Ricerca nel laboratorio di Robinson è sostenuta da finanziamenti da Colonia Cluster di eccellenza sulle risposte di Stress cellulare nelle malattie di Aging-Associated, Università di Colonia, Germania (CECAD; finanziato dal DFG nell'ambito dell'iniziativa di eccellenza della Repubblica federale tedesco e Dichiari i governi) e sovvenzioni dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Fortuna Köln e Maria-Pesch Foundation dell'Università di Colonia, Germania.

tutti i passaggi che implicano l'uso di patogeni S. typhimurium deve essere eseguito in un BSL-2 o maggiore sicurezza biologica livello struttura. La cultura e la spalmatura di S. Typhimurium, come pure l'infezione dei macrofagi derivate da midollo osseo (BMDMs) deve essere eseguita sotto cappa a flusso laminare per prevenire la contaminazione. L'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi può essere eseguita su qualsiasi banco di laboratorio BSL-2.
 l'estrazione del midollo osseo da topi per relativa differenziazione in macrofagi è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzionali sul benessere degli animali e approvato dall'Agenzia dello stato della Renania settentrionale-Vestfalia per la natura, Ambiente e tutela dei consumatori [Landesamt für Natur, Umwelt e Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; File no: 84-02.05.40.14.082 e 84-02.04.2015.A443] e l'Università di Colonia.
 1. Culturing S. typhimurium <ol><li>inoculare S. typhimurium (Ceppo SL1344) da una singola colonia batterica in 5 mL di brodo di infusione (BHI) cuore cervello utilizzando un ciclo batterico.</li>
	<li>Incubare la sospensione batterica in un incubatore a 37 ° C durante la notte con agitazione.</li>
	<li>Il giorno seguente, trasferire 1 mL di sospensione batterica in 19 mL di brodo BHI in una beuta e incubare a 37 ° C in un incubatore con agitazione.</li>
	<li>Monitorare l' S. typhimurium crescita misurando la densità ottica (OD) a 600 nm (OD 600) con uno spettrofotometro. Le misurazioni devono essere effettuate circa ogni 30 min.</li>
	<li>OD quando 600 raggiunge 1,0, rimuovere la sospensione batterica dall'incubatore e trasferimento in tubo da 50 mL. Centrifugare i batteri a 5.400 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere in 10 mL di soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS).</li>
	<li>Centrifugare a 5.400 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere i batteri in 4,9 mL di PBS sterile.</li>
</ol> 2. Rivestimento di S. typhimurium con biglie magnetiche NHS-biotina/streptavidina-coniugato biotina <ol><li>aggiungere 100 µ l di 10 mg/mL soluzione (NHS-biotina disciolto in dimetilsolfossido, DMSO) preparata, la sospensione batterica di collegamento preparato nel passaggio precedente. Ad esempio, diluire 5 mg di NHS-biotina in 0,5 mL di DMSO sterile. Mix correttamente pipettando su e giù più volte.</li>
	<li>Dividere il mix in cinque provette da 1,5 mL.</li>
	<li>Incubare per 2 ore a temperatura ambiente (TA) su un termoblocco con agitazione costante a 350 giri/min.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 15.000 x g per 10 min a RT e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere in 1 mL di PBS sterile, centrifuga a 15.000 x g per 10 min a RT e scartare il surnatante.</li>
	<li>Ripetere passo 2.5 due volte per rimuovere completamente la biotina in eccesso che collega soluzione.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Trasferire 100 µ l di soluzione di coniugato streptavidina biglie magnetiche di 10 mg/mL in una provetta da 1,5 mL e lasciarlo sul rack magnetico per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il solvente con una pipetta, prendere la soluzione di biglie magnetiche streptavidina-coniugato dal rack magnetico e risospendere le con 1 mL di sospensione batterica rivestito di biotina preparata al punto 2.7.</li>
	<li>Incubare per 1h a RT su un thermoblock con agitazione costante a 350 giri/min.</li>
	<li>Posto la soluzione su rack magnetico; aspettare 5 minuti e poi rimuovere con una pipetta i batteri che non aderiscono alla parete (tenerlo in una provetta etichettata come &#34; non rivestita batteri &#34;). La frazione che aderisce alla parete del tubo a contatto con il magnete è il batterio biotina/streptavidina-rivestito.</li>
	<li>Rimuovere il tubo contenente i batteri con etichettati dal rack magnetico e risospendere in 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Riposizionarlo sul rack magnetico, attendere 5 min e utilizzare una pipetta per rimuovere il PBS.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.13 e 2.14 altre due volte per rimuovere tutti i batteri che non sono rivestiti con i branelli magnetici streptavidina coniugata.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere i batteri rivestito in 500 µ l di PBS sterile ed etichettare il tubo come &#34; rivestito di batteri &#34;.</li>
	<li>Contare le unità formanti colonia (UFC di entrambi) &#34; batteri non rivestiti &#34; e &#34; rivestito di batteri &#34; soluzioni di placcatura diluizioni seriali su piastre di agar BHI. Circa 2 x 10 8 cfu/mL di batteri rivestiti sono ottenuti da 20 mL di sospensione batterica iniziale con OD 600 di 1.0. Mantenere la sospensione batterica rivestito a 4 ° C per essere usati il giorno seguente per infettare i macrofagi.</li>
</ol> 3. Infezione di BDMDs <ol><li>lo stesso giorno quando i batteri sono rivestiti con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata, piastra completamente differenziato BMDMs 22 in piatti di 6 cm con una densità di 5 x 10 6 cellule per piatto.</li>
	<li>Il giorno successivo, centrifugare la sospensione batterica rivestito a 15.000 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere in medium di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) ad una concentrazione di 10 x 10 6 cfu/mL.</li>
	<li>Per infettare i macrofagi ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10, rimuovere il supporto dal BMDMs e aggiungere 5 mL di sospensione batterica rivestito preparato. MOI ottimale può essere valutata per ogni tipo di cellula o scopo sperimentale dell'isolato fagosomi.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 10 min per sincronizzare fagocitosi.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO 2 per 30 min ad avviare la fagocitosi. Altri tipi di cellule possono richiedere tempi diversi di incubazione per garantire l'internalizzazione dei batteri.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo contenente batteri dai piatti e lavare le cellule con RPMI tre volte a rimuovere i batteri non interiorizzato.</li>
	<li>Infine aggiungere 10 mL di RPMI contenente 10% FBS e gentamicina 50 µ g/mL per uccidere tutti i batteri non-phagocytized.</li>
	<li>Incubare il BMDMs infetti a 37 ° C con 5% CO 2 finché il tempo desiderato. Il punto di tempo desiderato deve essere determinato sperimentalmente secondo i batteri e tipo di cellulare utilizzato e lo scopo di analisi. Per lo studio degli eventi di fusione fagosoma-endosomi precoci in S. BMDMs typhimurium-infettati, è consigliabile un'incubazione di 30 min. Per l'analisi degli eventi successivi, fagosomi possono essere estratte dopo 2 o 4 ore di incubazione. Incubazione prolungata dei macrofagi con S. Typhimurium oltre 24 h provoca la morte dei macrofagi. Estesi, infezione intracellulare prima l'estrazione phagosome probabilmente potrebbe portare alla degradazione delle molecole di biotina. Tuttavia, non abbiamo osservato perdita di biotina sui batteri rivestito fino alle h. 24</li>
</ol> 4. Isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi buffer di isolamento <ol><li>preparare il volume del fagosoma richiesto un (50 mM tubi, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) aggiungendo ditiotreitolo (DTT) a una concentrazione finale di 1 mM, citocalasina B ad un finale concentrazione di 10 µM e proteasi e fosfatasi inibitori come consigliato dal produttore. 
	Nota: DTT e Cytochalasin B devono essere aggiunti per il tampone di isolamento phagosome A sempre immediatamente prima dell'uso. Cytochalasin B sconvolge il citoscheletro, facilitando la rottura della membrana cellulare.</li>
	<li>Al momento desiderato punto, rimuovere il mezzo da cellule infette e lavare con PBS sterile riscaldato a RT.</li>
	<li>Aggiungere 750 µ l di phagosomisolamento e tampone A ogni piatto e incubare per 20 minuti sul ghiaccio. Quando si utilizzano numeri differenti delle cellule, il volume di tampone di isolamento A dovrebbe essere regolato proporzionalmente.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l di tampone di phagosome isolamento B (tubi di 50 mM, pH.7, MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM mannitolo e saccarosio 68 mM). Roccia la piastra per assicurare che il buffer raggiunge la superficie del piatto. Quando si utilizzano numeri differenti delle cellule, il volume di tampone di isolamento B deve essere regolato proporzionalmente.</li>
	<li>Rimuovere le cellule dal piatto raschiando delicatamente utilizzando un poliziotto di gomma e trasferirli in una provetta da 1,5 mL pre-refrigerati.</li>
	<li>Passare la sospensione cellulare attraverso un ago 26G utilizzando una siringa da 1 mL almeno 15 volte (uno aspirazione più una espulsione della sospensione la conta delle cellule come una volta). Questo è sufficiente per rilasciare il contenuto citosolico di BMDMs. Il numero di passaggi attraverso l'ago deve essere ottimizzato per ogni tipo di cellula.</li>
	<li>Posizionare la sospensione cellulare sul rack magnetico e attendere 5 min. Le particelle attaccate al magnete sono fagosomi contenenti rivestito - S. Typhimurium. La sospensione contiene il resto dei componenti cellulari.</li>
	<li>Trasferire la sospensione in una provetta da 1,5 mL etichettata come &#34; citosol &#34;.</li>
	<li>Rimuovere il tubo con i fagosomi isolati dal rack magnetico e li risospendere in 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Posizionare la sospensione phagosome al ripiano magnetico, attendere 5 minuti e rimuovere il PBS.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 4.9 e 4.10 per lavare l' isolato S. typhimurium-contenente fagosomi.</li>
	<li>, Infine, rimuovere il PBS e risospendere i fagosomi nel buffer richiesto; ad esempio, in un tampone del saggio (RIPA) radioimmunoprecipitation per l'analisi della proteina. Circa il 50-200 µ g di proteina è ottenuta per campione seguendo questo protocollo, a seconda della quantità iniziale di cellule e il MOI di infezione.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un nuovo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi rivestendo i batteri con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata è descritto qui. Dopo la rottura della membrana cellulare delicata, fagosomi contenenti batteri possono essere facilmente estratte mediante un rack magnetico. Indichiamo che l'etichettatura dei batteri conserva la capacità dell'agente patogeno per indurre l'infiammazione e non altera la proprietà fagocitaria della cellula ospite. D'importanza, fagosomi ott...

I macrofagi sono in circolazione le cellule fagocitiche specializzate che rilevare, inghiottono e degradano qualsiasi particella estranea presente nei tessuti periferici, che vanno da cellule apoptotiche a microrganismi come i batteri d'invasione. Al momento della rilevazione di recettore superficiale di marcatori specifici patogeni comunemente presenti sulla superficie dei microrganismi (noto come pattern molecolari associati o PAMPs), macrofagi avviare una riorganizzazione complessa della membrana cellulare in ordine per circondare e phagocytize l' agente patogeno1.
L'agente patogeno tratta quindi è contenuto dal macrofago in una vescicola intracellulare conosciuto come fagosoma. Attraverso una serie di fusione e fissione eventi con altre vescicole come gli endosomi ed i lisosomi, contenenti patogeno phagosome acquisisce una serie di proteine necessarie per l'eliminazione del contenuto phagosomal. Pertanto, la composizione enzimatica di phagosome è altamente variabile nel corso di questo processo, noto come phagosome maturazione2.
Poco dopo la fagocitosi, il multimerici complessi vacuolar ATPasi (v-ATPasi) sono incorporato nella membrana del fagosoma da fusione con gli endosomi3. Questo complesso utilizza ATP ai protoni pompa dal cytosol al lumen del fagosoma4. L'acidificazione di phagosome è essenziale per gli eventi di fusione con altre vescicole5 e per l'attivazione di un gran numero di enzimi degradativi dipendente dal pH6. Un altro complesso enzimatico multimerici che è rapidamente assemblato sulla membrana phagosome è il complesso di NADPH-ossidasi (NOX). Complesso di NOX si ossida NADPH per la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) che sono secreti nel lume del fagosoma e che contribuiscono significativamente all'uccisione dei microrganismi tratta7.
Durante le fasi iniziali di maturazione, fagosomi presentano gli indicatori in genere quali Rab5 e Rab7 di endosomi precoci e tardivi, rispettivamente con la subunità di0 V dell' v-ATPasi8. Fusione di fagosomi con i lisosomi e late endosomes risultati nell'esposizione dell'agente patogeno phagocytized a una vasta gamma di enzimi idrolitici come β-galattosidasi9, lipasi e proteasi catepsina. L'acidificazione del lume è inoltre necessario per l'attivazione di questi enzimi. Ad esempio, la scissione della catepsina D per produrre la forma breve attiva è dipendente dal pH10. Questi enzimi degradano l'agente patogeno e mediano la produzione dei peptidi corti patogeno-derivati che sono presentati da macrofagi di istocompatibilità (MHC) classe II molecole complesse alle cellule di T di innescare una risposta immunitaria adattativa11.
Quindi, la maturazione del fagosoma è cruciale per la risposta immunitaria innata e collega le braccia innate e adattativa del sistema immunitario. Non è una sorpresa che gli agenti patogeni hanno evoluto strategie per superare l'eliminazione dai macrofagi attraverso il processo di maturazione del fagosoma sopra descritte. Ad esempio, i batteri intracellulari tubercolosi del micobatterio e Legionella pneumophila impediscono la maturazione del fagosoma d'inibizione dell'Assemblea del v-atpasi e lume conseguente acidificazione12,13 . Altri batteri, come Listeria monocytogenes o Shigella flexneri inducono la formazione di pori nella membrana del fagosoma per scappare verso il citosol14,15. D'altra parte, Salmonella enterica sierotipo typhimurium (S. typhimurium) è in grado di modificare le proprietà di phagosome all'interno del vacuolo per trasformarla in un luogo adatto per sua replica16. Questa capacità rende S. typhimurium un modello molto interessante per studiare interferenza patogeno-mediata di maturazione del fagosoma.
S. typhimurium è un batterio intracellulare facoltativo che causa gastroenterite in esseri umani. Dopo l'invasione della lamina propria, S. Typhimurium batteri sono rapidamente rilevati phagocytized da macrofagi e contenuti all'interno di fagosomi17. Alcuni rapporti hanno descritto in precedenza che S. typhimurium-fagosomi contenenti presentano responsabili per sia gli endosomi ed i lisosomi18, e altri studi hanno trovato fusione fagosoma-lisosoma ha impedito al S. Typhimurium infezione19.
Inizialmente, maturazione di phagosome su S. l'infezione typhimurium è stato studiato da microscopia di immunofluorescenza. Lo sviluppo di tecniche per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi attivato uno studio più accurato del contenuto phagosome in termini di indicatori endosoma e lisosoma. Ad oggi, il metodo principale utilizzato per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi è il frazionamento subcellulare il saccarosio passo gradienti18,20. Tuttavia, questo metodo richiede più passaggi di centrifugazione che possono causare danni meccanici alla fagosomi, possono influenzare la stabilità dei componenti phagosomal (proteine e lipidi) e richiede molto tempo. Inoltre, si richiede l'utilizzo di un'ultracentrifuga: un pezzo di attrezzature specializzate che non sono accessibile per ogni laboratorio.
Recentemente, un nuovo approccio è stato applicato per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi, in cui gli agenti patogeni batterici sono etichettati con biotinilati lipopetide (Lipobiotin) e successivamente estratte utilizzando streptavidina coniugata biglie magnetiche21 . Proponiamo un metodo alternativo e complementare di etichettatura batteriche superficiali contenenti macromolecole con NHS-biotina seguita da streptavidina coniugata biglie magnetiche. Fagosomi ottenuti con questo metodo sono altamente arricchiti in indicatori endosoma e lisosoma e possono essere utilizzati per un'ampia gamma di dosaggi, di analisi della proteina di omics analisi. Inoltre, non richiede attrezzature specializzate come ultracentrifughe. Inoltre, eliminando le fasi di centrifugazione, sia il danno meccanico al fagosomi e la quantità di tempo impiegata notevolmente sono ridotti. Questo metodo può essere facilmente adattato per l'isolamento di fagosomi contenenti altri batteri, come i batteri Gram-positivi Staphylococcus aureus, anche incluso in questo manoscritto. In sintesi, questo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi è un semplice, conveniente, e meno tempo rispetto all'isolamento classica di saccarosio gradiente-ultracentrifugazione, rendering altamente arricchito fagosomi contenenti batteri.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Streptavidin</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL or DynaMag Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial loop (10&amp;micro;l)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td><td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta-actin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anti-mCherry antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab5 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab7 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>anti-cathepsin D antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tomm20 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>anti-calnexin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20357</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages

Salmonella typhimurium è un batterio intracellulare facoltativo che causa gastroenterite in esseri umani. Dopo l'invasione della lamina propria, S. typhimurium batteri sono rapidamente rilevati e phagocytized da macrofagi e contenuti in vescicole conosciute come fagosomi al fine di essere degradato. Isolamento di S. typhimurium-fagosomi contenenti sono stati ampiamente usati per studiare come S. typhimurium infezione altera il processo di maturazione del fagosoma per impedire la degradazione batterica. Classicamente, l'isolamento di batteri contenenti fagosomi è stata eseguita da centrifugazione in gradiente di saccarosio. Tuttavia, questo processo richiede tempo e richiede attrezzature specializzate e un certo grado di destrezza. Qui descritto è un metodo semplice e rapido per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina-streptavidina-coniugato biglie magnetiche. Fagosomi ottenuti con tale metodo possono essere sospeso in qualsiasi buffer di scelta, consentendo l'utilizzazione dell'isolato fagosomi per una vasta gamma di saggi, quali l'analisi della proteina, metabolita e dei lipidi. In sintesi, questo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi è specifico, efficiente, rapida, richiede attrezzature minime ed è più versatile rispetto al classico metodo di isolamento di ultracentrifugazione gradiente di saccarosio.

Isolamento di batteri contenenti fagosomi dal presente protocollo richiede il biotinylation dei batteri come un primo passo. Quindi abbiamo valutato l'efficacia di S. typhimurium biotinylation dall'analisi di microscopia confocal di BMDMs infettato biotinilati mCherry -S. typhimurium etichettato con Cy5-streptavidina. Brevemente, BMDMs sono stati infettati come descritto in questo protocollo con mCherry -S. typhimurium precedentemente ...

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Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Descriviamo qui un metodo semplice e rapido per l'isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina e streptavidina.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

10.6K Views.  University of Cologne. Descriviamo qui un metodo semplice e rapido per l'isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina e streptavidina.

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A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe pneumonia "Legionnaires' disease"1. In protozoan and mammalian phagocytes, L. pneumophila employs a conserved mechanism to form a specific, replication-permissive compartment, the "Legionella-containing vacuole" (LCV). LCV formation requires the bacterial Icm/Dot type IV secretion system (T4SS), which translocates as many as 275 "effector" proteins into host cells. The effectors manipulate host proteins as well as lipids and communicate with secretory, endosomal and mitochondrial organelles2-4.
The formation of LCVs represents a complex, robust and redundant process, which is difficult to grasp in a reductionist manner. An integrative approach is required to comprehensively understand LCV formation, including a global analysis of pathogen-host factor interactions and their temporal and spatial dynamics. As a first step towards this goal, intact LCVs are purified and analyzed by proteomics and lipidomics.
The composition and formation of pathogen-containing vacuoles has been investigated by proteomic analysis using liquid chromatography or 2-D gel electrophoresis coupled to mass-spectrometry. Vacuoles isolated from either the social soil amoeba Dictyostelium discoideum or mammalian phagocytes harboured Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 or Legionella spp.10. However, the purification protocols employed in these studies are time-consuming and tedious, as they require e.g. electron microscopy to analyse LCV morphology, integrity and purity. Additionally, these protocols do not exploit specific features of the pathogen vacuole for enrichment.
The method presented here overcomes these limitations by employing D. discoideum producing a fluorescent LCV marker and by targeting the bacterial effector protein SidC, which selectively anchors to the LCV membrane by binding to phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P)3,11 . LCVs are enriched in a first step by immuno-magnetic separation using an affinity-purified primary antibody against SidC and a secondary antibody coupled to magnetic beads, followed in a second step by a classical Histodenz density gradient centrifugation12,13 (Fig. 1).
A proteome study of isolated LCVs from D. discoideum revealed more than 560 host cell proteins, including proteins associated with phagocytic vesicles, mitochondria, ER and Golgi, as well as several GTPases, which have not been implicated in LCV formation before13. LCVs enriched and purified with the protocol outlined here can be further analyzed by microscopy (immunofluorescence, electron microscopy), biochemical methods (Western blot) and proteomic or lipidomic approaches.

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

This article describes a method for the isolation and purification of intact Legionella-containing vacuoles (LCVs) from amoeba and macrophages. The two-step protocol comprises LCV enrichment by immuno-magnetic separation using an antibody against a bacterial LCV marker and further purification by density gradient centrifugation.

Purificazione di Vacuoli patogeno da<em&gt; Legionella</em&gt;-Infetti fagociti

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

High-throughput Assay per Fenotipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Associazione, Invasion, e replica nei macrofagi

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare<em&gt; Salmonella</em&gt; In primarie macrofagi di Permeabilization differenziale

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Phagosome chiusura Assay&quot; per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection or damage. Currently, the widely used mice models of sepsis include lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxemia, cecal ligation and puncture (CLP), and monobacterial infection model systems. This protocol describes a method to study the host responses during Salmonella Typhimurium infection-induced septic peritonitis in mice. S. Typhimurium, a Gram-negative intracellular pathogen, causes typhoid-like disease in mice.
This protocol elaborates the culture preparation, induction of septic peritonitis in mice through intraperitoneal injection, and methods to study systemic host responses. Furthermore, the assessment of bacterial burden in different organs and the flow cytometric analysis of increased neutrophil numbers in the peritoneal lavage is presented. Salmonella Typhimurium-induced sepsis in mice leads to an increase in proinflammatory cytokines and rapid infiltration of neutrophils in the peritoneal cavity, leading to lower survival.
Every step in this protocol has been optimized, resulting in high reproducibility of the pathogenesis of septic peritonitis. This model is useful for studying immunological responses during bacterial sepsis, the roles of different genes in disease progression, and the effects of drugs to attenuate sepsis.

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

This protocol describes the induction of Gram-negative monobacterial sepsis in a mouse model system. The model is useful in investigating the inflammatory and lethal host responses during sepsis.

Caratterizzazione della peritonite settica indotta da Salmonella Typhimurium nei topi

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

Utilizzo di LPS batterici per eliminare i batteriofagi dalle colture di Salmonella

Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures

Bacteriophages, or simply phages, play a vital role in microbial environments, impacting bacterial populations and shaping their evolution and interactions. These organisms are viruses that infect and replicate within bacterial hosts. Phages are ubiquitous on Earth, highly diverse, and very abundant. While bacteriophages have valuable roles in different environments and are a key area of research in microbiology and ecology, their presence can be undesirable in certain industrial processes or products. Considering the abundance and ubiquity of bacteriophages on Earth, the design of procedures for the removal of bacteriophages from bacterial cultures is crucial in diverse laboratory and industrial applications to preserve the integrity of the cultures and ensure accurate experimental results or product quality. Here, we have fine-tuned a protocol to eliminate the bacteriophages from infected Salmonella enterica cultures, using a strategy based on the use of lipopolysaccharides (LPS) located in the outer membrane of Gram-negative bacteria. Bacterial LPS plays an important role in host recognition by phages, and we make use of this property to design an effective procedure for the removal of phages, which use LPS as a receptor, in Salmonella bacterial cultures.

Autore in primo piano: Eliminazione efficiente dei batteriofagi dalle colture di Salmonella infette utilizzando i lipopolisaccaridi

Bacteriophages, ubiquitous and diverse on Earth, infect and replicate within bacterial hosts, playing a crucial role in microbial ecosystems. Despite their importance, their presence may disrupt industrial processes. We have developed a method using bacterial lipopolysaccharides to eliminate bacteriophages from Salmonella cultures.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

Purificazione di Vacuoli patogeno da

High-throughput Assay per Fenotipo

Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione

Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare

"Phagosome chiusura Assay" per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

Caratterizzazione della peritonite settica indotta da Salmonella Typhimurium nei topi

Rimozione dei batteriofagi da colture di Salmonella infette

Rimozione dei batteriofagi da colture di Salmonella infette

Rimozione dei batteriofagi da colture di Salmonella infette