البحوث في مختبر لروبنسون هي مدعومة بتمويل من "كولونيا التميز الكتلة" على "استجابات الإجهاد الخلوية" في "الأمراض أجينجاسوسياتيد"، جامعة كولونيا، ألمانيا (سكاد؛ تمولها DFG ضمن "مبادرة الامتياز" للحكومة الاتحادية الألمانية و الدولة الحكومات) والمنح المقدمة من دويتشه الأوقيانوغرافية (SFB 670) وثروة كولون ومؤسسة ماريا Pesch من جامعة كولونيا، ألمانيا.

جميع الخطوات التي تنطوي على استخدام الممرضة س. يجب أن يتم تيفيموريوم في BSL-2 أو مرفق أعلى من المستوى الأمن البيولوجي. الثقافة وطلاء من س. تيفيموريوم، فضلا عن انتقال العدوى إلى المشتقة من نخاع العظم الضامة (بمدمس) يجب أن يتم تحت غطاء الاندفاق الصفحي لمنع التلوث. عزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس يمكن أن يؤديها على أي مقعد مختبر BSL-2-
 استخراج النخاع من الفئران لأن التفريق في الضامة كان يؤديها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية على الرفق بالحيوان ووافقت عليها "وكالة الدولة" شمال الراين-ويستفاليا للطبيعة، البيئة، وحماية المستهلك [لانديسامت für Natur، أومويلت وفيربراوتشيرشوتز (لانوف) نوردراين-فيستفالن؛ ملف لا: 84-02.05.40.14.082 و 84-02.04.2015.A443] وجامعة كولونيا-
 1-كولتورينج تيفيموريوم س. <ol><li>إينوكولاتي س. تيفيموريوم (سلالة SL1344) من مستعمرة بكتيرية واحدة إلى 5 مل من الدماغ القلب ضخ (بهي) مرق استخدام حلقة بكتيرية.</li>
	<li>احتضان تعليق البكتيرية في حاضنة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الهز.</li>
	<li>اليوم التالي، نقل 1 مل تعليق البكتيرية إلى 19 مل مرق بهي في قارورة مخروطية واحتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة بالهز.</li>
	رصد <li>س. تيفيموريوم النمو عن طريق قياس الكثافة البصرية (OD) 600 نانومتر (OD 600) مع جهاز المطياف الضوئي. ينبغي أن تؤخذ قياسات تقريبا كل 30 دقيقة</li>
	<li>OD عند 600 تصل إلى 1.0، وإزالة تعليق البكتيرية من الحاضنة ونقل في أنبوب 50 مل. الطرد المركزي البكتيريا في 5,400 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 ° C.</li>
	<li>إزالة المادة طافية وريسوسبيند في 10 مل من المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS).</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي في 5,400 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>إزالة المادة طافية والبكتيريا في مل 4.9 من PBS العقيمة ريسوسبيند.</li>
</ol> 2. طلاء من S. typhimurium مع دائرة الصحة الوطنية--البيوتين/ستريبتافيدين-مترافق "المغناطيسي الخرز" <ol><li>إضافة 100 ميليلتر من 10 ملغ/مل البيوتين ربط الحل (دائرة الصحة الوطنية--البيوتين حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد، [دمس]) طازج، إلى تعليق البكتيرية إعدادها في الخطوة السابقة. على سبيل المثال، يؤدي إلى تمييع 5 ملغ من دائرة الصحة الوطنية--البيوتين إلى 0.5 مل من العقيمة [دمس]. مزيج صحيح من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات.</li>
	<li>تقسيم المزيج إلى خمسة أنابيب 1.5 مل.</li>
	<li>إينكوباتي ح 2 في درجة حرارة الغرفة (RT) على ثيرموبلوك مع الهز المستمر في 350 دورة في الدقيقة-</li>
	<li>الطرد المركزي أنابيب في 15,000 س ز لمدة 10 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية.</li>
	<li>ريسوسبيند في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، أجهزة الطرد المركزي في 15,000 س ز لمدة 10 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية.</li>
	<li>كرر الخطوة 2.5 أكثر مرتين لإزالة البيوتين الزائدة التي تربط الحل.</li>
	<li>بعد الغسيل الأخير، ريسوسبيند بيليه في 1 مل PBS العقيمة.</li>
	<li>نقل 100 ميليلتر من 10 ملغ/مل مترافق streptavidin المغناطيسي الخرز الحل في أنبوب 1.5 مل وترك الأمر على الرف المغناطيسي للحد الأدنى 5</li>
	<li>إزالة المذيب مع ماصة، واتخاذ الحل الخرز المغناطيسي streptavidin-مترافق من الرف المغناطيسية، وريسوسبيند أنه مع 1 مل تعليق البكتيريا المغلفة البيوتين إعدادها في الخطوة 2.7.</li>
	<li>إينكوباتي ح 1 في RT على ثيرموبلوك مع الهز المستمر في 350 دورة في الدقيقة-</li>
	<li>وضع الحل على الرف المغناطيسي؛ والانتظار لمدة 5 دقائق ثم قم بإزالة البكتيريا التي لم تتقيد على الجدار مع ماصة (يبقيه في أنبوب وصفت &#34; البكتيريا المغلفة بغير &#34;). هو الكسر التمسك بجدار الأنبوبة على اتصال بالمغناطيس البكتيريا البيوتين/ستريبتافيدين-المغلفة.</li>
	<li>إزالة الأنبوب الذي يحتوي على البكتيريا المسماة من الرف المغناطيسية وريسوسبيند في 1 مل PBS العقيمة.</li>
	<li>وضعه مرة أخرى على الرف المغناطيسية، والانتظار لمدة 5 دقائق، واستخدام ماصة لإزالة برنامج تلفزيوني-</li>
	<li>كرر الخطوتين 2.13 و 2.14 مرتين أخريين لإزالة جميع البكتيريا التي هي غير مطلي بالخرز المغناطيسي مترافق streptavidin.</li>
	<li>بعد الغسيل الأخير، ريسوسبيند هذه البكتيريا المغلفة في 500 ميليلتر من PBS العقيمة وتسمية الأنبوب ك &#34; مغلفة بالبكتيريا &#34;.</li>
	<li>عد مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) على حد سواء &#34; البكتيريا المغلفة بغير &#34; و &#34; مغلفة بالبكتيريا &#34; الحلول بطلاء تخفيف المسلسل على لوحات أجار بهي. يتم الحصول على حوالي 2 × 10 8 زيمبابوي/مل من البكتيريا المغلفة من 20 مل تعليق البكتيرية الأولية مع OD 600 من 1.0. تبقى وقف البكتريا المغلفة عند 4 درجة مئوية لاستخدامها في اليوم التالي لتصيب الضامة.</li>
</ol> 3. عدوى بدمدس <ol><li>في نفس اليوم عندما المغلفة البكتيريا مع البيوتين والخرز المغناطيسي مترافق streptavidin، لوحة كاملة بمدمس المتباينة 22 في الأطباق 6 سم في كثافة 5 × 10 6 خلايا كل صحن.</li>
	<li>في اليوم التالي، الطرد المركزي بتعليق البكتيريا المغلفة في 15,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 ° C.</li>
	<li>إزالة المادة طافية وريسوسبيند في معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) بتركيز 10 × 10 6 زيمبابوي/مل.</li>
	إزالة المتوسطة من بمدمس <li>لتصيب الضامة في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 10، وإضافة 5 مل تعليق البكتيريا المغلفة أعدت. يمكن تقييم موي الأمثل لكل نوع من الخلايا أو التجريبية والغرض من فاجوسوميس معزولة.</li>
	<li>إينكوباتي على RT لمدة 10 دقائق لمزامنة البلعمه.</li>
	<li>إينكوباتي في 37 درجة مئوية في 5% CO 2 حاضنة لمدة 30 دقيقة الشروع في البلعمه. أنواع خلايا أخرى قد تتطلب أوقات الاحتضان مختلفة لضمان استيعاب البكتيريا.</li>
	<li>إزالة المتوسطة المحتوية على البكتيريا من الصحون وتغسل الخلايا مع ربمي ثلاث مرات لإزالة البكتيريا غير مستوعبة.</li>
	<li>وأخيراً إضافة 10 مل ربمي الذي يحتوي على 10% FBS ومع الجنتامايسين 50 ميكروغرام/مل لقتل أي بكتيريا غير فاجوسيتيزيد-</li>
	<li>احتضان بمدمس المصابة في 37 درجة مئوية مع 5% CO 2 حتى نقطة الوقت المطلوب. يجب أن تحدد نقطة الوقت المطلوب تجريبيا وفقا للبكتيريا ونوع الخلية المستخدمة والغرض من التحليل. لدراسة الأحداث الانصهار يبلوع-دخلول المبكر في س. بمدمس تيفيموريوم المصابة، ينصح حضانة و 30 دقيقة. لتحليل أحداث لاحقة، يمكن استخراج فاجوسوميس بعد ح 2 أو 4 ح للحضانة. حضانة طويلة من الضامة مع س. نتائج تيفيموريوم بعد 24 ساعة في وفاة الضامة. تمديد العدوى داخل الخلايا قبل استخراج يبلوع ربما يؤدي إلى تدهور الجزيئات البيوتين. ومع ذلك، أن نحن لم يلاحظ فقدان البيوتين على البكتيريا المغلفة حتى حاء 24</li>
</ol> 4. عزل من س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس <ol><li>إعداد حجم يبلوع المطلوب عزلة المخزن المؤقت (50 ملم أنابيب، pH.7، 50 مم مجكل 2، 5 ملم عطا) بإضافة ديثيوثريتول (DTT) بتركيز نهائي من 1 مم، ب سيتوتشالاسين إلى نهائي تركيز مثبطات ميكرومتر، ومبطلات والفوسفاتيز 10 حسبما أوصت به الشركة المصنعة. 
	ملاحظة: DTT وب سيتوتشالاسين يجب إضافة إلى عزل يبلوع المخزن المؤقت باستخدام دائماً فورا من قبل. يعطل ب سيتوتشالاسين سيتوسكيليتون، تيسير تمزق غشاء الخلية.</li>
	<li>وفي الوقت المطلوب أشر، وإزالة المتوسطة من الخلايا المصابة ويغسل مع PBS العقيمة استعد الرايت</li>
	<li>750 إضافة ميليلتر من فاجوسومالمخزن المؤقت بكل طبق ه العزلة واحتضان 20 دقيقة على الجليد. عند استخدام أرقام الخلية مختلفة، ينبغي تعديل حجم المخزن المؤقت لعزله بالتناسب.</li>
	<li>إضافة 250 ميليلتر يبلوع عزلة المخزن المؤقت ب (الأنابيب 50 مم، pH.7، 50 مم مجكل 2، 5 ملم اجتا، 220 مم المانيتول والسكروز 68 ملم). روك اللوحة ضمان وصول المخزن المؤقت إلى السطح الكامل للطبق. عند استخدام أرقام الخلية مختلفة، ينبغي تعديل حجم المخزن المؤقت للعزلة ب تناسبياً.</li>
	<li>إزالة الخلايا من الطبق بلطف إلغاء استخدام شرطي مطاط وتحويلها إلى أنبوب مبردة مسبقاً 1.5 مل.</li>
	<li>يمر بتعليق خلية إبرة ز 26 استخدام المحاقن 1 مل على الأقل 15 مرة (تطلع واحد بالإضافة إلى طرد واحدة من التهم تعليق خلية كمرة واحدة). وهذا يكفي لإطلاق سراح سيتوسوليك محتوى بمدمس. عدد يمر عبر الإبرة يجب أن يكون الأمثل لكل نوع من أنواع الخلايا.</li>
	وضع تعليق خلية على الرف المغناطيسية <li>والانتظار مدة 5 دقائق. جسيمات تعلق على المغناطيس هي فاجوسوميس التي تتضمن المغلفة-س. تيفيموريوم. التعليق يحتوي على بقية المكونات الخلوية.</li>
	<li>نقل التعليق في أنبوب 1.5 مل وصفت &#34; سيتوسول &#34;-</li>
	<li>إزالة الأنبوب مع فاجوسوميس المعزولة من الرف المغناطيسية وريسوسبيند لهم في 1 مل PBS العقيمة.</li>
	<li>وضع تعليق يبلوع على الرف المغناطيسية، والانتظار لمدة 5 دقائق، وإزالة برنامج تلفزيوني-</li>
	<li>كرر الخطوات 4.9 و 4.10 لغسل معزولة س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس-</li>
	<li>وأخيراً إزالة برنامج تلفزيوني وريسوسبيند فاجوسوميس في المخزن المؤقت المطلوب؛ فعلى سبيل المثال، في مخزن فحص (RIPA) راديويمونوبريسيبيتيشن لتحليل البروتين. يتم الحصول على ما يقرب من 50-200 ميكروغرام من البروتين كل عينة عقب هذا البروتوكول، تبعاً لكمية الخلايا الأولية ووزارة الداخلية من العدوى.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).</li><li>Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+V-ATPase+along+the+Endocytic+Pathway+Occurs+through+Reversible+Subunit+Association+and+Membrane+Localization.">Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization.</a> Plos One. 3 (7), e2758 (2008).</li><li>Forgac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+ATPases:+rotary+proton+pumps+in+physiology+and+pathophysiology.">Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).</li><li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+delivery+of+procathepsin+D+to+phagosomes:+Implications+for+phagosome+biogenesis+and+parasitism+by+Mycobacterium.">Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium.</a> Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).</li><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagosome:+Compartment+with+a+license+to+kill.">The phagosome: Compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).</li><li>Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+A+few+bugs+in+the+system.">Phagosome maturation: A few bugs in the system.</a> J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).</li><li>Turk, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+cathepsins:+From+structure,+function+and+regulation+to+new+frontiers.">Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers.</a> Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).</li><li>Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+MHC+molecules+and+peptide+complexes+appear+in+phagosomes+during+phagocytic+antigen+processing.">Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing.</a> Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).</li><li>Robinson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+Phenolic+Glycolipid+Inhibits+Phagosome+Maturation+and+Subverts+the+Pro-inflammatory+Cytokine+Response.">Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response.</a> Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).</li><li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+and+Legionella+pneumophila+phagosomes+exhibit+arrested+maturation+despite+acquisition+of+Rab7.">Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7.</a> Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).</li><li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+distinct+phospholipases+C+of+Listeria+monocytogenes+have+overlapping+roles+in+escape+from+a+vacuole+and+cell-to-cell+spread.">The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread.</a> Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).</li><li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outsmarting+the+host:+bacteria+modulating+the+immune+response.">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).</li><li>Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+2-encoded+type+III+secretion+system+mediates+exclusion+of+NADPH+oxidase+assembly+from+the+phagosomal+membrane.">Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane.</a> J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).</li><li>Ohl, M. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella:+A+model+for+bacterial+pathogenesis.">Salmonella: A model for bacterial pathogenesis.</a> Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y-pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).</li><li>Buchmeier, N. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Phagosome-Lysosome+Fusion+by+Salmonella-Typhimurium.">Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium.</a> Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).</li><li>Luhrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).</li><li>Steinhauser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-labeling+facilitates+a+novel+magnetic+isolation+procedure+to+characterize+pathogen-containing+phagosomes.">Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes.</a> Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+and+intracellular+localization+of+Brucella+spp.+in+Vero+cells:+fluorescence+and+electron+microscopy.">Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy.</a> Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).</li><li>Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+trafficking+of+Brucella+abortus+in+J774+macrophages.">Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages.</a> Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li><li>Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+phagosomal+proteomes:+from+latex-bead+to+bacterial+phagosomes.">Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).</li><li>Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+approach+to+study+the+phagosomal+proteome+modulated+by+mycobacterial+infections.">A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections.</a> Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).</li><li>Rogers, L. D., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum.">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

أسلوب جديد لعزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس بطلاء البكتيريا مع البيوتين ومترافق streptavidin المغناطيسي الخرز ويرد هنا. بعد تعطل رقيقة من غشاء الخلية، فاجوسوميس المحتوية على البكتيريا ويمكن بسهولة استخراج استخدام رف مغناطيسي. نظهر أن وسم البكتيريا يحافظ على قدرة مسببات ال...

يتم تعميم الضامة الخلايا متجولة المتخصصة التي كشف وتبتلع وتحط أي الجسيمات الأجنبية موجودة في الأنسجة المحيطية، بدءاً من الخلايا أبوبتوتيك إلى غزو الكائنات الدقيقة مثل البكتيريا. عند الحصول على الاعتراف بوساطة مستقبلات سطحية الممرض علامات محددة عادة موجودة على السطح من الكائنات الحية الدقيقة (المعروفة باسم أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة أو بامبس)، الضامة الشروع في إعادة تنظيم معقدة للغشاء الخلوي في النظام المحيطي و الممرض1فاجوسيتيزي.
ثم يرد الممرض انجولفيد بلعم في حويصلة داخل الخلايا المعروفة باسم يبلوع. من خلال سلسلة من الانصهار والانشطار الأحداث مع حويصلات أخرى مثل اندوسوميس وليسوسوميس، يكتسب يبلوع التي تحتوي على الكائنات الممرضة مجموعة من البروتينات اللازمة للقضاء على المحتوى فاجوسومال. ولذلك تكوين الانزيمية يبلوع اختلافاً كبيرا أثناء هذه العملية، المعروفة باسم يبلوع نضوج2.
بعد قليل من البلعمه، مولتيميريك ATPase رغوي المعقدة (الخامس-ATPase) أدمجت في الغشاء يبلوع بالانصهار مع اندوسوميس3. يستخدم هذا المركب ATP لمضخة البروتونات من سيتوسول إلى التجويف يبلوع4. تحمض يبلوع أمر ضروري لإحداث الانصهار مع غيرها من حويصلات5 لتفعيل عدد كبير من إنزيمات بوليمرات تعتمد على درجة الحموضة6. آخر مولتيميريك الانزيمية المعقدة التي يتم تجميعها بسرعة على الغشاء يبلوع هو مجمع نادف-أوكسيديز (NOX). أكاسيد النيتروجين المعقدة يكسد نادف بغية إنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) التي هي مخفي في التجويف يبلوع، وأن تسهم إسهاما كبيرا في قتل الكائنات الحية الدقيقة التي اجتاحت7.
أثناء الخطوات الأولى من النضج، يقدم فاجوسوميس علامات عادة مثل Rab5 و Rab7 من اندوسوميس المبكرة والمتأخرة على التوالي جنبا إلى جنب مع وحدة فرعية0 V v-ATPase8. نتائج انصهار فاجوسوميس مع ليسوسوميس واندوسوميس الراحل في التعرض لمسببات المرض فاجوسيتيزيد لمجموعة متنوعة من الإنزيمات هيدروليكي مثل البروتياز كاثيبسين، ليباسيس، وبيتا-جالاكتوسيداسي9. تحمض التجويف مطلوب أيضا لتفعيل هذه الإنزيمات. على سبيل المثال، هو انقسام كاثيبسين د لإنتاج النموذج القصير نشطة تعتمد على درجة الحموضة10. هذه الإنزيمات تتحلل مسببات المرض والتوسط من أجل إنتاج الببتيدات القصيرة المستمدة من العوامل الممرضة التي ترد بها بلعم histocompatibility الرئيسية (MHC) الفئة الثاني جزيئات معقدة لخلايا تي يؤدي استجابة المناعية تكيفية11.
ومن ثم، نضوج يبلوع حاسمة بالنسبة للاستجابة المناعية الفطرية ووصلات بالأسلحة الفطرية والتكيف في الجهاز المناعي. لا عجب أن مسببات الأمراض تطورت استراتيجيات للتغلب على القضاء بالضامة خلال عملية النضج يبلوع الموصوفة أعلاه. على سبيل المثال، منع البكتيريا داخل الخلايا متفطره و المستروحة فيلقيه يبلوع نضوج المثبطة الخامس-ATPase الجمعية وما يترتب عليها من التجويف التحمض12،13 . حمل البكتيريا الأخرى، مثل الليستريه المستوحدة أو فليكسنيري دوسنتاريا تشكيل المسام في غشاء يبلوع الهروب إلى14،سيتوسول15. من ناحية أخرى، انتيريكا السالمونيلا سرفار تيفيموريوم (S. تيفيموريوم) غير قادرة على تعديل خصائص يبلوع داخل المنقبضة لتحويله إلى موقع مناسب ل النسخ المتماثل16. هذه القدرة يجعل س. تيفيموريوم نموذجا مثيرا للاهتمام لدراسة التدخل الممرض بوساطة من النضج يبلوع.
س. تيفيموريوم هو بكتيريا داخل الخلايا اختياري الذي يسبب التهاب المعدة والأمعاء في البشر. وبعد غزو بروبريا الصفيحة، س. البكتيريا تيفيموريوم يتم بسرعة الكشف عن فاجوسيتيزيد التي الضامة والواردة ضمن فاجوسوميس17. ووصفت بعض تقارير سبق أن س. تيفيموريوم-فاجوسوميس التي تحتوي على صناع ل اندوسوميس وليسوسوميس18، وقد وجدت دراسات أخرى الانصهار يبلوع-يحلول حالت دون بناء س. تيفيموريوم العدوى19.
وفي البداية، يبلوع النضج عند س. كانت قد أجرت التحقيق الإصابة تيفيموريوم المجهري الفلورة. تطوير تقنيات لعزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس تمكين إجراء دراسة أكثر دقة لمحتوى يبلوع من حيث علامات دخلول ويحلول. وحتى الآن، والطريقة الرئيسية المستخدمة لعزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس هو تجزئة سوبسيلولار على السكروز خطوة التدرجات18،20. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب عدة خطوات الطرد المركزي التي يمكن أن تتسبب في الأضرار الميكانيكية إلى فاجوسوميس ويمكن أن يؤثر على استقرار مكونات فاجوسومال (البروتينات والدهون) ومضيعة للوقت. وعلاوة على ذلك، فإنه يتطلب استخدام أولتراسينتريفوجي: قطعة من المعدات المتخصصة التي لا يمكن الوصول إليها لكل مختبر.
مؤخرا، تم تطبيق نهج جديد لعزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس، التي وصفت مسببات الأمراض البكتيرية مع بيوتينيلاتيد ليبوبيتيدي (ليبوبيوتين) وفي وقت لاحق المستخرجة باستخدام الخرز المغناطيسي مترافق ستريبتافيدين21 . ونحن نقترح طريقة تكميلية بديلة بوسم البكتيرية الجزيئات السطحية التي تحتوي على أمين مع دائرة الصحة الوطنية--البيوتين تليها مترافق streptavidin الخرز المغناطيسية. فاجوسوميس التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة يتم التخصيب في علامات دخلول ويحلول ويمكن استخدامه لمجموعة واسعة نطاق من فحوصات، من تحليل البروتين بتحليل اوميكس. بالإضافة إلى ذلك، فإنه لا يتطلب معدات متخصصة مثل أولتراسينتريفوجيس. وعلاوة على ذلك، عن طريق القضاء على الخطوات الطرد المركزي، الأضرار الميكانيكية إلى فاجوسوميس ومقدار الوقت المستخدمة هي خفض كبير. هذا الأسلوب يمكن تكييفها بسهولة لعزل فاجوسوميس التي تحتوي على البكتيريا الأخرى، مثل إيجابية المكوّرات العنقودية الذهبية، وشملت أيضا في هذه المخطوطة. باختصار، هذا الأسلوب لعزل س. تيفيموريوم-تحتوي على فاجوسوميس وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة، وأقل استهلاكاً للوقت من عزلة الكلاسيكية من السكروز أثري تنبيذ فائق التدرج، مما يجعل درجة عالية فاجوسوميس المحتوية على البكتيريا.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Streptavidin</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL or DynaMag Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial loop (10&amp;micro;l)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td><td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta-actin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anti-mCherry antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab5 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab7 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>anti-cathepsin D antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tomm20 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>anti-calnexin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20357</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages

Typhimurium السالمونيلا هو بكتيريا داخل الخلايا اختياري الذي يسبب التهاب المعدة والأمعاء في البشر. وبعد غزو بروبريا الصفيحة, S. البكتيريا تيفيموريوم يتم بسرعة الكشف عن فاجوسيتيزيد التي الضامة والواردة في حويصلات المعروفة فاجوسوميس من أجل أن يتحلل. عزل من س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة كيفية س. العدوى تيفيموريوم يغير عملية نضج يبلوع لمنع تدهور البكتيرية. كلاسيكي، عزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس قامت به السكروز التدرج الطرد المركزي. بيد أن هذه العملية تستغرق وقتاً طويلاً، ويتطلب معدات متخصصة ودرجة معينة من المهارة. الموصوفة هنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة بطلاء البكتيريا مع البيوتين-ستريبتافيدين-مترافق الخرز المغناطيسية. يمكن تعليق فاجوسوميس التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة في أي مخزن من الاختيار، مما يتيح الاستفادة فاجوسوميس معزولة لمجموعة واسعة نطاق من فحوصات، مثل تحليل المستقلب، البروتين والدهن. باختصار، هذا الأسلوب لعزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس محددة، وتتسم بالكفاءة، السريعة، يتطلب الحد الأدنى من المعدات، وهو أكثر تنوعاً من الأسلوب الكلاسيكي للعزل بواسطة السكروز التدرج-تنبيذ فائق.

العزلة التي تحتوي على البكتيريا فاجوسوميس بهذا البروتوكول يتطلب بيوتينيليشن البكتيريا كخطوة أولى. ولذلك قمنا بتقييم فعالية س. بيوتينيليشن تيفيموريوم بالتحليل المجهري [كنفوكل] للمصابين بيوتينيلاتيد بمدمس متشيري-S. تيفيموريوم المسمى مع Cy5-ستريبتافيدي...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages at JoVE.com

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

يصف لنا هنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة بطلاء البكتيريا مع البيوتين وستريبتافيدين.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

10.6K Views.  University of Cologne. يصف لنا هنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة بطلاء البكتيريا مع البيوتين وستريبتافيدين.

Video: Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe pneumonia "Legionnaires' disease"1. In protozoan and mammalian phagocytes, L. pneumophila employs a conserved mechanism to form a specific, replication-permissive compartment, the "Legionella-containing vacuole" (LCV). LCV formation requires the bacterial Icm/Dot type IV secretion system (T4SS), which translocates as many as 275 "effector" proteins into host cells. The effectors manipulate host proteins as well as lipids and communicate with secretory, endosomal and mitochondrial organelles2-4.
The formation of LCVs represents a complex, robust and redundant process, which is difficult to grasp in a reductionist manner. An integrative approach is required to comprehensively understand LCV formation, including a global analysis of pathogen-host factor interactions and their temporal and spatial dynamics. As a first step towards this goal, intact LCVs are purified and analyzed by proteomics and lipidomics.
The composition and formation of pathogen-containing vacuoles has been investigated by proteomic analysis using liquid chromatography or 2-D gel electrophoresis coupled to mass-spectrometry. Vacuoles isolated from either the social soil amoeba Dictyostelium discoideum or mammalian phagocytes harboured Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 or Legionella spp.10. However, the purification protocols employed in these studies are time-consuming and tedious, as they require e.g. electron microscopy to analyse LCV morphology, integrity and purity. Additionally, these protocols do not exploit specific features of the pathogen vacuole for enrichment.
The method presented here overcomes these limitations by employing D. discoideum producing a fluorescent LCV marker and by targeting the bacterial effector protein SidC, which selectively anchors to the LCV membrane by binding to phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P)3,11 . LCVs are enriched in a first step by immuno-magnetic separation using an affinity-purified primary antibody against SidC and a secondary antibody coupled to magnetic beads, followed in a second step by a classical Histodenz density gradient centrifugation12,13 (Fig. 1).
A proteome study of isolated LCVs from D. discoideum revealed more than 560 host cell proteins, including proteins associated with phagocytic vesicles, mitochondria, ER and Golgi, as well as several GTPases, which have not been implicated in LCV formation before13. LCVs enriched and purified with the protocol outlined here can be further analyzed by microscopy (immunofluorescence, electron microscopy), biochemical methods (Western blot) and proteomic or lipidomic approaches.

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

This article describes a method for the isolation and purification of intact Legionella-containing vacuoles (LCVs) from amoeba and macrophages. The two-step protocol comprises LCV enrichment by immuno-magnetic separation using an antibody against a bacterial LCV marker and further purification by density gradient centrifugation.

تنقية من الفجوات المرضي من<em&gt; البكتيريا</em&gt; المصابة البالعات

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري<em&gt; السالمونيلا الملهبة لل</em&gt; جمعية التيفية الفأرية، والغزو، والنسخ المتماثل في الضامة

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

عزل الفئران البريتوني الضامة لتنفيذ جين تحليل التعبير عند تول مثل مستقبلات تحفيز

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي<em&gt; السالمونيلا</em&gt; في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;يبلوع إغلاق الفحص&quot; لتصور يبلوع تشكيل في ثلاثة أبعاد عن طريق التأمل إجمالي الداخلية نيون الميكروسكوب (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection or damage. Currently, the widely used mice models of sepsis include lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxemia, cecal ligation and puncture (CLP), and monobacterial infection model systems. This protocol describes a method to study the host responses during Salmonella Typhimurium infection-induced septic peritonitis in mice. S. Typhimurium, a Gram-negative intracellular pathogen, causes typhoid-like disease in mice.
This protocol elaborates the culture preparation, induction of septic peritonitis in mice through intraperitoneal injection, and methods to study systemic host responses. Furthermore, the assessment of bacterial burden in different organs and the flow cytometric analysis of increased neutrophil numbers in the peritoneal lavage is presented. Salmonella Typhimurium-induced sepsis in mice leads to an increase in proinflammatory cytokines and rapid infiltration of neutrophils in the peritoneal cavity, leading to lower survival.
Every step in this protocol has been optimized, resulting in high reproducibility of the pathogenesis of septic peritonitis. This model is useful for studying immunological responses during bacterial sepsis, the roles of different genes in disease progression, and the effects of drugs to attenuate sepsis.

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

This protocol describes the induction of Gram-negative monobacterial sepsis in a mouse model system. The model is useful in investigating the inflammatory and lethal host responses during sepsis.

توصيف التهاب الصفاق الإنتاني الناجم عن السالمونيلا التيفيموريوم في الفئران

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

استخدام LPS البكتيرية للقضاء على البكتيريا من مزارع السالمونيلا

Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures

Bacteriophages, or simply phages, play a vital role in microbial environments, impacting bacterial populations and shaping their evolution and interactions. These organisms are viruses that infect and replicate within bacterial hosts. Phages are ubiquitous on Earth, highly diverse, and very abundant. While bacteriophages have valuable roles in different environments and are a key area of research in microbiology and ecology, their presence can be undesirable in certain industrial processes or products. Considering the abundance and ubiquity of bacteriophages on Earth, the design of procedures for the removal of bacteriophages from bacterial cultures is crucial in diverse laboratory and industrial applications to preserve the integrity of the cultures and ensure accurate experimental results or product quality. Here, we have fine-tuned a protocol to eliminate the bacteriophages from infected Salmonella enterica cultures, using a strategy based on the use of lipopolysaccharides (LPS) located in the outer membrane of Gram-negative bacteria. Bacterial LPS plays an important role in host recognition by phages, and we make use of this property to design an effective procedure for the removal of phages, which use LPS as a receptor, in Salmonella bacterial cultures.

تسليط الضوء على المؤلف: القضاء بكفاءة على البكتيريا من مزارع السالمونيلا المصابة باستخدام عديدات السكاريد الدهنية

Bacteriophages, ubiquitous and diverse on Earth, infect and replicate within bacterial hosts, playing a crucial role in microbial ecosystems. Despite their importance, their presence may disrupt industrial processes. We have developed a method using bacterial lipopolysaccharides to eliminate bacteriophages from Salmonella cultures.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

تنقية من الفجوات المرضي من

عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري

عزل الفئران البريتوني الضامة لتنفيذ جين تحليل التعبير عند تول مثل مستقبلات تحفيز

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي

"يبلوع إغلاق الفحص" لتصور يبلوع تشكيل في ثلاثة أبعاد عن طريق التأمل إجمالي الداخلية نيون الميكروسكوب (TIRFM)

توصيف التهاب الصفاق الإنتاني الناجم عن السالمونيلا التيفيموريوم في الفئران

إزالة البكتيريا من مزارع السالمونيلا المصابة

إزالة البكتيريا من مزارع السالمونيلا المصابة

إزالة البكتيريا من مزارع السالمونيلا المصابة