Il protocollo qui presentato riduce l'eccessivo danno ipossia durante la preparazione di fette ippocampali di topo adulte e invecchianti, rimuovendo così un grosso ostacolo per lo studio della funzione dei circuiti neurali maturi e invecchiati. L'introduzione dell'ipotermia nelle soluzioni senza sodio si traduce in fette ippocampali che sono sane fino a 10 ore dopo il taglio e appropriate sia per le registrazioni sul campo a lungo termine che per gli studi di patch-clamp. Questo metodo di preparazione delle fette ippocampali potrebbe essere particolarmente rilevante per i modelli animali nelle malattie neurodegenerative che per definizione richiedono una preparazione cerebrale invecchiata.
Il passaggio più critico di questo protocollo è l'introduzione dell'ipotermia tramite profusione trascardica con una soluzione ghiacciata. Con una certa pratica, i ricercatori saranno in grado di eseguire in modo affidabile questo passaggio. Inizia preparando un litro di soluzione aCSF per la camera di recupero e le registrazioni successive.
Quindi preparare 300 millilitri di NMDG-aCSF per la profusione trascardica e le fasi di taglio. Posizionare il vassoio di taglio del microtomo vibrante e il disco di montaggio in un congelatore meno 20 gradi Celsius. Per preparare la camera di recupero, riempirla appena sopra la fetta che tiene la maglia e avviare il bubbler mantenendo la camera sul banco a temperatura ambiente.
Raffreddare tutti i 300 millilitri di NMDG-aCSF in un congelatore fino a quando i cristalli di ghiaccio iniziano a formarsi sulla superficie e sulle pareti della bottiglia. Posizionare la bottiglia con refrigerato e NMDG-aCSF sul ghiaccio e bollarla, mantenendo la soluzione tra zero e due gradi Celsius. Togliere il disco di montaggio del tessuto dal congelatore e asciugarlo, se necessario.
Ritaglia un blocco di agar al 5% delle dimensioni di un cervello di topo e incollalo al centro del disco usando un sottile strato di colla cianoacrilato. Posizionare il disco con agar incollato sul ghiaccio e coprirlo con tovaglioli di carta fino a quando non è pronto per l'uso. Togliere il vassoio di taglio dal congelatore, posizionarlo nel microtomo, quindi circondarlo di ghiaccio e caricare la lama.
Preparare tutti gli strumenti in anticipo per la dissezione cerebrale. Impostare la pompa peristaltica per la perfusione trascardica. Inserire un lato del tubo della pompa nella bottiglia con NMDG-aCSF ghiacciato e montare l'altro lato con un ago calibro 27.
Impostare la velocità della pompa su circa 3,5 millilitri al minuto. A questa velocità, il deflusso di un NMDG-aCSF è un viaggio veloce, non un flusso continuo. Posizionare il mouse sulla schiena su un pannolino.
Prima di continuare, ha confermato che il topo si trova su un piano chirurgico di anestesia eseguendo un pizzico di dito del piedi. Il topo non deve rispondere, quindi assottigliato le zampe anteriori e posteriori in modo che il torace e l'addome siano esposti. Ritaglia una grande macchia della pelle sul petto, andando da sotto lo sterno alla gola.
Afferrare lo sterno con le forcep, sollevarlo delicatamente e iniziare a tagliare attraverso la gabbia toracica su entrambi i lati fino a quando la cavità toracica non è esposta. Tagliare il diaframma, lasciando il lembo della gabbia toracica attaccato tramite un sottile pezzo di muscolo. Dovrebbe essere possibile rlo da parte senza farlo ripierere sulla cavità toracica esposta.
Controllare che il cuore batte ancora e assicurarsi che la maggior parte del fegato sia visibile. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro, che sembra di colore più chiaro rispetto a destra. Per stabilizzare l'ago, guidarlo attraverso le costole rimanenti sul lato sinistro del corpo.
Individuare l'atrio destro di colore rosso scuro e tagliarlo con piccole forbici. Il sangue dovrebbe iniziare a scorrere. Avvia la pompa e osserva il fegato, che cambierà colore dal rosso al marrone.
Monitorare il colore del fegato e continuare la perfusione fino a quando il fegato diventa marrone pallido. Eseguire la pompa per qualche altro minuto. La temperatura corporea dell'animale dovrebbe scendere a 28-29 gradi Celsius e il suo naso dovrebbe essere freddo al tatto.
Decapitare il topo con grandi forbici di decapitazione, quindi utilizzare un bisturi con una lama numero 10 per aprire la pelle sopra il cranio. Con piccole forbici angolate, taglia il cranio alla linea mediana. Quindi, usa le pini numero tre per allontanare la metà destra e sinistra del cranio, facendo attenzione a portare via la dura con esso.
Rimuovere il cervello, che dovrebbe essere un colore bianco sconto raccogliendolo con una spatola e lasciarlo cadere nella soluzione NMDG-aCSF sul ghiaccio. Lascialo lì per un massimo di un minuto. Estorsi il cervello dall'NMDG-aCSF e posizionarlo su un pezzo di carta da filtro.
Tagliare e rimuovere un cuneo di tessuto di 60 gradi con uno strumento di 60 gradi centrato sulla linea mediana dall'estremità rostrale del forebrain. Utilizzare i lati tagliati della superficie di montaggio in quanto fornisce l'angolo corretto per le fette ippocampali. Separare gli emisferi lungo la linea mediana con il bisturi e incollarli sul disco di montaggio.
Prendere il disco di montaggio dal ghiaccio e asciugarlo, se necessario. Quindi incollare ogni emisfero di fronte al blocco di agar, tagliare lateralmente verso il basso. Assicurarsi che i lati ventrali di entrambi gli emisferi tocchino il blocco di agar e che i lati dorsali di entrambi gli emisferi siano rivolti verso la lama.
Quando incollato sul lato tagliato, ogni emisfero dovrebbe essere orientato rispetto alla lama in modo da garantire fette trasversali dell'ippocampo dorsale in situ. Immergere il disco con gli emisferi in una camera di taglio contenente NMDG-aCSF carbogenato ghiacciato. Tagliare una sezione di 400 micrometri, quindi utilizzare una pipetta di trasferimento usa e getta con una punta di taglio per trasferire la fetta in una camera di recupero contenente NMDG-aCSF carbogenato a temperatura ambiente.
Continuare a tagliare il resto delle sezioni e trasferirle nella camera di recupero non più di 10 minuti per tagliare un totale di otto-10 fette dalla regione dell'ippocampo dorsale. Incubare le fette a temperatura ambiente per circa due ore prima della registrazione. Questo protocollo è stato utilizzato per generare fette ippocampali da topi adulti.
Un gran numero di cellule piramidali nel campo CA1 e nel subicolo appaiono in basso contrasto, un segno distintivo delle cellule sane, quando osservate sotto microscopia a contrasto differenziale infrarosso. Le registrazioni patch-clamp possono essere ottenute da neuroni CA1 di topi che hanno più di sei mesi. Nell'esperimento di esempio qui, la frequenza delle correnti postsinaptiche eccitatorie in miniatura è stata misurata dopo che NMDA-LTD è stato indotto rispetto alle condizioni di controllo.
La frequenza delle correnti postsinaptiche eccitatorie in miniatura era inferiore nei neuroni dopo un'induzione di NMDA-LTD, indicando la potatura dipendente dall'attività delle sinapsi in CA1. Non sono stati rilevati cambiamenti di ampiezza. Durante le registrazioni mEPSC, le cellule CA1 sono state riempite anche biocitina e arbor dendritico intatto e habitus cellulare sano dei neuroni piramidali possono essere visti qui.
Una robusta distribuzione del colorante fluorescente in tutta la cellula consente l'analisi di dendriti e spine dendritiche in diverse condizioni. È stato osservato un potenziamento a lungo termine, o LTP, delle sinapsi CA3-CA1 di circa il 170%, suggerendo che il mantenimento delle cascate di segnalazione necessarie per l'LTP è presente in fette preparate da topi adulti. Un robusto segnale potenziale postinaptico eccitatorio sul campo suggerisce che anche la connettività di rete è stata preservata.
Due aspetti critici del protocollo sono la profusione trascardica con una soluzione ghiacciata per indurre l'ipotermia e l'introduzione di un NMDG come sostituto degli ioni di sodio nelle soluzioni per prevenire l'edema citotossico. Usando queste precauzioni, le fette acute possono essere preparate da qualsiasi regione cerebrale. Inoltre, le fette preparate in questo modo possono essere utilizzate per l'imaging di calcio e tensione utilizzando microscopia a due fotoni o a campo largo.
Questo protocollo potrebbe servire come base per una preparazione standardizzata per le fette ippocampali acute degli animali che invecchiano e quindi facilitare il confronto tra gli studi nel contesto dei meccanismi delle malattie neurodegenerative.
