Pesquisa no laboratório de Robinson é suportada pelo financiamento do Cluster de excelência Colónia na resposta de estresse celular em doenças Aging-Associated, Universidade de Colónia, Alemanha (CECAD; financiado pelo DFG no quadro da iniciativa de excelência da federal alemão e os governos do estado) e bolsas da Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Fortuna Köln e Maria Pesch Fundação da Universidade de Colónia, Alemanha.

todas as etapas que envolvam a utilização de patogenicidade S. typhimurium deve ser efectuada em BSL-2 ou superior unidade de nível de segurança biológica. A cultura e o revestimento do S. Typhimurium, bem como a infecção de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) deve ser realizada sob uma capa de fluxo laminar para evitar a contaminação. O isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes pode ser executada em qualquer bancada de laboratório BSL-2.
 extração de medula óssea de ratos para sua diferenciação em macrófagos foi efectuada de acordo com as normas institucionais sobre o bem-estar animal e aprovada pela Agência para a natureza, estado da Renânia do Norte-Vestefália Ambiente e defesa do consumidor [turismo für Natur, Umwelt e Nordrhein-Westfalen de Verbraucherschutz (LANUV); Arquivo n: 84-02.05.40.14.082 e 84-02.04.2015.A443] e a Universidade de colônia.
 1. Culturing, S. typhimurium <ol><li>inóculo S. typhimurium (Estirpe SL1344) de uma única colônia bacteriana em 5 mL de caldo de infusão (BHI) coração cérebro usando um loop bacteriano.</li>
	<li>Incube a suspensão bacteriana em uma incubadora a 37 ° C durante a noite com tremendo.</li>
	<li>No dia seguinte, transfira 1 mL da suspensão bacteriana em 19 mL de caldo BHI em um Erlenmeyer e incubar a 37 ° C numa incubadora com agitação.</li>
	<li>Monitorar o S. typhimurium crescimento através da medição da densidade óptica (OD) em 600 nm (OD 600) com um espectrofotômetro. As medidas devem ser tomadas aproximadamente cada 30 min.</li>
	<li>OD quando 600 atinge 1.0, retire a suspensão bacteriana da incubadora e transferência para tubo de 50 mL. Centrifugar as bactérias a 5.400 x g, durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender em 10 mL de salina tampão fosfato (PBS).</li>
	<li>Centrifugar a 5.400 x g, durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as bactérias em 4,9 mL de PBS estéril.</li>
</ol> 2. Revestimento de S. typhimurium com grânulos magnético NHS-biotina/estreptavidina-conjugados <ol><li>Adicione 100 µ l de 10 mg/mL biotina vinculando a solução (NHS-biotina dissolvido em dimetilsulfóxido, DMSO) preparada na hora, para a suspensão bacteriana preparado na etapa anterior. Por exemplo, dilua 5 mg de NHS-biotina em 0,5 mL de DMSO estéril. Mix corretamente pipetando subindo e descendo várias vezes.</li>
	<li>Dividir a mistura em cinco tubos de 1,5 mL.</li>
	<li>Incubar por 2 h à temperatura ambiente (RT) sobre uma thermoblock com agitação constante a 350 rpm.</li>
	<li>Centrifugar tubos a 15.000 x g durante 10 minutos a RT e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda em 1 mL de PBS estéril, centrifugar 15.000 x g por 10 min a RT e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Repita etapa 2.5 mais duas vezes para remover completamente a excesso biotina vinculando solução.</li>
	<li>Após a última lavagem, resuspenda o pellet em 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Transferir 100 µ l de solução de grânulos magnético estreptavidina conjugada com 10 mg/mL em um tubo de 1,5 mL e deixá-lo na prateleira magnética 5 min.</li>
	<li>Remover o solvente com uma pipeta, tomar a solução de grânulos magnético streptavidin-conjugados de rack magnético e ressuspendê-lo com 1 mL de suspensão bacteriana revestida de biotina preparado no passo 2.7.</li>
	<li>Incubar por 1h no RT em uma thermoblock com agitação constante a 350 rpm.</li>
	<li>Coloque a solução na prateleira magnética; esperar 5 min e depois remover com uma pipeta as bactérias que não adere na parede (mantê-lo em um tubo rotulado como &#34; bactérias não revestidos &#34;). A fração aderindo à parede do tubo em contato com o ímã é as bactérias biotina/estreptavidina-revestido.</li>
	<li>Remover o tubo contendo a bactéria rotulada de rack magnético e ressuspender em 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Colocá-lo novamente na prateleira magnética, esperar por 5 min e usar uma pipeta para remover a PBS.</li>
	<li>Repita etapas 2.13 e 2.14 mais duas vezes para remover todas as bactérias que não são revestidas com os grânulos magnéticos estreptavidina conjugada.</li>
	<li>Após a última lavagem, resuspenda as bactérias revestido em 500 µ l de PBS estéril e rotular o tubo como &#34; revestido de bactérias &#34;.</li>
	<li>Contar a colônia formando unidades (cfu) de ambos &#34; decapada bactérias &#34; e &#34; revestido de bactérias &#34; soluções do chapeamento seriais diluições em placas de ágar BHI. Aproximadamente 2 x 10 8 UFC/mL de bactérias revestidas são obtidos a partir de 20 mL da suspensão bacteriana inicial com OD 600 de 1.0. Manter a suspensão bacteriana revestida a 4 ° C, para ser usado no dia seguinte para infectar os macrófagos.</li>
</ol> 3. Infecção de BDMDs <ol><li>no mesmo dia, quando as bactérias são revestidas com biotina e grânulos magnéticos estreptavidina conjugada placa totalmente diferenciadas BMDMs 22 em pratos de 6 cm em uma densidade de 5 x 10 6 células por prato.</li>
	<li>No dia seguinte, centrifugar a suspensão bacteriana revestida a 15.000 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender em meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em uma concentração de 10 x 10 6 UFC/mL.</li>
	<li>Para infectar os macrófagos em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10, remover o meio dos BMDMs e adicionar 5 mL de suspensão bacteriana revestida preparado. MOI ideal poderão ser avaliado para cada tipo de célula ou finalidade experimental das isolados phagosomes.</li>
	<li>Incubar em RT para 10 min para sincronizar fagocitose.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO 2 por 30 min iniciar a fagocitose. Outros tipos de células podem exigir diferentes incubações para assegurar a internalização das bactérias.</li>
	<li>Retire o meio contendo bactérias os pratos e lavar as células com RPMI três vezes para remover as bactérias não-internalizada.</li>
	<li>Finalmente, adicionar 10 mL de RPMI contendo 10% FBS e 50 µ g/mL gentamicina para matar todas as bactérias não-fagocitadas.</li>
	<li>Incubar os BMDMs infectados a 37 ° C com 5% CO 2 até que ponto o tempo desejado. Ponto de tempo desejado deve ser determinado experimentalmente de acordo com as bactérias e tipo de células utilizado e a finalidade da análise. Para o estudo dos primeiros eventos de fusão endossomo-fagossoma em S. BMDMs infectadas typhimurium, recomenda-se uma incubação 30 min. Para a análise dos acontecimentos posteriores, phagosomes podem ser extraídos após 2h ou 4h de incubação. Incubação prolongada de macrófagos com S. Typhimurium além 24h resulta em morte de macrófagos. Estendido a infecção intracelular antes da extração do fagossoma provavelmente pode levar a degradação de moléculas de biotina. No entanto, nós não observaram perda de biotina na revestido-bactérias até 24 h.</li>
</ol> 4. Isolamento de S. typhimurium-contendo Phagosomes <ol><li>preparar o volume do fagossoma necessário buffer de isolamento um (50 mM tubos, pH.7, 50mm MgCl 2, 5mm EGTA) pela adição de ditiotreitol (DTT) a uma concentração final de 1 mM, citocalasina B para um final concentração de 10 µM e protease e fosfatase inibidores como recomendado pelo fabricante. 
	Nota: TDT e Cytochalasin B devem ser adicionado para o tampão de isolamento do fagossoma A sempre imediatamente antes da utilização. Cytochalasin B interrompe o citoesqueleto, facilitando a ruptura da membrana celular.</li>
	<li>Na altura desejada aponte, remover o meio das células infectadas e lavar com PBS estéril, aquecido a RT.</li>
	<li>Adicionar 750 µ l de phagosomisolamento e tampão A por prato e incubar 20 min no gelo. Quando usando números de telemóvel diferentes, o volume de tampão de isolamento A deve ser ajustado proporcionalmente.</li>
	<li>Adicionar 250 µ l de tampão de isolamento do fagossoma B (tubos de 50 mM, pH.7, 50mm MgCl 2, 5mm EGTA, 220 mM manitol e sacarose 68 milímetros). A placa para assegurar que o buffer alcança a superfície total do prato de pedra. Quando usando números de telemóvel diferentes, o volume de tampão de isolamento B deve ser ajustado proporcionalmente.</li>
	<li>Remover as células do prato raspando suavemente usando um policial de borracha e transfira para um tubo previamente refrigerados 1,5 mL.</li>
	<li>Passar a suspensão de células através de uma agulha 26G utilizando uma seringa de 1 mL pelo menos 15 vezes (uma aspiração mais uma ejeção da contagem de suspensão de células como uma vez). Isto é o suficiente para liberar o conteúdo citosólico do BMDMs. O número de passes através da agulha deve ser otimizado para cada tipo de célula.</li>
	<li>Coloque a suspensão de eritrócitos na prateleira magnética e espere 5 min. As partículas anexadas ao ímã são as phagosomes que contenham revestido - S. Typhimurium. A suspensão contém o resto dos componentes celulares.</li>
	<li>Transferir a suspensão em um tubo de 1,5 mL rotulado como &#34; citosol &#34;.</li>
	<li>Retire o tubo com os phagosomes isolados do rack magnético e Resuspenda-los em 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Coloque a suspensão do fagossoma na prateleira magnética, aguarde 5 min e remova a PBS.</li>
	<li>, Repita os passos 4.9 e 4.10 para lavar os isolados de S. typhimurium-contendo phagosomes.</li>
	<li>Finalmente remover a PBS e Resuspenda os phagosomes no buffer necessário; por exemplo, em um buffer de ensaio (RIPA) radioimmunoprecipitation para análise de proteínas. Aproximadamente 50-200 µ g de proteína é obtida por amostra seguindo este protocolo, dependendo a quantidade inicial de células e o MOI de infecção.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Um novo método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes revestindo as bactérias com biotina e estreptavidina conjugada com grânulos magnéticos é descrito aqui. Após suave rompimento da membrana celular, que contêm bactérias phagosomes podem ser facilmente extraídos usando um rack magnético. Mostramos que a rotulagem das bactérias preserva a capacidade do patógeno para induzir a inflamação e não altera a propriedade fagocítica da célula hospedeira. Importante, phagosomes o...

Os macrófagos estão circulando em células fagocíticas especializadas que detectam, englobam e degradam qualquer partícula estranha presente em tecidos periféricos, variando de pilhas apoptotic a invadir microorganismos tais como bactérias. Em cima da superfície mediada reconhecimento de marcadores específicos do patógeno comumente presentes na superfície dos microorganismos (conhecido como patógeno associado a padrões moleculares ou PAMPs), macrófagos iniciar uma complexa reorganização da membrana celular em fim de cercar e phagocytize o patógeno1.
O patógeno tragado então contido pelo macrófago em uma vesícula intracelular denominada fagossomo. Através de uma série de fusão e fissão eventos com outras vesículas como endossomos e lisossomos, o patógeno contendo fagossoma adquire um conjunto de proteínas necessárias para a eliminação do conteúdo phagosomal. Portanto, a composição enzimática do fagossomo é altamente variável no decurso deste processo, conhecido como fagossoma maturação2.
Logo após a fagocitose, a complexo ATPase vacuolar (v-ATPase) da membrana do fagossomo é incorporada por fusão com endossomos3multiméricas. Este complexo utiliza ATP para bombear protões do citosol para o lúmen do fagossoma4. Acidificação do fagossomo é essencial para os eventos de fusão com outras vesículas5 e para a ativação de um grande número de enzimas degradativos dependente do pH6. Outra multiméricas complexo enzimático que é rapidamente montado na membrana do fagossomo é o complexo NADPH-oxidase (NOX). NOX complexo oxida NADPH para produzir espécies reativas de oxigênio (ROS) que são segregadas para o lúmen do fagossoma e que contribuem significativamente para a matança do tragado microorganismos7.
Durante os passos iniciais da maturação, phagosomes apresentar marcadores normalmente como Rab5 e Rab7 de endossomos cedo e tarde, respectivamente, juntamente com a subunidade de0 V do v-ATPase8. Fusão de phagosomes com lisossomos e tarde endossomos resulta na exposição do patógeno fagocitada para uma grande variedade de enzimas hidrolíticas, como proteases catepsina, lipases e β-galactosidase9. Acidificação do lúmen é também necessária para a ativação destas enzimas. Por exemplo, a clivagem de catepsina D para produzir o formulário curto ativo é dependente do pH10. Essas enzimas degradam o patógeno e mediam a produção de derivados de patógeno peptides curtos que são apresentados pelas macrófago histocompatibilidade (MHC) classe II moléculas complexas de células T para desencadear uma resposta imune adaptativa11.
Daí, maturação do fagossoma é crucial para a resposta imune inata e links braços do sistema imune inatos e adaptativos. Não é nenhuma surpresa que os patógenos desenvolveram estratégias para superar a eliminação por macrófagos pelo processo de maturação do fagossoma acima descritas. Por exemplo, a bactéria intracelular Mycobacterium tuberculosis e Legionella pneumophila impede a maturação do fagossoma inibindo v-ATPase assembly e o lúmen consequente acidificação12,13 . Outras bactérias, como a Listeria monocytogenes ou Shigella flexneri induzem a formação de poros na membrana do fagossomo de escapar para o citosol14,15. Por outro lado, Salmonella enterica sorovar typhimurium (S. typhimurium) é capaz de modificar as propriedades do fagossomo dentro do vacúolo para transformá-lo em um local adequado para a sua replicação16. Esta habilidade faz S. typhimurium um modelo muito interessante para estudar a interferência mediada por patógeno de maturação do fagossoma.
S. typhimurium é uma bactéria intracelular facultativo que provoca gastroenterite em seres humanos. Após a invasão da propria do lamina, S. Typhimurium bactérias são rapidamente detectadas e fagocitadas por macrófagos e contidas em phagosomes17. Alguns relatos têm descrito anteriormente que S. typhimurium-contendo phagosomes fabricantes para ambos os endossomos e lisossomos18do presente, e outros estudos encontraram fusão fagossoma-lisossoma prevenida sobre S. Typhimurium infecção19.
Inicialmente, maturação de fagossoma com S. typhimurium infecção foi investigada por microscopia de imunofluorescência. O desenvolvimento de técnicas para o isolamento de bactérias contendo phagosomes habilitado para um estudo mais preciso do conteúdo do fagossoma em termos de marcadores endossomo e lisossomo. Até à data, o principal método usado para o isolamento de bactérias contendo phagosomes é o fraccionamento subcelular em sacarose passo gradientes18,20. No entanto, este método requer várias etapas de centrifugação que podem causar danos mecânicos ao phagosomes, podem afetar a estabilidade dos componentes phagosomal (proteínas e lipídios) e é demorado. Além disso, exige o uso de um se: um pedaço de equipamento especializado que não é acessível para todos os laboratórios.
Recentemente, uma nova abordagem foi aplicada para o isolamento de bactérias contendo phagosomes, em que os patógenos bacterianos são rotulados com lipopetide biotinilado (Lipobiotin) e mais tarde extraído usando grânulos magnéticos estreptavidina conjugada21 . Propomos um método alternativo complementar através da marcação de macromoléculas contendo amina superfície bacterianas com NHS-biotina seguido por grânulos magnéticos estreptavidina conjugada. Phagosomes obtidos por esse método são altamente enriquecidos em marcadores endossomo e lisossoma e podem ser usados para uma ampla gama de ensaios, de análise de proteínas para análise omics. Além disso, não requer equipamento especializado como ultracentrifuges. Além disso, eliminando as etapas de centrifugação, tanto os danos mecânicos à phagosomes e a quantidade de tempo empregado são consideravelmente reduzidos. Esse método pode ser facilmente adaptado para o isolamento de phagosomes contendo outras bactérias, tais como o Gram-positivas Staphylococcus aureus, também incluído neste manuscrito. Em resumo, este método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes é um simples, econômico, e menos demorada do que a clássico isolamento por sacarose gradiente-ultracentrifugação, tornando-se altamente enriquecido contendo bactérias phagosomes.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Streptavidin</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL or DynaMag Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial loop (10&amp;micro;l)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td><td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta-actin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anti-mCherry antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab5 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab7 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>anti-cathepsin D antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tomm20 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>anti-calnexin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20357</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages

Salmonella typhimurium é uma bactéria intracelular facultativo que provoca gastroenterite em seres humanos. Após a invasão da propria do lamina, S.. typhimurium bactérias são rapidamente detectadas e fagocitadas por macrófagos e contidas em vesículas, conhecidas como phagosomes, a fim de ser degradado. Isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes têm sido amplamente utilizados para estudar como S. typhimurium infecção altera o processo de maturação do fagossoma para prevenir a degradação bacteriana. Classicamente, o isolamento de bactérias contendo phagosomes foi executada por centrifugação gradiente de sacarose. No entanto, esse processo é demorado e requer equipamento especializado e um certo grau de destreza. Descrito aqui é um método simples e rápido para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes de macrófagos revestindo as bactérias com grânulos magnéticos estreptavidina-biotina-conjugados. Phagosomes obtidos por esse método podem ser suspenso em qualquer reserva de escolha, permitindo a utilização de phagosomes isolados para uma ampla gama de ensaios, tais como análise de proteínas, metabólito e lipídios. Em resumo, este método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes é rápida, eficiente e específico, requer equipamento mínimo e é mais versátil do que o método clássico de isolamento por gradiente de sacarose-ultracentrifugação.

Isolamento de bactérias contendo phagosomes pelo presente protocolo requer o biotinylation das bactérias como um primeiro passo. Avaliamos, portanto, a eficácia da S. typhimurium biotinylation por análise de microscopia confocal de BMDMs infectados com biotinilado mCherry -S. typhimurium rotulado com Cy5-estreptavidina. Brevemente, BMDMs foram infectados conforme descrito neste protocolo com mCherry -S. typhimurium biotinilado ante...

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Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Descrevemos aqui um método simples e rápido para o isolamento de Salmonella typhimurium-contendo phagosomes de macrófagos revestindo as bactérias com biotina e estreptavidina.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

10.6K visualizações.  University of Cologne. Descrevemos aqui um método simples e rápido para o isolamento de Salmonella typhimurium-contendo phagosomes de macrófagos revestindo as bactérias com biotina e estreptavidina.

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A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Imunologia e Infecção

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe pneumonia "Legionnaires' disease"1. In protozoan and mammalian phagocytes, L. pneumophila employs a conserved mechanism to form a specific, replication-permissive compartment, the "Legionella-containing vacuole" (LCV). LCV formation requires the bacterial Icm/Dot type IV secretion system (T4SS), which translocates as many as 275 "effector" proteins into host cells. The effectors manipulate host proteins as well as lipids and communicate with secretory, endosomal and mitochondrial organelles2-4.
The formation of LCVs represents a complex, robust and redundant process, which is difficult to grasp in a reductionist manner. An integrative approach is required to comprehensively understand LCV formation, including a global analysis of pathogen-host factor interactions and their temporal and spatial dynamics. As a first step towards this goal, intact LCVs are purified and analyzed by proteomics and lipidomics.
The composition and formation of pathogen-containing vacuoles has been investigated by proteomic analysis using liquid chromatography or 2-D gel electrophoresis coupled to mass-spectrometry. Vacuoles isolated from either the social soil amoeba Dictyostelium discoideum or mammalian phagocytes harboured Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 or Legionella spp.10. However, the purification protocols employed in these studies are time-consuming and tedious, as they require e.g. electron microscopy to analyse LCV morphology, integrity and purity. Additionally, these protocols do not exploit specific features of the pathogen vacuole for enrichment.
The method presented here overcomes these limitations by employing D. discoideum producing a fluorescent LCV marker and by targeting the bacterial effector protein SidC, which selectively anchors to the LCV membrane by binding to phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P)3,11 . LCVs are enriched in a first step by immuno-magnetic separation using an affinity-purified primary antibody against SidC and a secondary antibody coupled to magnetic beads, followed in a second step by a classical Histodenz density gradient centrifugation12,13 (Fig. 1).
A proteome study of isolated LCVs from D. discoideum revealed more than 560 host cell proteins, including proteins associated with phagocytic vesicles, mitochondria, ER and Golgi, as well as several GTPases, which have not been implicated in LCV formation before13. LCVs enriched and purified with the protocol outlined here can be further analyzed by microscopy (immunofluorescence, electron microscopy), biochemical methods (Western blot) and proteomic or lipidomic approaches.

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

This article describes a method for the isolation and purification of intact Legionella-containing vacuoles (LCVs) from amoeba and macrophages. The two-step protocol comprises LCV enrichment by immuno-magnetic separation using an antibody against a bacterial LCV marker and further purification by density gradient centrifugation.

Purificação de vacúolos patógeno de<em&gt; Legionella</em&gt; Infectados Fagócitos

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

De alta capacidade: Ensaio para Fenótipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, invasão e replicação em macrófagos

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Quantificação de citosólico vs vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Fagossomo Encerramento Ensaio&quot; para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection or damage. Currently, the widely used mice models of sepsis include lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxemia, cecal ligation and puncture (CLP), and monobacterial infection model systems. This protocol describes a method to study the host responses during Salmonella Typhimurium infection-induced septic peritonitis in mice. S. Typhimurium, a Gram-negative intracellular pathogen, causes typhoid-like disease in mice.
This protocol elaborates the culture preparation, induction of septic peritonitis in mice through intraperitoneal injection, and methods to study systemic host responses. Furthermore, the assessment of bacterial burden in different organs and the flow cytometric analysis of increased neutrophil numbers in the peritoneal lavage is presented. Salmonella Typhimurium-induced sepsis in mice leads to an increase in proinflammatory cytokines and rapid infiltration of neutrophils in the peritoneal cavity, leading to lower survival.
Every step in this protocol has been optimized, resulting in high reproducibility of the pathogenesis of septic peritonitis. This model is useful for studying immunological responses during bacterial sepsis, the roles of different genes in disease progression, and the effects of drugs to attenuate sepsis.

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

This protocol describes the induction of Gram-negative monobacterial sepsis in a mouse model system. The model is useful in investigating the inflammatory and lethal host responses during sepsis.

Caracterizando Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis em camundongos

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

Usando LPS bacteriano para eliminar bacteriófagos de culturas de Salmonella

Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures

Bacteriophages, or simply phages, play a vital role in microbial environments, impacting bacterial populations and shaping their evolution and interactions. These organisms are viruses that infect and replicate within bacterial hosts. Phages are ubiquitous on Earth, highly diverse, and very abundant. While bacteriophages have valuable roles in different environments and are a key area of research in microbiology and ecology, their presence can be undesirable in certain industrial processes or products. Considering the abundance and ubiquity of bacteriophages on Earth, the design of procedures for the removal of bacteriophages from bacterial cultures is crucial in diverse laboratory and industrial applications to preserve the integrity of the cultures and ensure accurate experimental results or product quality. Here, we have fine-tuned a protocol to eliminate the bacteriophages from infected Salmonella enterica cultures, using a strategy based on the use of lipopolysaccharides (LPS) located in the outer membrane of Gram-negative bacteria. Bacterial LPS plays an important role in host recognition by phages, and we make use of this property to design an effective procedure for the removal of phages, which use LPS as a receptor, in Salmonella bacterial cultures.

Autor em destaque: Eliminação eficiente de bacteriófagos de culturas de Salmonella infectadas usando lipopolissacarídeos

Bacteriophages, ubiquitous and diverse on Earth, infect and replicate within bacterial hosts, playing a crucial role in microbial ecosystems. Despite their importance, their presence may disrupt industrial processes. We have developed a method using bacterial lipopolysaccharides to eliminate bacteriophages from Salmonella cultures.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

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Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

Purificação de vacúolos patógeno de

De alta capacidade: Ensaio para Fenótipo

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

Quantificação de citosólico vs vacuolar

"Fagossomo Encerramento Ensaio" para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Caracterizando Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis em camundongos

Remoção de bacteriófagos de culturas de Salmonella infectadas

Remoção de bacteriófagos de culturas de Salmonella infectadas

Remoção de bacteriófagos de culturas de Salmonella infectadas