This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer&#8217;s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.

NOTA: Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con gli standard etici approvati dalla commissione per la ricerca degli animali presso il sistema sanitario Veterans Affairs Palo Alto. 1. Golgi-Cox colorazione <ol><li> Estrazione del cervello e colorazione <ol><li> Il 1 ° giorno, anestetizzare profondamente topi con 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina prima eutanasia via dissanguamento. </li><li> Rimuovere con cautela la calotta cranica e sezionare il cervello. <ol><li> Prima rimuovere la pelle sulla parte superiore del cranio, ponendo una forbice curva sulla parte superiore del cervelletto e delicatamente tagliare il cranica parallelo al solco centrale con la punta della forbice rilevato verso l&#39;esterno, si muove nella direzione verso il bulbo olfattivo. Ripetere questa operazione su entrambi i lati. </li><li> Utilizzare un pincet chirurgica per sollevare il cranica mentre si gira verso i bulbi olfattivi e troncare. Quindi, capovolgere il cranio a testa in giù e utilizzare un plettro per tagliare attraverso l&#39;otticanervi e allentare il cervello. Infine, utilizzare il pick per separare il cervello dal midollo spinale a livello del foro occipitale. </li></ol></li><li> Immergere immediatamente il cervello in 15 ml di disponibile in commercio, diluito soluzione Golgi-Cox. Conservare il cervello in soluzione Golgi in una bottiglia di vetro da 20 ml con tappo a temperatura ambiente al buio. </li><li> Il giorno 2, versare lentamente la soluzione e sostituirla con 15 ml di soluzione fresca Golgi-Cox. Richiudere il flacone contenente il cervello e lasciare riposare per altri 9 giorni al buio. </li></ol></li><li> Sezioni e embedment <ol><li> Il giorno 11, mettere il cervello in soluzione di saccarosio del 30%, preparati in DDH 2 O per disidratazione. Cambiare la soluzione appena preparata con 30% di saccarosio dopo 12 ore. Incubare i cervelli in una soluzione di saccarosio al 30% per 3 giorni a 4 ° C. </li><li> Il giorno 14, riempire il serbatoio del vibratome con una soluzione di saccarosio al 30% fino a che la lama è coperto. Impostare la velocità di 1 mm / s con un&#39;ampiezza di 0,95 mm. </li><li> Asciugare il cervello con un Kimwipe per eliminare l&#39;umidità in eccesso e rimuovere il cervelletto con una lama di rasoio per tagliare coronale. </li><li> Saldamente montare l&#39;intero cervello sulla piattaforma vibratome utilizzando colla e lasciare riposare per 2-4 minuti. Inserire la piattaforma con il cervello aderito nel serbatoio e regolare la lama all&#39;inizio del cervello. </li><li> Utilizzando vibratome, la fetta di cervello in 150 micron sezioni spesse a temperatura ambiente, ricordandosi di cambiare la lama dopo ogni 3 cervello. </li><li> Raccogliete le sezioni dal serbatoio con uno spazzolino capovolto e immergerli in una capsula di Petri contenente 0,3% di gelatina fatta in DDH 2 O. Mentre le sezioni rimangono nella capsula di Petri, aggiungere 0,5 ml di 0,3% di gelatina in ogni diapositiva e utilizzare un pennello per diffondere e rivestire le SuperFrost + diapositive. </li><li> Raccogliere delicatamente le sezioni immerse dalla capsula di Petri e metterli sulle diapositive gelatinizzati. Orientare le sezioni di cervello datoccarli solo sui loro lati e non sulle parti superiori. </li><li> Dopo circa dieci minuti, ricoprire le sezioni con il 30% di saccarosio prima il tessuto asciuga completamente. Poi asciugare i vetrini preparati in un luogo buio in un rack scorrevole per 3 giorni. </li><li> Diluire disponibile in commercio 10x soluzione di sviluppo a 1x con DDH 2 O. Immergere i vetrini in soluzione di sviluppo per 7-10 min. Sciacquare i vetrini 3 volte in DDH 2 O. </li></ol></li><li> Disidratazione <ol><li> Preparare 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, e 95% di etanolo usando soluzioni distillata DDH 2 O. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo soluzioni sempre più elevati per 10 minuti ciascuna. </li><li> Immergere i vetrini in soluzione di etanolo al 100% per 3 volte per 10 minuti ogni volta. </li><li> Immergere i vetrini in 100% xilene 3 volte consecutive per 5 min ciascuna, mantenendo le sezioni nella soluzione finale fino a quando sono copertura scivolato. </li><li> Mettere una generosa quantità di DPX (Di-n-butil ftalato in xilene) mezzo di montaggio (about 1-1,5 ml) su ogni diapositiva con una pipetta di plastica. Posizionare con cura coprioggetto per evitare le bolle. </li><li> Coperchio a secco Air scivolato-cervello sezioni orizzontali per 3 giorni. </li></ol></li></ol> 2. Doublecortin colorazione <ol><li> Profondamente anestetizzare (vedi punto 1.1.1) gli animali. </li><li> Eseguire perfusione cardiaca con appena preparato 4% paraformaldeide fatto in tampone fosfato 12. </li><li> Estrarre il cervello (vedi 1.1.2) e conservare in 45 ml di paraformaldeide 4% a 4 ° C durante la notte su un agitatore a dondolo. </li><li> Trasferire il cervello per una soluzione di saccarosio al 30% e attendere la completa disidratazione per 48 ore a 4 ° C. Togliere il cervello dal saccarosio e metterli direttamente su blocchi di rame poste in ghiaccio secco. </li><li> Riempire il blocco con temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e segnare l&#39;orientamento del cervello utilizzando il bulbo olfattivo come punto di riferimento. </li><li> Utilizzando un criostato, tagliare 70 sezioni micron di spessore a -20 ° C e collocarliin soluzione crioprotettore (25% di glicole etilenico, glicerolo 25%, in tampone fosfato 0,05 M di sodio, pH 7,4) e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Effettuare una soluzione di 50% crioprotettore e 50% di metanolo. A questa soluzione aggiungere 0,5% di perossido di idrogeno (vol / vol). Incubare sezioni galleggianti per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sezioni caldi in 37 ºC a TBS (soluzione fisiologica tamponata con Tris) per 30-40 min mettendoli in un forno a istologico. </li><li> Incubare le sezioni con lo 0,3% tritone e siero di cavallo normale 3% per 45 minuti a temperatura ambiente prima della colorazione. Incubare sezioni a 4 ° C durante la notte in 3 ml di soluzione di anticorpo DCX diluito 1: 500 in TBS con 0,3% Triton e siero di cavallo normale 1%. </li><li> Il giorno seguente lavare sezioni 3 volte consecutive in TBS (10 min ciascuna). </li><li> Incubare sezioni con un anti-capra biotinilato cavallo (1: 200 in TBS) per due ore a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 3 volte consecutive in TBS (10 min ciascuna). </li><li> Incubare torlo con ABC Lite (1: 1.000) per 1,5 ore a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 5 ml di 30% H 2 O 2 ad una compressa di 10 mg di soluzione di DAB (3,3 &quot;-Diaminobenzidine) sciolti in 15 ml di 1 M Tris-HCl (pH 7,6). Incubare immediatamente sezioni in questa soluzione per 5 min. </li><li> Terminare la reazione mediante lavaggio con TBS ghiacciata tre volte seguito da un lavaggio in TBS a temperatura ambiente. </li><li> Disidratare sezioni utilizzando una serie di soluzioni di etanolo (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min ciascuna), xilene, e quindi coprire slittamento usando DPX come al punto 1.3. </li></ol> 3. Visualizzazione <ol><li> Dopo completa asciugatura delle sezioni, rimuovere l&#39;eccesso DPX sopra i vetrini con una lama affilata, e metterli in fase di scansione del microscopio. Il sistema è composto da un microscopio dotato di fase scansione, joystick, e una telecamera a colori 12 bit. </li><li> Avviare il programma. Aprire un nuovo file di dati. </li><li> Luogoun punto di riferimento sullo schermo cliccando con il puntatore del mouse in qualsiasi luogo. Questo attiverà tutte le icone dal pannello degli strumenti di finestra del programma. </li><li> Fare clic sull&#39;icona &quot;Joystick Free&quot; sulla barra degli strumenti e quindi utilizzare il joystick per individuare giro dentato dell&#39;ippocampo nella prima sezione. </li><li> Nella scheda &quot;Tools&quot; della finestra del programma, selezionare &quot;Gestione Sezioni seriale&quot;. Fare clic sull&#39;icona &quot;Nuova sezione&quot; nell&#39;angolo in basso a sinistra della finestra. Si aprirà la finestra &quot;Setup Serial Sezione&quot;. </li><li> Selezionare la finestra Serial Setup sezione e poi inserire il numero totale di sezioni che contengono regioni dell&#39;ippocampo. Selezionare l&#39;intervallo di valutazione. Inserire lo spessore della sezione di taglio (70 micron per DCX e 150 micron per le sezioni Golgi-colorate). </li><li> Avviare tracciando la regione giro dentato, cliccando sull&#39;icona &quot;Freehand Disegno a contorno&quot; nella barra degli strumenti. Delineare lo strato di cellule granulari dentate. &lt;/ Li&gt; <li> Selezionare &quot;100X&quot; dal menu &quot;Ingrandimento&quot;. Aggiungere una goccia di olio di immersione sulla sezione e passare l&#39;obiettivo di 100X. Individuare i corpi cellulari granuli dentate e dendriti nell&#39;ambito di tale obiettivo. </li><li> Concentrarsi su un neurone selezionato e fare clic sull&#39;icona &quot;Neuron Tracing&quot; sulla barra degli strumenti. Tracciare la circonferenza del corpo cellulare dei granuli dentate. Al termine l&#39;analisi, fare clic destro per selezionare &quot;Finish cellulare Body&quot;. </li><li> Avviare rintracciare i dendriti manualmente in x, y, e Z e seguire ogni ramo con la manopola joystick ez-motore. In un nodo biforcazione o triforcazione, selezionare la relativa opzione dal menu a discesa sulla destra del mouse. Tracciare ciascuno dei comparti che nascono da questi nodi. Al termine di ciascun ramo destro del mouse e selezionare &quot;Ending&quot; dal menu a discesa. </li><li> Utilizzando le icone dei tasti freccia nella finestra del software seleziona a caso un altro cellulare dei granuli dentate e seguire la stessa procedura described in fase 3,9-3,10. Salvare l&#39;intero tracciato. </li><li> Avviare il software tracciato neuronale. </li><li> Aprire il primo file di dati NRX dal primo mouse del gruppo sperimentale. Aggiunge il file NRX del secondo mouse del gruppo sperimentale. Continuare fino a quando tutti i file NRX di questo gruppo vengono aggiunti. </li><li> Nella scheda Analisi, selezionare &quot;Fan In-schema&quot;. Questo apre la In-analisi finestra Fan. Segno di spunta &quot;dendriti&quot; e fare clic su Visualizza, che raffigura le lunghezze e modelli di ramificazione di dendriti per questo gruppo di topi (figura 1). </li></ol> 4. EDFI NOTA: Questo metodo permette all&#39;utente di registrare rapidamente un gran numero di immagini attraverso l&#39;asse z di ciascun campo e generare un&#39;immagine 2D che contiene tutti i pixel focalizzato durante l&#39;asse z. Il risultato sarà un&#39;immagine composita che contiene tutti i pixel focalizzato da immagini raccolte. <ol><li> Collegare il microscopio ad una camma digitaleera. Collocare le sezioni prima sulla scena scansione collegato al microscopio e poi passare ad un obiettivo 10X. Spostare il palco per l&#39;area di interesse. </li><li> Avviare un programma di cattura video. </li><li> Premere il pulsante di registrazione. Non appena viene premuto il pulsante di registrazione, usare la manopola macro-focus per passare dalla parte superiore alla parte inferiore della sezione per un totale di 4 sec. Salvare il file video risultante. </li><li> Utilizzare ImageJ freeware per convertire i file video AVI in un formato non compresso aprendo il file e salvarli in formato non compresso. </li><li> Avviare un programma di analisi di immagine e aprire il file AVI. Vai al menu &quot;Azione&quot; e fare clic su &quot;profondità di campo estesa&quot;. Selezionare il file video corrispondente. In opzioni &quot;uscita&quot;, selezionare &quot;Genera Composite Best-Focus Immagine&quot;. </li><li> In Opzioni &quot;Analisi Focus&quot;, selezionare &quot;normalizzato Illumination&quot; e le opzioni &quot;Contrasto Locale Max&quot;. Quindi, selezionare &quot;Cremangiato &quot;. L&#39;immagine risultante rappresenta tutti i pixel focalizzato durante l&#39;asse z (Figura 2). </li><li> Salvare l&#39;immagine risultante. </li></ol> 5. Generare Estremamente ad alta risoluzione Immagini NOTA: Questo metodo consente all&#39;utente di generare automaticamente basso ingrandimento e immagini estremamente alta risoluzione di immagini ad alto ingrandimento ad alta risoluzione in modo automatizzato. <ol><li> Collocare le sezioni prima sulla scena scansione collegato al microscopio. Il microscopio è collegato ad una fotocamera digitale. Spostare il palco per l&#39;area di interesse. </li><li> Avviare un programma di acquisizione delle immagini. </li><li> Utilizzare un obiettivo 10X e di acquisire e salvare ad alta risoluzione (4076 x 3116), immagini dalla regione di interesse fare in modo di avere almeno il 10% di sovrapposizione. </li><li> Immagine Eseguire Composite Editor di unire immagini. </li><li> Vai al menu File, e cliccare su &quot;New Panorama&quot;. Selezionare la cartella in cui le immagini sono stORed. Selezionare le immagini che appartengono alla stessa regione e premere &quot;OK&quot;. </li><li> Premere il pulsante &quot;Esporta su disco&quot; e salvare l&#39;immagine. Questa immagine rappresenta un&#39;immagine ad alta risoluzione estremamente dell&#39;area di interesse che potrebbero essere utilizzati per l&#39;analisi e / o dimostrazione (Figura 3). </li></ol>

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Qui, due metodi sono stati descritti per quantificare l&#39;entità del dendritica in neuroni maturi e appena nati con metodi di colorazione convenzionali in collaborazione con RTI e EDFI. L&#39;acquisizione di immagini ad alta risoluzione di neuroni fornisce un metodo estremamente utile per testare gli effetti deleteri di malattie neurodegenerative e, a sua volta, fornisce un mezzo per valutare strategie terapeutiche che colpiscono i neuroni ippocampali. Mentre il metodo RTI stato utilizzat...

Alterazioni dinamiche nel numero e la struttura delle sinapsi sono le caratteristiche distintive di sviluppo, l&#39;invecchiamento, e numerose malattie neurodegenerative 1-3. La capacità dei neuroni di ricevere e integrare le informazioni sinaptica dipende morfologia dendritica e alterazioni dinamiche connessioni sinaptiche. Infatti, esiste una correlazione positiva tra spine dendritiche e il numero di sinapsi, che sia un impatto funzione cognitiva 4. Quindi, non è sorprendente che decrementi in numero spine dendritiche sono stati associati a disfunzioni cognitive in una serie di disturbi neurologici 5-7, spingendo grande interesse spine dendritiche quantificazione. Tuttavia, la quantificazione della densità delle spine rimane un lungo e noioso compito che non riesce a generare informazioni utili per quanto riguarda la topografia e la distribuzione delle sinapsi in tutto il albero dendritiche. Fortunatamente, metodi di colorazione (ad esempio, Golgi-Cox e doublecortin (DCX)), in combinatocon tecniche di imaging sofisticate può essere utilizzata per superare gli attuali ostacoli e di produrre immagini ad alta risoluzione di dendritica in modo affidabile e rapido. Mentre metodo di colorazione Golgi-Cox può essere implementato per valutare lo stato di dendritica in tutti i neuroni 8, DCX può essere implementato di etichettare i neuroni appena nati in particolare nel giro dentato e zona subventricolare 9, una considerazione importante dato che la neurogenesi si verifica in entrambi queste regioni in tutto il ciclo di vita 10,11. Dopo la colorazione, due metodi di imaging sono stati dispiegati per valutare caratteristiche dendritiche: i) l&#39;imaging in tempo reale (RTI) e ii) ha esteso la profondità di campo dell&#39;imaging (EDFI). La tecnica RTI fornisce un mezzo per rintracciare e quantificare la lunghezza e ordine delle arborization lungo i singoli segmenti dendritiche e rami. Così permette di stimare la superficie totale e volume occupato da ciascun albero dendritico. Più specifically, nel metodo RTI l&#39;utente identifica continuamente i segmenti e riorienta iterativamente il neurone tracciamento software raccoglie x, y, z e le coordinate della struttura dendritica e ricostruisce la traiettoria della struttura dendritica in 3D. Comparativamente, il metodo EDFI fornisce un mezzo piuttosto semplici e accelerate per valutare la densità dendritica in campioni di tessuto piuttosto spesse generando un&#39;immagine composita, fornendo informazioni sull&#39;intero asse z. Per fare ciò, l&#39;utente registra file video ad alta definizione in tutto lo spessore della sezione e quindi utilizza il software per cercare i fotogrammi video per identificare i punti in cui un pixel è completamente a fuoco. Successivamente, i pixel mirati sono fusi e integrati in un ad alta risoluzione, immagini 2D composita. Questa immagine composita contiene tutti i pixel che sono stati in-fuoco indipendentemente dalla loro posizione nell&#39;asse z. Analisi qualitativa e quantitativa di queste immagini 2D può essere utilizzato successivamente per determinare la densitàdi ramificazione dendritica in ogni campo. Infine, vi presentiamo un metodo per la generazione di immagini panoramiche estremamente ad alta risoluzione per l&#39;analisi e la valutazione dei dendriti in un&#39;intera regione di interesse. Questa tecnica può essere impiegata per superare la mancanza di accesso a molto ad alta risoluzione e fotocamere digitali costose. Utilizzando questo metodo, si cattura immagini seriali in diverse località lungo la xey assi e quindi automaticamente punti insieme con un freeware (per esempio, immagine Composite Editor). In particolare, questo metodo può essere utilizzato per la valutazione qualitativa e quantitativa di dendritica in piuttosto ampio spazio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="960">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:272px;">Name</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:267px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Modified Golgi-cox staining solution&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Weill Cornell Medical College</td>
			<td style="width:267px;">NA</td>
			<td style="width:159px;">store at 4&#176;C till use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">1x Developing Solution (Stock 10x)</td>
			<td style="width:263px;">Weill Cornell Medical College</td>
			<td style="width:267px;">NA</td>
			<td style="width:159px;">store at 4&#176;C till use</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:272px;">30% Sucrose,</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 57-50-1</td>
			<td style="width:159px;">make fresh &#160;in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">0.3% Gelatin</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 9000-70-8</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:272px;">Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS 603-003-00-5</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Xylene</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 1330-20-7</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DPX Medium</td>
			<td style="width:263px;">EMS&#160;</td>
			<td style="width:267px;">#13510</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost (+) white</td>
			<td style="width:263px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:267px;">71869-10</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)</td>
			<td style="width:263px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:267px;">#4811-703</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DCX Antibody</td>
			<td style="width:263px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:267px;">sc-8066</td>
			<td style="width:159px;">4 C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DAB</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS Number 91-95-2 &#160;</td>
			<td style="width:159px;">-20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">OCT</td>
			<td style="width:263px;">Tissue-tek</td>
			<td style="width:267px;">4583</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Tris</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS Number 77-86-1 &#160;</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">ABC Lite</td>
			<td style="width:263px;">Vector</td>
			<td style="width:267px;">PK4000</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:272px;">Name</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:267px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">DS-Ri1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">12 bit Camera&#160;</td>
			<td style="width:263px;">QImaging&#160;</td>
			<td>01 MBF2000RF-CLR-12</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Neurolucida System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td style="width:267px;">V.10</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Image Composite Editor</td>
			<td style="width:263px;">Microsoft</td>
			<td>1.4.4.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">NIS Elements</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">F 3.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Image Pro Plus</td>
			<td style="width:263px;">Mediacy</td>
			<td>Versin 7.00</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of dendritic arborization in the dentate gyrus of the hippocampal region in mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

L&#39;entità del arborization derivanti da granuli dentati esistenti e appena nati è stato analizzato in topi wild type utilizzando Golgi-Cox o DCX colorazione (Figura 1). Segmenti di cellule dendritiche DCX-positivi sono stati trovati per essere lunga 13-36 micron. La distribuzione normale di lunghezza dendritiche è stata testata utilizzando il test Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p &lt;0,01, Liliefors p &lt;0,001; figure 4 e 5). Nell&#3...

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Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

assessment-dendritic-arborization-dentate-gyrus-hippocampal-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.2K Views.  VA Palo Alto Health Care System. We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

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Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Ricerca

Neuroscienze

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

L'uso di traccia Eyeblink condizionamento classico per valutare la disfunzione Hippocampal in un modello del ratto dei disturbi dello spettro fetale alcol

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Analisi quantitativa di un neurone Arborization dentritico complessità in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for various neurological and psychiatric disorders. HFS in the deep region of the brain, also named deep-brain stimulation (DBS), is becoming increasingly important in clinical trials. Recent progress in the field of high-frequency DBS (HF-DBS) surgery has begun to spread the possibility of utilizing this invasive technique to other situations, such as treatment for major depression disorder (MDD), obsessive-compulsive disorder (OCD), and so on. 
Despite these expanding indications, the underlying mechanisms of the beneficial effects of HF-DBS remain enigmatic. To address this question, one approach is to use implanted electrodes that sparsely activate distributed subpopulations of neurons by HFS. It has been reported that HFS in the anterior nucleus of the thalamus could be used for the treatment of refractory epilepsy in the clinic. The underlying mechanisms might be related to the increased neurogenesis and altered neuronal activity. Therefore, we are interested in exploring the physiological alterations by the detection of neuronal activity as well as neurogenesis in the mouse dentate gyrus (DG) before and after HFS treatment. 
In this manuscript, we describe methodologies for HFS to target the activation of the DG in mice, directly or indirectly and in an acute or chronic manner. In addition, we describe a detailed protocol for the preparation of brain slices for c-fos and Notch1 immunofluorescent staining to monitor the neuronal activity and signaling activation and for bromodeoxyuridine (BrdU) labeling to determine the neurogenesis after the HF-DBS induction. The activation of the neuronal activity and neurogenesis after the HF-DBS treatment provides direct neurobiological evidence and potential therapeutic benefits. Particularly, this methodology can be modified and applied to target other interested brain regions such as the basal ganglia and subthalamic regions for specific brain disorders in the clinic.

This protocol shows how to set up a reliable HFS method in mice. Neurons throughout the hippocampal dentate gyrus are electrically stimulated by HFS directly and indirectly in vivo. Neuronal activity and molecular signaling are examined by c-fos and Notch1 immunofluorescent staining, respectively; neurogenesis is quantified by bromodeoxyuridine labeling assay.

Un metodo invasivo per l'attivazione della circonvoluzione dentata del Mouse dalla stimolazione ad alta frequenza

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

Il potere di Interstimulus intervallo per la valutazione di elaborazione temporale in roditori

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.