione di fette cerebrali acute dal polo dorsale dell'ippocampo da roditori adulti

Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo