Name: enzymatic cascade reactions for the synthesis of chiral amino alcohols from l-lysine
Uploaded: 2018-02-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
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Gli autori ringraziano Véronique de Berardinis per la proficua discussione e Alain Perret, Christine Pellé e Peggy Sirvain per il supporto tecnico.

1. prodotto enzimatico
<ol><li>Esprimere e purificare proteine come descritto in precedenza26. Nota: Proteine ricombinanti sono stati ottenuti con le seguenti concentrazioni finali: αKAO da Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; ΑKAO da c. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL; PLP-DCs da S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), Estratto di cellulare gratis con enzima totale 12,44 mg/ml; PLP-DC da c. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (DCCpin), 2,62 mg/mL.</li>
</ol>2. preparazione delle soluzioni
Nota: Tutte le soluzioni qui sotto vengono preparate in acqua deionizzata.
<ol><li>Preparare 1 M di tampone HEPES, pH 7.5; regolare con 5 M di NaOH. Nota: Durante la fase di regolazione del pH, indossare guanti protettivi, indumenti protettivi, occhiali protettivi e protezioni per il viso (P280). In caso di contatto con gli occhi (P305, P351, P338), sciacquare accuratamente con acqua per diversi minuti rimuovere lenti a contatto se possibile. Continuare a sciacquare e contattare immediatamente un centro antiveleni o un medico (P310). Il codice di P si riferisce alla dichiarazione precauzionale (pericolo classe e categoria; Vedi, ad esempio, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).</li>
	<li>Preparare 100 mM L-lisina, 100 mM (5S) - idrossi - L-lisina, acido α-chetoglutarico 150mm, ascorbato di sodio 100 mM, 10 mM ammonio ferro (II) solfato esaidrato (sale di Mohr), 100 mM 5-fosfato del piradossale (PLP) e 100 mM dithiothreitol (DTT).</li>
	<li>Preparare 1 M, 2M e 6M di acido cloridrico (HCl) da una soluzione di HCl 37% (circa 12 M soluzione), seguendo le stesse istruzioni di sicurezza come quelli descritti al punto 2.1. Nota: Le soluzioni di acido α-chetoglutarico, ascorbato di sodio e d'ammonio ferro (II) solfato esaidrato devono essere fatta fresche il giorno di utilizzo. La soluzione di lisina può essere conservata per diversi mesi a temperatura ambiente. La soluzione PLP può essere conservata per un mese a 4 ° C. La soluzione DTT può essere conservata per un mese a-20 ° C.</li>
</ol>3. scala analitica reazioni
<ol><li>Lo sviluppo di metodi per la reazione di decarbossilazione (5R) - idrossi - L-lisina<ol>
<li>11 µ l di soluzione 1 M di HEPES buffer pH 7,5 (concentrazione finale di 50 mM) ad una microprovetta da 2 mL. Quindi, 22 µ l di 100 mM (5S) - idrossi - L-lisina (concentrazione finale 10 mM), 2,2 µ l di 100 mM PLP (concentrazione finale di 1 mM) e 2,2 µ l di 100 mM DTT (concentrazione finale 1 mM). Nota: In caso di reazione con LDCSrum, l'aggiunta di DTT non è necessario.</li>
		<li>Aggiungere il PLP-DC purificato (concentrazione finale 0,1 mg/mL). Completare con H2O per un volume finale di 220 µ l.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 3 h. Nota: Agitando la miscela di reazione con un coperchio aperto aria aperta garantisce una buona ossigenazione di mezzi di reazione. Non è pertanto necessario di bolla di ossigeno nei mezzi di reazione.</li>
		<li>Raccogliere 10 µ l di miscela di reazione per essere analizzati secondo la procedura di controllo di reazione descritta nel passaggio 6. I campioni sono preferibilmente derivatizzati e analizzati direttamente dopo il campionamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sviluppo di metodi per la reazione di cascata enzimatica che unisce un passo di idrossilazione catalizzato da αKAO con decarbossilazione catalizzata da PLP-DC<ol>
<li>11 µ l di 1 M di tampone a pH HEPES 7,5 (concentrazione finale di 50 mM) ad una microprovetta da 2 mL. Quindi, 22 µ l di 150 mM di acido α-chetoglutarico (concentrazione finale 15 mM), 5,5 µ l di 100 mM di ascorbato di sodio (concentrazione finale 2,5 mM), 22 sale di µ l di 10 mM di Mohr (concentrazione finale 1 mM) e 22 µ l di 100 mM di L-lisina (concentrazione finale 10 mM).</li>
		<li>Completare con H2O per un volume finale di 220 µ l, prendendo in considerazione il volume della soluzione enzimatica per essere aggiunto al punto 3.2.3.</li>
		<li>Aggiungere l'enzima richiesto αKAO purificato secondo la regioselettività mirati: KDO1 per idrossilazione in posizione C-3 o KDO2 per posizione C-4 di L-lisina. La concentrazione finale dell'enzima purificato (0.05-0.5 mg/mL) è stato determinato per consentire una completa conversione in circa 3 h.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 3 h.</li>
		<li>2,2 µ l di 100 mM di PLP (concentrazione finale ~ 1 mM) e 2,2 µ l di 100 mM di DTT (concentrazione finale ~ 1 mM). Nota: In caso di reazione con LDCSrum, l'aggiunta di DTT non è necessario.</li>
		<li>Aggiungere il PLP-DC purificate ad una concentrazione che consente la completa conversione in 18 h: LDCSrum ad una concentrazione finale approssimativa di 0,1 mg/mL per la reazione di cascata con KDO1 e DCCpin ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL per la cascata di reazione con KDO2.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto aria aperta a 300 giri/min per 18 h.</li>
		<li>Eseguire una procedura di controllo come descritto al punto 3.1.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sviluppo di metodi per la reazione di cascata enzimatica combinando due fasi di idrossilazione catalizzate da αKAOs con decarbossilazione catalizzata da PLP-DC<ol>
<li>Eseguire passaggi 3.2.1-3.2.2.</li>
		<li>Aggiungi KDO1 ad una concentrazione finale di 0,05 mg/mL. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 3h.</li>
		<li>Aggiungi KDO2 ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL, calcolato utilizzando il volume di reazione iniziale. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 18 h.</li>
		<li>Eseguire il punto 3.2.5.</li>
		<li>Aggiungere il PLP-DC DC purificataCpin ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL, calcolato utilizzando il volume di reazione iniziale. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 18 h.</li>
		<li>Eseguire la procedura di controllo come descritto al punto 3.1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. semi-preparatorio One-pot biocatalitici reazione
Nota: Le reazioni enzimatiche avvengono su 0,1 mmol di L-lisina in un vetro all'aperto 250 mL flacone erlenmeyer per un volume totale di 10 mL.
<ol><li>Sintesi dei derivati monoidrossilati<ol>
<li>Aggiungere 0,5 mL di tampone HEPES di 1 M, pH 7.5 (concentrazione finale di 50 mM) al pallone. Quindi, aggiungere 1 mL di 100 mM L-lisina (concentrazione finale 10 mM), 1 mL di acido α-chetoglutarico 150 mM (concentrazione finale 15 mM), 0,25 mL di ascorbato di sodio 100 mM (concentrazione finale 2,5 mM), e sale di 1 mL di 10mm Mohr (concentrazione finale 1 mM).</li>
		<li>Completare con H2O per un volume finale di 10 mL, prendendo in considerazione il volume della soluzione enzimatica per essere aggiunto al punto 4.1.3.</li>
		<li>Aggiungere l'enzima richiesto αKAO purificato secondo la regioselettività mirati: KDO1 ad una concentrazione finale di 0,075 mg/mL per idrossilazione in posizione C-3 o KDO2 ad una concentrazione finale di 0,5 mg/mL per posizione C-4 di L-lisina. La concentrazione finale dell'enzima purificato è stata determinata per consentire una completa conversione in circa 3 h.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente a 300 giri/min per la durata appropriata. Quando il monitoraggio di reazione indica una reazione di idrossilazione completato (eseguita tutti i passaggi dettagliati nel passaggio 6 per il protocollo di monitoraggio della reazione), passare al punto 4.1.5. Un tempo di reazione tipico è 3h.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di 100 mM PLP per la miscela di reazione αKAO (concentrazione finale ~ 1 mM). Quindi, aggiungere 100 µ l di 100 mM DTT (concentrazione finale ~ 1 mM), tranne quando si utilizza LDCSrum.</li>
		<li>Aggiungere purificata PLP-DC: LDCSrum ad una concentrazione finale approssimativa di 0,05 mg/mL per la reazione di cascata con KDO1 o DCCpin ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL per la reazione di cascata con KDO2.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, 300 giri/min, per 18 h e continuare direttamente per le operazioni descritte al punto 4.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sintesi del derivato dihydroxylated<ol>
<li>Aggiungere 0,5 mL di tampone HEPES di 1 M, pH 7.5 (concentrazione finale 50 mM), 1 mL di 100 mM L-lisina (concentrazione finale 10 mM), 1 mL di acido α-chetoglutarico 150 mM (concentrazione finale 15 mM), 0,25 mL di ascorbato di sodio 100 mM (concentrazione finale 2,5 mM) , e sale di 1 mL di 10mm Mohr (concentrazione finale di 1 mM). Completare con H2O per un volume finale di 10 mL, prendendo in considerazione il volume della soluzione enzimatica per essere aggiunto al punto 4.2.2.</li>
		<li>Aggiungere KDO1 a una concentrazione finale di 0,075 mg/mL. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente a 300 giri/min per la durata appropriata.</li>
		<li>Quando il monitoraggio di reazione indica una reazione di idrossilazione completata (vedere il passaggio 6 per il protocollo di monitoraggio della reazione), passare al punto 4.2.5. Un tempo di reazione tipico è 3h.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di acido α-chetoglutarico 150 mM (concentrazione finale 15 mM), 0,25 mL di ascorbato di sodio 100 mM (concentrazione finale 2,5 mM), e sale di 1 mL di 10mm Mohr (concentrazione finale di 1 mM).</li>
		<li>Aggiungi KDO2 a una concentrazione finale approssimativo di 0,5 mg/mL, calcolato utilizzando il volume di reazione iniziale. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente a 300 giri/min per 18 h.</li>
		<li>Quando il monitoraggio di reazione indica una reazione diidrossilazione completata (vedere il passaggio 6 per il protocollo di monitoraggio della reazione), procedere con il passo 4.2.7. Un tempo di reazione tipico è 18 h.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di 100 mM di DTT (concentrazione finale ~ 1 mM), tranne quando si utilizza la LDCSrum.</li>
		<li>Aggiungere la DC purificataCpin ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL, calcolato utilizzando il volume di reazione iniziale.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente a 300 giri/min per 18 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tempra<ol>
<li>Raffreddare la miscela di reazione posizionando il vetro 250 mL flacone erlenmeyer in un bagno di ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere con cautela, sopra circa 1 min, 0,25 mL di 6 M HCl agitando manualmente delicatamente la miscela di reazione raffreddata. Seguire le stesse istruzioni di sicurezza come quelli descritti al punto 2.1.</li>
		<li>Trasferimento la miscela acida in una centrifuga di fondo conico 50ml tubo usando un vetro pipetta Pasteur equipaggiato con una lampadina, quindi centrifugare a 1.680 x g e a 4 ° C per 15 min.</li>
		<li>Prelevare il supernatante e tenere da parte in un pallone da 250 mL.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di acqua deionizzata alla centrifuga a fondo conico contenente il pellet. Vortice per risospendere il pellet.</li>
		<li>Centrifuga a 1.680 x g, 4 ° C, per 15 min.</li>
		<li>Prelevare il supernatante e aggiungerlo il pallone a sfondo sferico 250 mL contenente il surnatante primo (punto 4.3.4).</li>
		<li>Congelare i surnatanti raccolti mediante immersione del pallone nell'azoto liquido con mano costante vorticoso e trasferire immediatamente il pallone ad un collettore di benchtop liofilizzatore per impedire al materiale di scongelamento.</li>
		<li>Al termine il processo di liofilizzazione (una notte), togliere il matraccio dal liofilizzatore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. purificazione di Amino alcoli dalla miscela di reazione enzimatica grezzo
<ol><li>Resina a scambio ionico<ol>
<li>Sciogliere il prodotto liofilizzato nella quantità minima di acquosa 0,1 M di HCl (circa 4 mL) fino a quando le particelle solide non sono visibili a occhio nudo.</li>
		<li>Condizione di una resina a scambio cationico gruppo funzionale acido solfonico, 200-400 mesh, in una colonna di vetro (20 x 250 mm) di eluizione a pressione atmosferica 1M HCl (volumi di colonna 4) seguita da 0.1 M HCl (4 volumi di colonna; colonna volume = 10 mL).</li>
		<li>Caricare l'esempio con attenzione nella parte superiore della resina sulle pareti della colonna vetro utilizzando una micropipetta di 1.000 µ l. Poi, risciacquare la provetta da centrifuga a fondo conico che conteneva il prodotto grezzo tre volte con 1 mL 0,1 M di soluzione acquosa di HCl per lavare e caricare i volumi di risciacquo risultante sulla colonna nello stesso modo.</li>
		<li>Eluire con un non-lineare gradiente: 4 volumi di colonna di 0.1 M HCl, 4 volumi di colonna d'acqua, 4 volumi di colonna di 5% NH4OH, 4 volumi di colonna di 10% NH4OH, 4 volumi di colonna di 15% NH4OH, 4 volumi di colonna di 20% NH4OH , 4 volumi di colonna di 25% NH4OH e infine 4 colonna volumi del 28% NH4OH.</li>
		<li>Monitorare la purificazione mediante HPLC (Vedi punto 6).</li>
		<li>Piscina le frazioni contenenti il composto (NH4OH 20-28%) e liofilizzare come descritto nella procedura 4.3.8-4.3.9. Nota: La colonna di scambio ionico può essere riutilizzata dopo eluizione con acqua deionizzata alla neutralizzazione delle acque di eluizione (approssimativamente. 50 mL) seguita da ricondizionamento di eluizione con 50 mL di 1 M di HCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SPE<ol>
<li>Solubilizzare il composto liofilizzato in circa 2 mL di H3PO4/acqua (20 µ l/mL).</li>
		<li>Posto una modalità mista scambio cationico SPE 6 mL-cartuccia su un collettore di aspirazione collegata ad una pompa di acqua. Condizione della cartuccia di disegno attraverso 4 mL di metanolo sotto pressione ridotta collegata al collettore. Equilibrare la cartuccia disegnando attraverso 4 mL di H3/4acqua PO (20 µ l/mL).</li>
		<li>Caricare l'esempio sulla cartuccia utilizzando una micropipetta di 1.000 µ l nella parte superiore della resina sulle pareti della colonna di vetro e risciacquare la fiala contenente il prodotto tre volte con 0,75 mL di H3PO4/acqua (20 µ l/mL) a lavaggio. Caricare il relativo volume di risciacquo sulla colonna nello stesso modo.</li>
		<li>Lavare la cartuccia di eluizione sotto pressione ridotta, collegata al collettore, 4 mL di 2% HCOOH in acqua, poi con 4 mL di acqua. Eluire con una sfumatura di NH4OH in acqua (4 mL per ogni eluizione, a partire da 4% NH4OH: 10%, 15%, 15%, 20% e 28%).</li>
		<li>Monitorare la purificazione mediante HPLC analizzando ciascuna frazione secondo il protocollo descritto nel passaggio 6 di monitoraggio della reazione. Tenere tutte le frazioni contenenti puro derivato desiderato secondo cromatogramma di raggi ultravioletto (UV) e procedere con il passo 5.2.6.</li>
		<li>Pallone a piscina le frazioni contenenti il desiderato composto in un pallone da 100 mL, sciacquare le provette contenenti le frazioni con acqua e aggiungere il volume di risciacquo a 100 mL.</li>
		<li>Rimuovere il solvente sotto pressione ridotta mediante un evaporatore rotante dotata di un bollitore di bagno termostato acqua a 40 ° C e collegato ad una pompa di vuoto impostato a 10 mbar.</li>
		<li>Solubilizzare il solido in un volume minimo di acqua e trasferire la soluzione in un pallone da pesato 25 mL. Risciacquare la beuta con un volume minimo di acqua, aggiungere il volume di risciacquare il matraccio da 25 mL e procedere con il passo 5.2.9.</li>
		<li>Pesare il prodotto purificato e calcolare il rendimento.</li>
		<li>Sciogliere il prodotto purificato del volume minimo di 2M di HCl fino a particelle solide non sono visibili a occhio nudo e liofilizzare come descritto nella procedura 4.3.8-4.3.9. Nota: La amino alcoli sono composti sensibili e sono tenute come loro sali cloridrato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. reazione di monitoraggio e analisi del prodotto
<ol><li>Derivatizzazione di substrati e prodotti prima dell'analisi HPLC Nota: I substrati e i prodotti devono essere derivatizzati come derivati aromatici per aumentare la loro detectivity cromatografica di UV. Abbiamo usato 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB). Ogni campione è stato iniettato in HPLC immediatamente dopo derivatizzazione.<ol>
<li>Prendere 10 µ l della reazione enzimatica e il trasferimento ad una microprovetta 1,5 mL. Aggiungere 10 µ l di 0,25 M di NaHCO3 soluzione acquosa, 100 µ l di etanolo e 30 µ l di 2,5 mg/mL di soluzione DNFB in etanolo.</li>
		<li>Chiudere la provetta e agitare la soluzione risultante per 1 h a 65 ° C, a 1000 giri/min. Dissetare con 10 µ l 1 M di HCl.</li>
		<li>Filtrare su un filtro di siringa non sterile di diametro 4 mm con una membrana da 0,22 µm poro dimensione idrofila polivinilidene fluoruro (PVDF) utilizzando una siringa da 1 mL Luer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esegue il monitoraggio della reazione diossigenasi utilizzando qualsiasi sistema in grado di separare gli amminoacidi derivatizzati. Questo protocollo comprende rilevazione UV di amminoacidi derivatizzati dai gruppo cromoforo del dinitrobenzene (DNB)27.<ol>
<li>Montare l'HPLC con C18 con una colonna a fase inversa endcapping Silile trimetil (5 µm, 3 x 150 mm).</li>
		<li>Equilibrare la colonna C18 con l'eluente (30: 70) B (MeCN + 0,1% TFA) di eluente A (H2O + 0,1% TFA) ad un flusso di 1 mL/min e 35 ° C per 15 min (corrispondenti a circa 20 volumi di colonna).</li>
		<li>Iniettare 10 µ l della miscela di reazione derivatizzata (vedere punto 6.1) sulla colonna HPLC C18. Utilizzare una miscela di MeCN, 0,1% TFA/H2O e 0,1% TFA come eluente con una sfumatura lineare (rapporto 30: 70 a 70: 30 a 9 min, temperatura 35 ° C, portata 1 mL/min).</li>
		<li>Utilizzare la rilevazione UV fissato a 400 nm di analizzare i prodotti eluiti sulla colonna cromatografica. DNB-lisina eluisce in genere circa 6,5 min, idrossilato DNB-lisina circa 5,5 min, dihydroxylated DNB-lisina circa 4,2 min e DNB-aminodiol circa 5,3 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. NMR Analysis di purificato Amino alcoli
<ol><li>Sciogliere purificate amminoalcoli in D2O (700 µ l) e trasferire la soluzione in un tubo di risonanza magnetica nucleare (NMR).</li>
	<li>Acquisire 1H e spettri NMR C 13secondo appropriato NMR struttura protocolli28.</li>
</ol>

<ol>
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B: Enzymatic. 114, 65-71 (2015).</li><li>Martinez, S., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+Mechanisms+of+Fe(II)-+and+2-Oxoglutarate-dependent+Oxygenases.">Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases.</a> J. Biol. 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Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).</li><li>Schneider, J., Wendisch, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotechnological+production+of+polyamines+by+bacteria:+recent+achievements+and+future+perspectives.">Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).</li><li>Qian, Z. -. G., Xia, X. -. X., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+Escherichia+coli+for+the+production+of+cadaverine:+A+five+carbon+diamine.">Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).</li><li>Shin, J. H., Lee, S. 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Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).</li><li>Baud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Approaches+towards+the+Synthesis+of+Chiral+Amino+Alcohols+from+Lysine:+Cascade+Reactions+Combining+alpha-Keto+Acid+Oxygenase+Hydroxylation+with+Pyridoxal+Phosphate-+Dependent+Decarboxylation.">Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation.</a> Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).</li><li>Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chiral+derivatizing+agents+in+the+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+amino+acid+enantiomers:+a+review.">Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).</li><li>. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy</a> (2017)</li><li>Hibi, M., Ogawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+biotechnology+applications+of+aliphatic+amino+acid+hydroxylases+belonging+to+the+Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent+dioxygenase+superfamily.">Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily.</a> Appl. Microbiol. 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J., Phillips, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+diversity+and+the+structural+basis+of+substrate+specificity+in+the+beta/alpha-barrel+fold+basic+amino+acid+decarboxylases.">Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases.</a> J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).</li><li>Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Enzymes+for+Industrial+Biocatalysis.">Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis.</a> ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Derivati e amino alcoli chirali hanno una vasta gamma di applicazioni, da ausiliari chirali per la sintesi organica di terapia farmaceutica. Multistep sintesi per la produzione di alcoli aminoacidi di sintesi organica convenzionali sono numerose, ma potrebbe non essere sempre efficiente a causa di passaggi noioso protezione/deprotezione insieme con un sensibile controllo della stereochimica16. Un approccio biocatalitico che eroga con le operazioni di protezione/deprotezione ed è solitamente altam...

Nonostante i vantaggi offerti da biocatalisi, l'integrazione di biocatalitici passi nelle vie sintetiche o rotte biocatalitici totale rimane per lo più limitata a risoluzioni di cinetiche enzimatiche. Questi percorsi sono stati ampiamente utilizzati come un primo passo nella sintesi asimmetrica chemo-enzimatica, ma biocatalisi offre molte più possibilità nel gruppo funzionale interconversioni con elevata stereoselettività1,2,3 . Inoltre, come reazioni biocatalitici sono condotte in condizioni simili, pertanto è possibile eseguire reazioni a cascata della moda uno-pentola4,5.
Amino alcoli chirali sono molecole versatili per l'utilizzo come ausiliari o impalcature in sintesi organica6. La frazione di alcool amminico è trovata frequentemente in metaboliti secondari e ingredienti farmaceutici attivi (API). Alcoli primari β-amminici sono prontamente disponibili dagli acidi α-amminici corrispondenti di sintesi chimica convenzionale, ma l'accesso a γ-amino alcoli chirali o amminoalcoli secondari richiede spesso noiose vie sintetiche insieme sensibile controllo della stereochimica7,8,9,10. A causa della sua elevata stereoselettività, biocatalisi possono fornire un percorso sintetico superiore a questi blocchi chirali11,12,13,14.
Precedentemente abbiamo segnalato la sintesi di mono - e di-idrossi-L-lisine di diastereoselettiva idrossilazione enzimatica catalizzata da diossigenasi del ferro (II) / α-chetoacido-dipendente famiglia ossigenasi (αKAO) (Figura 1)15. In particolare, a partire da L-lisina, la KDO1 dioxygenase catalizza la formazione di (3S) - derivato idrossilato (1), mentre il (4R) - derivato (2) è costituito dalla reazione con KDO2 diossigenasi. Regiodivergent successivi idrossilazioni da KDO1 e KDO2 portano alla formazione dei (3R, 4R) - diidrossi - L-lisina (3) in forma otticamente puro. Tuttavia, la gamma limitata di substrato di questi enzimi impedisce loro ampio utilizzo in sintesi chimica, soprattutto nell'idrossilazione di ammine semplici, come una molecola di acido carbossilico nella α-posizione del gruppo amminico è essenziale per attività16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig1.jpg"> Figura 1: biocatalitici conversioni di L-lisina. Conversione in (3S) - idrossi - L-lisina (1) catalizzata da KDO1 dioxygenase; (4R) - idrossi - L-lisina (2) catalizzata da KDO2 dioxygenase; e (3R, 4R) - diidrossi - L-lisina (3) da reazione a cascata catalizzata successivamente da KDO1 e KDO2 diossigenasi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Decarbossilazione è una reazione comune nel metabolismo17. In particolare, dell'amminoacido DCs (EC 4.1.1) sono privo di cofattore (piruvoil-dipendente) o enzimi PLP-dipendenti e catalizzano la decarbossilazione degli aminoacidi nelle poliammine corrispondente in batteri e più alti organismi18,19 , 20 , 21 , 22. la mono - diidrossi composti (Figura 3) 4–7, 10-11 corrispondono ai idrossilati cadaverina, diammina ottenuta mediante decarbossilazione della L-lisina. La cadaverina è un elemento chiave per l'industria chimica, in particolare è un componente di polimeri in poliammide e poliuretano. Di conseguenza, produzione biologica di questo diammina da risorse rinnovabili ha attirato l'attenzione come un'alternativa al percorso a base di petrolio, e vari microrganismi sono stati progettati per questo scopo. In queste vie metaboliche, lisina DC (LDC) è l'enzima chiave. LDC è un enzima di PLP-dipendenti appartenenti al alanina racemasi (AR) strutturali famiglia23. I controller di dominio di PLP-dipendenti (PLP-DCs) sono noti per essere altamente substrato specifico. Tuttavia, alcuni enzimi proprio la capacità di promiscuità leggera, essendo attivo verso gli aminoacidi L-ornitina e la L-lisina, come ad esempio la LDC da Selenomonas rumirantium (LDCSrum), che ha simili costanti cinetiche per lisina e ornitina decarbossilazione24,25. Questo substrato esteso specificità rende questo enzima un buon candidato per la decarbossilazione di mono - e di-idrossi-L-lisina. Inoltre, per trovare DCs attivo verso i derivati dell'idrossile di lisina, abbiamo esaminato il contesto genomico dei geni che codificano gli enzimi αKAO. Infatti, nei genomi procariotici i geni che codificano per enzimi coinvolti nella via biosintetica del stessa generalmente sono co-localizzati in cluster genici. Il gene KDO2 (da Chitinophaga pinensis) è stato trovato co-localizzato con un gene che codifica per presunti PLP-DC (Figura 2). Al contrario, nessun gene che codifica per la DC è stato trovato quando si analizza il contesto genomico di dioxygenase del KDO1. La proteina PLP-DC da c. pinensis (DCCpin) pertanto è stata selezionata come candidato promising per catalizzare il passo di decarbossilazione della reazione cascade.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig2.jpg"> Figura 2: contesto Genomic del gene KDO2 in c. pinensis. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Di conseguenza, abbiamo progettato reazioni cascata enzimatica che coinvolgono diossigenasi e DCs per realizzare la sintesi di alcoli alifatici chirali β e γ-amminico da amminoacidi (Figura 3). Come precedentemente segnalato, l'ossidazione di C-H catalizzata dalla αKAO introduce il centro stereogenico idrossi-sostituiti con totale diastereoselettività; la chiralità Cβ/γ verrà mantenuta nel passaggio decarboxylative, che colpisce solo il carbonio Cα della molecola dell'amminoacido16.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig3.jpg"> Figura 3: analisi retrosintetica. (A) Retrosynthesis di β e γ-amino alcoli (R) - 1,5 - diaminopentan-2-olo (4) da (5R) - idrossi - L-lisina e diaminopentan (S) - 1,5--2-ol (5) e 1,5-diaminopentan-3-ol (6) da L-lisina. (B) Retrosynthesis di β, γ e β, δ-amino dioli (2S, 3S) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diolo (10) e (2R, 4S) - 1,5 - diaminopentane-2,4-diolo (11) a partire da (5R)- idrossi-L-lisina e (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diolo (7) a partire da L-lisina. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
A partire da L-lisina e i suoi (5R)-derivato idrossilato, qui segnaliamo un due/tre step, una pentola, procedura enzimatica che unisce diossigenasi e PLP-DCs per ottenere l'obiettivo amino alcoli. Prima la sintesi a scala di laboratorio delle molecole bersaglio, il metodo è stato sviluppato presso la scala analitica per regolare le condizioni di reazione, ad esempio, le concentrazioni di enzimi, necessari per consentire la conversione completa dei materiali di partenza; Presentiamo questa procedura pure.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>(5&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-hydroxy-L-lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GPS NONH</td><td>Out sourcing</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-ketoglutaric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75892</td><td></td></tr><tr><td>Sodium ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate</td><td>Acros</td><td>201370250</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal phosphate (PLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82870</td><td></td></tr><tr><td>3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1529</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20825.290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71631</td><td></td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td></td></tr><tr><td>HCl 0.1M</td><td>Fluka</td><td>35335</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td><td>VWR</td><td>83640.320</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-trifluoroacetic acid</td><td>VWR</td><td>153112E</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia 28%</td><td>VWR</td><td>21182.294</td><td></td></tr><tr><td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.32</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Acros</td><td>270480010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid 85%</td><td>Acros</td><td>201145000</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td>Acros</td><td>320,710,075</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>C18 HPLC column</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4601-Y0</td><td></td></tr><tr><td>Accela UHPLC System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accela PDA detector</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4mm syringe filters - 0,22&amp;micro;m - PVDF</td><td>Merck</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip</td><td>VWR</td><td>HSWA5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Cation exchange resin 100-200&amp;nbsp;mesh</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217506</td><td></td></tr><tr><td>Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL</td><td>Waters</td><td>186000776</td><td></td></tr><tr><td>Extraction manifold</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>B&amp;uuml;chi</td><td>531-0103</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer alpha 1-2 LDplus</td><td>Christ</td><td>L083302</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000031</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000074</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 500 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000112</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000120</td><td></td></tr><tr><td>300 MHz spectrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL microtube</td><td>CLEARLine</td><td>CL20.002.0500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical-bottom centrifuge tube</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>25 mL round-bottom flask 14/23</td><td>Fischer Scientific</td><td>10353331</td><td></td></tr><tr><td>100 mL round-bottom flask 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL round-bottom flask 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL erlenmeyer flask</td><td>Fischerbrand</td><td>15496143</td><td></td></tr></tbody></table>

enzymatic cascade reactions for the synthesis of chiral amino alcohols from l-lysine

Amino alcoli sono composti versatili con una vasta gamma di applicazioni. Per esempio, essi sono stati usati come impalcature chirali in sintesi organica. Loro sintesi di chimica organica convenzionale spesso richiedono processi di noioso sintesi multi-step, con controllo difficile del risultato stereochemical. Vi presentiamo un protocollo per sintetizzare enzimaticamente amino alcoli a partire dalla L-lisina prontamente disponibile in 48 h. Questo protocollo combina due reazioni chimiche che sono molto difficili da condurre di sintesi organica convenzionali. Nel primo passaggio, il regio - e diastereoselettiva ossidazione di un legame C-H unactivated della lisina catena laterale è catalizzata da un dioxygenase; un secondo regio - e diastereoselettiva ossidazione catalizzata da un dioxygenase di regiodivergent può portare alla formazione di 1,2-dioli. Nell'ultimo passaggio, il gruppo carbossilico dell'amminoacido alfa viene scisso da una decarbossilasi del fosfato del piradossale (PLP) (DC). Questo passaggio decarboxylative riguarda solo il carbonio alfa dell'amminoacido, mantenendo il centro stereogenico idrossi-sostituiti in posizione beta/gamma. La risultante amino alcoli otticamente sono pertanto arricchiti. Il protocollo è stato applicato con successo alla sintesi semipreparative-scala di quattro amino alcoli. Monitoraggio delle reazioni è stata condotta mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) dopo derivatizzazione di 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Semplice purificazione di estrazione in fase solida (SPE) conferita la amino alcoli con ottimi rendimenti (93% di > 95%).

Precedentemente abbiamo segnalato la sintesi di mono - e di-idrossi-L-lisine di diastereoselettiva idrossilazione enzimatica catalizzata da diossigenasi del ferro (II) / αKAO famiglia (Figura 1)16. Per ottimizzare il protocollo delle cascate intere qui presentato, che combinano uno o due passaggi di idrossilazione catalizzate da una αKAO seguita da una fase di decarbossilazione catalizzata da un PLP-DC, le condizioni di reazione sono...

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Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcoli chirali sono molecole versatili per l'utilizzo come scaffold in sintesi organica. A partire da L-lisina, sintetizziamo amino alcoli da una reazione a cascata enzimatica combinando diastereoselettiva C-H ossidazione catalizzata da diossigenasi seguita dalla scissione della parte dell'acido carbossilico dell'amminoacido corrispondente dell'idrossile di un decarbossilasi.

Reazioni a cascata enzimatica per la sintesi di Amino alcoli chirali da L-lisina

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

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12.0K Views.  CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay. Amino alcoli chirali sono molecole versatili per l'utilizzo come scaffold in sintesi organica. A partire da L-lisina, sintetizziamo amino alcoli da una reazione a cascata enzimatica combinando diastereoselettiva C-H ossidazione catalizzata da diossigenasi seguita dalla scissione della parte dell'acido carbossilico dell'amminoacido corrispondente dell'idrossile di un decarbossilasi.

Video: Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

Preparazione e<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilizzo di una sonda Activity-based per<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidasi

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Ricerca

Biochimica

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Un approccio Facile ed efficiente per la produzione di micelle reversibile Disulfide Croce-linked

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Un metodo efficiente per la sintesi di peptoids con monomeri misto Lisina-tipo / Arginina-tipo e valutazione della loro attività anti-Leishmania

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Idrolisi di un Ni-Schiff-Base complessi utilizzando le condizioni adatte per la conservazione di acido-labile gruppi protettori

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Highly Stereoselective Synthesis of 1,6-Ketoesters Mediated by Ionic Liquids: A Three-component Reaction Enabling Rapid Access to a New Class of Low Molecular Weight Gelators

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form catalytically active N-Heterocyclic Carbenes (NHCs). Here we have used ILs as precatalysts in the addition of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes to chalcones to form 1,6-ketoesters, incorporating an anti-diphenyl moiety in a highly stereoselective fashion. The reaction has a broad substrate scope and several functional groups and heteroaromatics can be integrated into the ketoester backbone in generally good yields with maintained stereoselectivity. The reaction protocol is robust and scalable. The starting materials are inexpensive and the products can be obtained after simple filtration, avoiding solvent-demanding chromatography. Furthermore, the IL can be recycled up to 5 times without any loss of reactivity. Moreover, the 1,6-ketoester end product is a potent gelator in several hydrocarbon based solvents. The method enables rapid access to and evaluation of a new class of low molecular weight gelators (LMWGs) from recyclable and inexpensive starting materials.

Ionic liquids (ILs) mediate fast, simple and cheap access to 1,6-ketoesters in high diastereoselectivities and good yields. The reaction protocol is robust and the 1,6-ketoesters can be obtained in gram scale after a simple filtration protocol. Moreover, the 1,6-ketoesters are potent gelators in hydrocarbon solvents.

Sintesi altamente stereoselettiva di 1,6-chetoesteri Mediata da liquidi ionici: una reazione a tre componenti Abilitazione accesso rapido a una nuova classe di basso peso molecolare Gelators

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form ...

Chimica

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Costruzione di peptidi elicoidale Via foto-indotta del tiolo-ene/yne Hydrothiolation Thioether/vinile solfuro-tethered

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Efficient Construction of Drug-like Bispirocyclic Scaffolds Via Organocatalytic Cycloadditions of &#945;-Imino &#947;-Lactones and Alkylidene Pyrazolones

Bispirocyclic scaffolds are one of the important structural subunits in many natural products that exhibit diverse and attractive biological activities. Recently, we have developed an efficient organocatalytic strategy, which provides facile access to a variety of enantiomerically enriched bispiro[&#947;-butyrolactone-pyrrolidin-4,4&#39;-pyrazolone] skeletons. In this paper, we demonstrate a detailed protocol for the asymmetric synthesis of drug-like bispirocyclic compounds with two spirocyclic carbon centers via an organocatyltic 1,3-dipolar cycloaddition reaction. Spirocyclization synthons &#945;-imino &#947;-lactones and alkylidene pyrazolones are prepared first, which are then subjected to a cycloaddition reaction in the presence of a bifunctional squaramide organocatalyst to afford the desired bispirocycles in high yields and excellent stereoselectivities. Chiral high-performance liquid chromatography (HPLC) is carried out to determine the enantiomeric purity of the products, and the d.r. value is examined by proton nuclear magnetic resonance (1H NMR). The absolute configuration of the product is assigned according to an X-ray crystallographic analysis. This synthetic strategy allows scientists to prepare a diversity of bispirocyclic scaffolds in high yields and excellent diastereo- and enantioselectivities.

Enantiomerically enriched bispiro[&#947;-butyrolactone-pyrrolidin-4,4&#39;-pyrazolone] skeletons are asymmetrically synthesized through a simple organocatalytic 1,3-dipolar cycloaddition reaction.

Costruzione efficiente di Drug-like Bispirocyclic ponteggi Via ORGANOCATALISI CICLOADDIZIONI di α-immino γ-lattoni e alchilidene pirazolone

Bispirocyclic scaffolds are one of the important structural subunits in many natural products that exhibit diverse and attractive biological activities. ...

Preparation of Enantiopure Non-Activated Aziridines and Synthesis of Biemamide B, D, and epiallo-Isomuscarine

Nitrogen-containing heterocycle aziridines are synthetically very valuable for the preparation of azacyclic and acyclic molecules. However, it is very difficult and laborious to make aziridines in optically pure forms on a large scale to apply asymmetric synthesis of aza compounds. Fortunately, we successfully achieved both enantiomers (2R)- and (2S)-aziridine-2-carboxylates with the electron-donating &#945;-methylbenzyl group at the ring nitrogen as non-activated aziridines. These starting aziridines have two distinct functional groups-highly reactive three-membered ring and versatile carboxylate. They are applicable in ring-opening or ring-transformation with aziridine and in functional group transformation to others from carboxylate. Both of these enantiomers were utilized in the preparation of biologically important amino acyclic and/or aza-heterocyclic compounds in an asymmetric manner. Specifically, this report describes the first expedient asymmetric synthesis of both enantiomers of 5, 6-dihydrouracil-type marine natural products biemamide B and D as potential TGF-&#946; inhibitors. This synthesis consisted of regio- and the stereoselective ring-opening reaction of aziridine-2-carboxylate and subsequent formation of 4-aminoteterahydropyrimidine-2,4-dione. One more example in this protocol dealt a highly stereoselective Mukaiyama reaction of aziridine-2-carboxylate and silyl enol ether, following intramolecular aziridine ring-opening to provide easy and facile access to (-)-epiallo-isomuscarine.

Preparation of Enantiopure Non-Activated Aziridines and Synthesis of Biemamide B, D, and epiallo-Isomuscarine

In this study, we prepare both enantiomers of aziridine-2-carboxylate, which are used in the asymmetric synthesis of alkaloids, including biemamide B and D, and (-)-epiallo-isomuscarine.

Preparazione di aziridine non attivate enantiopure e sintesi di biemamide B, D ed epiallo-isomuscarina

Nitrogen-containing heterocycle aziridines are synthetically very valuable for the preparation of azacyclic and acyclic molecules. However, it is very ...

Organocatalysis

Source: Vy M. Dong and Faben Cruz, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
This experiment will demonstrate the concept of organocatalysis by illustrating the proper setup of a reaction that utilizes enamine catalysis. Organocatalysis is a form of catalysis that uses substoichiometric amounts of small organic molecules to accelerate reactions. This type of catalysis is complementary to other forms of catalysis such as transition metal or biocatalysis. Transition metal catalysis involves transition metals as catalysts and biocatalysis uses enzymes as catalysts. Some advantages of organocatalysis include the low toxicity and cost of the organocatalysts in comparison to many metal catalysts. In addition, most organocatalysts are not sensitive to air and moisture, unlike metal catalysts. In contrast to enzymes found in living organisms, the small molecules that act as organocatalysts are typically easy to access. Furthermore, organocatalysis offers complementary and new reactivity not observed with other forms of catalysis.

Organocatalysis: Principles and Applications

Organocatalisi

Source: Vy M. Dong and Faben Cruz, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
This experiment will demonstrate the concept of ...

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Chimica organica II

Acid Halides to Esters: Alcoholysis

Alcoholysis is a nucleophilic acyl substitution reaction in which an alcohol functions as a nucleophile. Acid halides react with alcohol to produce esters. The mechanism proceeds in three steps:
<ol>
	<li>First, the alcohol acts as a nucleophile and attacks the acyl carbon to form a tetrahedral intermediate.</li>
	<li>Next, the carbonyl re-forms with the loss of a chloride ion.</li>
	<li>Lastly, the positively charged intermediate loses a proton to give an ester as the final product along with H3O+, making HCl an overall byproduct of the reaction.</li>
</ol>
<img alt="Figure1" src="/files/ftp_upload/12362/12362_PT_Figure_1.svg" style="text-align: center; height: 200px;" />
Pyridine is used as a base to neutralize the acidic reaction mixture.
Alcoholysis of sulfonyl chlorides follows a similar pattern and forms sulfonic acid esters.
<img alt="Figure2" src="/files/ftp_upload/12362/12362_PT_Figure_2.svg" style="text-align: center; height: 75px;" />

Alogenuri acidi a esteri: Alcolysis

Alcoholysis is a nucleophilic acyl substitution reaction in which an alcohol functions as a nucleophile. Acid halides react with alcohol to produce ...

Reazioni a cascata enzimatica per la sintesi di Amino alcoli chirali da L-lisina

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