Gli autori riconoscono sostegno finanziario dalle sovvenzioni Fondazione di Cina in scienze naturali (n. 21372023, 21778009 e 81701818); il Ministero della scienza e della tecnologia della Repubblica popolare cinese (n. 2015DFA31590); La Shenzhen Comitato scientifico e tecnologico dell'innovazione (No. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 e GJHS20170310093122365); e la Cina post-dottorato Science Foundation (n. 2017 M 610704).

1. preparazione del materiale
<ol><li>Per l'apparecchio manuale di sintesi del peptide, posizionare un collettore ad aspirazione (Tabella materiali) in una cappa efficiente. Successivamente, inserire rubinetti a tre vie sul collettore sottovuoto e collegarli ad una linea di gas azoto o argon. Chiudere tutti gli ingressi non utilizzati tramite setti in gomma.</li>
	<li>Collegare le colonne piene di resina (0,8 x 4 cm, serbatoio 10 mL, Vedi Tabella materiali) al collettore utilizzando il rubinetto di arresto di tre vie (Figura 1). Utilizzare una pompa collegata ad un sistema di vuoto come filtrazione sotto vuoto o un bulbo di gomma pipetta estrudendo per rimuovere il solvente nelle colonne.</li>
	<li>Uso un photoreactor (Figura 2), dotato di lampade di dieci 350 nm (Tabella materiali) per irradiazione UV. Collegarle ad un serbatoio di gas argon tramite la presa d'aria di photoreactor per garantire che il photoreactor è riempito con gas argon prima e durante i FOTOREAZIONI.</li>
	<li>Prima di accendere la lampada UV della photoreactor, assicurarsi che la porta di photoreactor è chiuso nel caso in cui c'è l'irradiazione della luce UV.</li>
</ol>2. resina preparazione
Nota: In generale, la costruzione dei substrati del peptide è effettuata utilizzando protocolli di sintesi peptidica in fase solida Fmoc-basato. Questi sono effettuati utilizzando la resina di ammide di pista che lascia una C-terminale dell'ammide restanti seguenti peptide scissione. Questo protocollo viene utilizzato in tutto il libro.
Attenzione: N, N- dimetilformammide (DMF), diclorometano (DCM), 4-metilmorpholin-(NMM) e la N, N- diisoproylethylamine (DIPEA) sono tossico e nocivo per inalazione, ingestione o contatto con la pelle. Etere dietilico è estremamente infiammabile. Acido trifluoroacetico (TFA) è corrosivo. 1,2-etanditiolo (EDT) sono altamente maleodorante. Di conseguenza, tutti i solventi organici e prodotti chimici dovrebbero essere maneggiati con appropriati dispositivi di protezione individuale (guanti in nitrile, camice e occhiali protettivi) e gestiti all'interno di una cappa chimica.
<ol><li>Calcolare la quantità di resina necessaria utilizzando la seguente formula: scala (mmol) / (capacità di carico (mmol/g) 1.000 (mg/g) in resina) = massa di resina (mg) Ad esempio, la quantità di pista ammide MBHA resina (0,5 mmol/g) per 25 µmol = 0.025 mmol / (0,5 mmol/g 1.000 mg/g) = 50 mg. Successivamente, pesare 50 mg di resina in una colonna e impostarlo sul collettore di aspirazione tramite rubinetti a tre vie.</li>
	<li>Aggiungere 1-2 mL di DCM alla resina in una colonna (0,8 x 4 cm, serbatoio 10 mL). Per gonfiare la resina, agitare delicatamente utilizzando un flusso di azoto o argon per 10 min. Successivamente, togliere il solvente mediante filtrazione sotto vuoto.</li>
</ol>3. lavaggio e deprotezione Fmoc N-terminale
<ol><li>Preparare il Fmoc N-terminale comando soluzione: preparare un adeguato volume (200 mL) di 50% (v/v) morpholine in DMF in bottiglia di vetro.</li>
	<li>Aggiungere 1-2 mL di soluzione deprotezione alla resina, agitare delicatamente per 10 minuti e poi scolare la soluzione utilizzando un vuoto. Con DMF (1-2 mL) e DCM (1-2 mL) in quell'ordine, lavare la resina e il recipiente di reazione accuratamente per un totale di 3 volte. Quindi, ripetere le procedure deprotezione e lavare 1 x.</li>
</ol>4. Fmoc-protetto amminoacido accoppiamento
<ol><li>Tramite l'accoppiamento di residui di alanina ad esempio, nel caso di una sintesi manuale 25 µmol-scala, pesare Fmoc-Ala-OH (5 equiv., 41,4 mg), Esafluorofosfato di 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium (HCTU; 4,9 equiv., 50,5 mg) in un contenitore in polipropilene e sciogliere in DMF (0,5 mL).</li>
	<li>Aggiungere DIPEA (10 equiv., µ l 43,5) al fine di generare un 0.25-M attivato soluzione dell'aminoacido (tabella 1). A seguito di pre-un'attivazione approssimativo 1 min, aggiungere la soluzione di resina e quindi di bolla con N2 per circa 1-2 h.</li>
	<li>Da questo punto, incorporare ogni amminoacido nella catena peptidica come una sequenza di passi: prima la deprotezione del N-terminale Fmoc-gruppo e quindi il lavaggio, seguita dall'accoppiamento dell'aminoacido via l'attivazione utilizzando HCTU. Nota: Un più lungo tempo di accoppiamento (ad es., 2h) è consigliato se giunto a seguito di un residuo dell'amminoacido stericamente [ad es., Fmoc-Thr (tBu) - OH, Fmoc-Cys (Trt) - OH, Fmoc-His (Trt) - OH, Fmoc-Arg (Pbf) - OH]. L'alchenico/alchini cuscinetto amminoacidi non-naturali sono utilizzati in equivalenti di 3 invece di 5 e sono lasciati a reagire per 3 h.</li>
	<li>Monitorare l'avanzamento di sintesi del peptide utilizzando test Kaiser o cloranile, come descritto da Arora et al. 36 questi test forniscono una valutazione qualitativa della presenza o assenza di ammine primarie e secondarie gratis. In alternativa, circa 2-3 mg del peptide possono essere spaccati dalla resina e analizzati mediante LC-MS.</li>
</ol>5. tiolo-ene Hydrothiolation e del tiolo-yne ciclizzazione
<ol><li>Costrutto linker tioetere attraverso il resina ciclizzazione (Figura 3).<ol>
<li>Preparare circa 50 mL della soluzione deprotezione Trt (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0). Trattare la Cys - e mS5-cuscinetto resina [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-resina, 50mg] con 1-2 mL della soluzione di deprotezione Trt in una colonna di 10 mL. Agitare delicatamente la soluzione per 10 min utilizzando N2. Infine, lavarlo con DCM (1-2 mL) per un totale di 3 volte. Nota: MS5 rappresenta il blocco di costruzione alchene-cuscinetto (Vedi la struttura raffigurata nella Figura 6) utilizzato per peptide accoppiamento e thio-ene ciclizzazione38.</li>
		<li>Ripetere la procedura descritta sopra per un totale di circa 6 x al fine di rimuovere il gruppo di protezione trityl della cisteina, fino a quando il colore della soluzione non è più giallo.</li>
		<li>Gorgogliare con N2, lavare il R-mS5- A-A-A-Cys(-SH)-R'-resina [cisteina con thio gratis (-SH)] con DMF (1-2 mL) e DCM (1-2 mL) in quell'ordine. Compattare la resina con metanolo (1-2 mL) per 2 minuti e poi rimuovere il solvente mediante filtrazione. Successivamente, in sequenza e asciugare la resina sotto un vapore di gas di2 N per circa 5 min nella colonna.</li>
		<li>Preparare in anticipo, DMF degassato all'interno di un fiasco di bocca, di bubbling azoto gassoso per circa 1h attraverso un lungo ago che è stato allungato in solvente.</li>
		<li>Trasferire la resina in un pallone a fondo rotondo 10 mL attraverso carta da pesare. Sospendere la resina in 2 mL del DMF degassato seguito dall'aggiunta del fotoiniziatore 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP; 1 equiv., 5,6 mg), 4-metossiacetofenone (mappa; 1 equiv., 3,8 mg).</li>
		<li>Aggiungere una mescolare barra (0,3 cm) nel pallone e il pallone con un tappo in gomma adatto di cap, quindi spostare l'aria nel pallone con gas azoto utilizzando una pompa dell'olio. Nota: L'atmosfera inerte non è strettamente necessario per la fotoreazione efficace thio-ene su fase solida. Tuttavia, è molto necessario per la fotoreazione thio-yne in fase di soluzione nella Figura 5. In caso contrario, lo zolfo si ossida durante l'irradiazione UV.</li>
		<li>Impostare il pallone di reazione nella photoreactor e mescolare la resina per 1h sotto irradiazione UV a temperatura ambiente (Figura 2). Attenzione: Prima di accendere la lampada UV photoreactor, assicurarsi che la porta photoreactor è chiusa in caso di irradiazione è nocivo dalla luce UV. Nota: Frequentemente la miscela di reazione di campionamento durante i FOTOREAZIONI è consigliabile per le nuove sequenze, come il precursore del peptide lineare ha l'identico peso molecolare del prodotto. In generale, peptidi lineari e ciclici visualizzare significativamente differente idrofilia. Questo potrebbe essere facilmente distinto mediante HPLC. In alternativa, il 5, 5' - ditiobis-(acido 2-nitrobenzoico) reagente (DTNB) potrebbe essere utilizzato anche per studiare la presenza di libero tiolo37.</li>
		<li>Trasferire la resina dal pallone nella colonna e rimuovere il solvente mediante filtrazione sotto vuoto. Lavare e asciugare la resina come descritto al punto 5.1.3.</li>
		<li>Preparare circa 10 mL di cocktail la scissione (TFA/suggerimenti/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) nella cappa.</li>
		<li>Trasferire la resina in un contenitore in polipropilene 2 mL, aggiungere 1 mL di cocktail di clivaggio (TFA/suggerimenti/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) al contenitore e sigillare il contenitore ermeticamente con un tappo a vite. Quindi, agitare delicatamente il contenitore in un agitatore orbitale a una velocità di 60 rpm nella cappa per 1,5-2 h. Attenzione: TFA è altamente corrosivo. Indossare indumenti protettivi e lavorare in una cappa efficiente. EDT è una sostanza altamente maleodorante e deve essere gestito in una cappa efficiente.</li>
		<li>Rimuovere il cocktail TFA per evaporazione sotto un flusso di gas N2 nella cappa. Successivamente, precipitare il residuo usando freddo etere dietilico (1 mL) per 30 s e isolate tramite centrifugazione a 12.000 x g per 2 min. Dopo la centrifugazione, delicatamente versare il componente di etere. Ripetere i passaggi precipitato e centrifugazione per 2x. Evaporare il residuo di secchezza.</li>
		<li>Infine, disciogliere il residuo in 1 mL di H2O/acetonitrile (2:1) e purificare da HPLC usando una colonna analitica C18 (4.6 x 250 mm, portata nominale di 1,0 mL/min). Uso H2O (contenente 0,1% TFA) ed acetonitrile puro come solventi in una sfumatura lineare 2%/min dal 20% al 70% acetonitrile sopra 25 min spettri di Monitor HPLC usando UV 280 nm e 220 lunghezze d' (tabella 2) onda nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Costruire il linker tioetere attraverso reazione intermolecolare thio-ene e poi cyclize il peptide di macrolactamization (Figura 4).<ol>
<li>Sintetizzare il residuo alchilico recanti il peptide lineare H2N-A-A-A-mS5(2-R ')-R'-resina (50 mg) con una sintesi del peptide di fase solida Fmoc-based standard (SPPS) come descritto nei passaggi 2-4. Successivamente, lavare e asciugare la resina come descritto al punto 5.1.3.</li>
		<li>Sospendere la resina in un pallone a fondo rotondo 10 mL contenente 2 mL del DMF degassato come descritto al punto 5.1.4.</li>
		<li>Aggiungere il fotoiniziatore MMP e mappa (MMP: 1 equiv., 5,6 mg; Mappa: 1 equiv., 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (3 equiv., 25,7 mg) e scalpore barra (0,3 cm) nel pallone. Tappare la beuta con un tappo in gomma adatto e quindi utilizzare la pompa dell'olio per sostituire l'aria nel pallone con azoto.</li>
		<li>Impostare il pallone di reazione nella photoreactor. Mescolare per 1-2 h sotto irradiazione UV a temperatura ambiente (Figura 2).</li>
		<li>Monitorare la reazione sotto un'analisi LC-MS: cleave 2-3 mg della resina con il cocktail di clivaggio. Poi precipitare il residuo con freddo etere dietilico (300 µ l), isolare il residuo mediante centrifugazione ed evaporare i residui di secchezza come descritto nel passaggio 5.1.11. Dopo di che, disciogliere il residuo in 100 µ l di H2O/acetonitrile (2:1). La soluzione di peptide utilizzando una pellicola microporosa da 0,22 µm del filtrato e analizzarlo mediante LC-MS con il composto ionizzato nell'ionizzazione electrospray (ESI) e gestito in modo positivo.</li>
		<li>Se necessario, ripetere i passaggi 5.2.2 - 5.2.4 affinché la reazione avviene al completamento.</li>
		<li>A seguito del completamento della foto-reazione, trasferire la resina dal pallone nella colonna e rimuovere il solvente mediante filtrazione sotto vuoto. Lavare e asciugare la resina come descritto al punto 5.1.3.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione DMF di Esafluorofosfato di benzotriazolo-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBob; 2,4 equiv., 31,2 mg), 1-parola (HoBt; 2,4 equiv., 8,1 mg) e NMM (4 equiv., 11 µ l) per la resina nella colonna per la macrolactamization. Bolla di questa soluzione con N2 per 2 h.<ol>
<li>Inoltre, monitorare la reazione di accoppiamento mediante LC-MS come descritto al punto 5.2.3. Se necessario, ripetere questo passaggio per garantire la reazione avviene al completamento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Allungare il peptide utilizzando standard basati su Fmoc SPPS come descritto nei passaggi 3 e 4.</li>
		<li>All'Assemblea di tutti i residui dell'amminoacido, fendere il peptide dalla resina, come descritto nei passaggi 5.1.10 e 5.1.11 e purificarla come descritto nel passaggio 5.1.12.</li>
	</ol></li>
	<li>Costrutto del linker di solfuro di vinile in fase di soluzione (Figura 5).<ol>
<li>Sintetizzare il residuo di alchini cuscinetto lineare del peptide utilizzando standard basati su Fmoc SPPS come descritto nei passaggi 2-4. Sintetizzare l'alchino cuscinetto dell'amminoacido secondo un protocollo ben stabilito come descritto in un precedente studio20.</li>
		<li>Fendere il peptide dalla resina e precipitare utilizzando etere etilico freddo come descritto nei passaggi 5.1.9 - 5.1.11. Dopo la scissione e la precipitazione della resina, raccogliere il peptide mediante centrifugazione a 12.000 x g per 2 min.</li>
		<li>Asciugare il residuo risultante in un vuoto. Sciogliere il residuo con il DMF degassato (50 mL) in un pallone a fondo rotondo da 100 mL al fine di raggiungere una concentrazione finale di 0.5 mM (basato sul carico di resina, 0.025 mmol (1000 mL/L / 0,5 mmol/L) = 50 mL).<ol>
<li>Aggiungere il fotoiniziatore DMPA (0,5 equiv., 3,2 mg) e poi degassare la soluzione di reazione per 10 min utilizzando N2 attraverso un lungo ago allungato nella soluzione. Successivamente, irradiare il campione sotto UV luce a temperatura ambiente per 0,5 - 1 h senza agitazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rimuovere il DMF sotto alto vuoto e precipitare il residuo grezzo con l'aggiunta di etere etilico al fine di sciogliere i suoi sottoprodotti organici. Quindi, isolare il residuo mediante centrifugazione a 12.000 x g per 2 min. Dopo la centrifugazione, delicatamente versare il componente di etere. Evaporare il residuo di secchezza. Infine, disciogliere il residuo in 1 mL di H2O/acetonitrile (2:1) e purificarlo mediante HPLC come descritto al punto 5.1.7.</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Nella ciclizzazione intramolecolare su resina thio-ene descritti nella Figura 3, la rimozione del gruppo trityl di un residuo di cisteina è stata trovata per essere un passo fondamentale per la successiva fotoreazione. Inoltre, il peso molecolare del peptide prima di e dopo che la reazione è stata trovata per essere identici come raffigurato in Figura 6B. Pertanto, l'uso di un'identificazione di HPLC o un'analisi DTNB è necessaria al fine di monitorare la rea...

Lo sviluppo di ligandi per modulare le interazioni proteina-proteina (PPIs) fornisce un approccio attraente per la scoperta di farmaci moderni. Così, una grande quantità di sforzo è stata investita in studiare nuove modalità di chimica che potrebbe efficacemente modulano PPIs1,2,3. PPI consistono generalmente di superfici interagenti poco profonde, grandi e/o fuori produzione, e piccole molecole in genere sono considerati non idonei leganti per la modulazione di PPIs4,5. Con un'adatta interagente superficie esposta, brevi peptidi che imitano le caratteristiche strutturali delle proteine interfacce rappresentano i candidati ideali per affrontare questo problema6,7. Tuttavia, brevi peptidi sono in genere non strutturati in una soluzione acquosa. Questo è dovuto al fatto che le molecole di acqua che sono in concorrenza con la rete di legami idrogeno intramolecolari della spina dorsale del peptide e conformazioni ben definite sono entropically sfavorevoli in acqua8. Inoltre, i peptidi intrinsecamente bassa stabilità e proprietà di permeabilità delle cellule in gran parte limitano il loro uso in applicazioni biologiche9,10. Secondo l'analisi di protein data bank (PDB), > 50% degli IPP coinvolgono breve α-elica interazioni11. Così, sono stati sviluppati diversi metodi chimici per quanto riguarda la stabilizzazione dell'elica. Questi includono disolfuro/thioether bond formazione12,13,14, ciclizzazione metatesi15, lattame anello formazione16, "clic" chimica17, aggiunta di perfluoroarenes18,19e vinile-solfuro formazione20.
Stabilizzato elicoidale peptidi sono ampiamente utilizzati per i vari bersagli intracellulari, tra cui p53, proteine della famiglia di BCL-2 di estrogeno recettori, Ras, e altri21,22,23,24. ALRN-6924, un all-idrocarburo pinzati inibitore doppio del peptide di MDM2 e MDMX, è attualmente utilizzato per indagine clinica25. Negli ultimi anni, il nostro gruppo si è concentrata sullo sviluppo di metodi di stabilizzazione peptide novello utilizzando tiolo-ene e tiolo-yne reazioni26,27,28. In generale, abbiamo dimostrato che queste reazioni foto-avviato sono efficienti in condizioni blande quando naturalmente abbondante cisteina è usata. Inoltre, abbiamo indicato che queste reazioni hanno una tolleranza eccellente gruppo funzionale, sono bio-ortogonali e hanno dimostrate di essere applicabile per le modifiche della proteina e del peptide29. I peptidi di solfuro tethered thioether/vinile risultante in gran parte migliorare lo spazio chimico dei peptidi di vincolo, forniscono un centro di labile il tether modifica e ha dimostrati di essere applicabile per impiego in numerose applicazioni biologiche30 ,31,32. Fin qui, soltanto rapporti limitati sono stati descritti per quanto riguarda la ciclizzazione del tiolo-ene/tiolo-yne peptide. In uno studio pubblicato da Anseth et al. nel 2009, una reazione su resina intramolecolare del tiolo-ene per ciclizzazione del peptide tra alcheni attivati con cisteina è stata dimostrata33. Nel 2015, Chou et al. descritto una reazione del due-componente radicale avviato tiolo-ene per peptide pinzatura34 e una reazione di accoppiamento del tiolo-yne/ene successivi, sequenziale35. Recentemente, abbiamo descritto una serie di lavoro basato su thioether/vinile solfuro tethered peptidi20,26,27. Questo protocollo descrive una sintesi dettagliata dei peptidi solfuro legato suddetto thioether/vinile nella speranza che esso sarà utile per la più ampia comunità di ricerca.

<table><tbody><tr><td>Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g)</td><td>HECHENG</td><td>GRM50407</td><td></td></tr><tr><td>Standard Fmoc-protected amino acids</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-2-pyrrolidinone</td><td>Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd.</td><td>3230</td><td>skin harmful</td></tr><tr><td>N,N-Dimethyl formamide</td><td>Energy</td><td>B020051</td><td>skin harmful</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Energy</td><td>W330229</td><td>skin harmful</td></tr><tr><td>N,N-Diisoproylethylamine</td><td>Aldrich</td><td>9578</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>J&amp;amp;K</td><td>101398</td><td>corrosive</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>J&amp;amp;K</td><td>973821</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>J&amp;amp;K</td><td>248897</td><td>Stench</td></tr><tr><td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate&amp;nbsp;</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td>851012</td><td></td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>Aldrich</td><td>M109062</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>flammable</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxicity</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxicity</td></tr><tr><td>2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone</td><td>Energy</td><td>A050035</td><td></td></tr><tr><td>4-methoxyacetophenone</td><td>Energy</td><td>A050098</td><td></td></tr><tr><td>2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone</td><td>Energy</td><td>D070132</td><td></td></tr><tr><td>5,5&#039;-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)</td><td>J&amp;amp;K</td><td>281281</td><td></td></tr><tr><td>Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate</td><td>Energy</td><td>E020172</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxybenzotriazole</td><td>Energy</td><td>D050256</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylmorpholine</td><td>Energy</td><td>W320038</td><td></td></tr><tr><td>High Performance Liquid Chromatography</td><td>SHIMADZU</td><td>LC-30AD</td><td></td></tr><tr><td>Electrospray Ionization Mass</td><td>SHIMADZU</td><td>LCMS-8030</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>FreeZone</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentration system</td><td>Thermo</td><td>Savant</td><td></td></tr><tr><td>vacuum manifold</td><td>promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>three-way stopcocks</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>poly-prep chromatography columns&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr></tbody></table>

constructing thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides via photo-induced thiol-ene/yne hydrothiolation

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di peptidi thioether-tethered utilizzando su resina intramolecolare/intermolecolare del tiolo-ene hydrothiolation. Inoltre, questo protocollo descrive la preparazione di peptidi vinile-solfuro-tethered utilizzando in soluzione intramolecolare del tiolo-yne hydrothiolation tra aminoacidi che possiedono catene laterali alchenico/alchini e residui di cisteina a i, i + 4 posizioni. Peptidi lineari sono stati sintetizzati utilizzando una sintesi peptidica in fase solida Fmoc-based standard (SPPS). Tiolo-ene hydrothiolation avviene tramite una reazione intramolecolare thio-ene o una reazione intermolecolare thio-ene, a seconda della lunghezza del peptide. In questa ricerca, una reazione intramolecolare thio-ene avviene nel caso dei peptidi più brevi utilizzando su resina deprotezione dei gruppi trityl di residui di cisteina seguendo la sintesi completa del peptide lineare. La resina viene quindi impostata di irradiazione UV utilizzando fotoiniziatore 4-metossiacetofenone (mappa) e 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). La reazione intermolecolare del tiolo-ene è effettuata tramite la dissoluzione di Fmoc-Cys-OH in un solvente di N, N- dimetilformammide (DMF). Questo è poi fatto reagire con il peptide utilizzando il residuo di alchenico-cuscinetto in resina. Dopo di che, la macrolactamization avviene mediante Esafluorofosfato di benzotriazolo-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBop), 1-parola (HoBt) e 4-metilmorpholin-(NMM) come reagenti di attivazione sulla resina. In seguito il macrolactamization, è continuata la sintesi peptidica utilizzando standard SFF. Nel caso la hydrothiolation thio-yne, il peptide lineare è spaccato dalla resina, essiccato e successivamente disciolto in DMF degassato. Questo poi viene irradiato con luce UV fotoiniziatore 2,2-dimetossi-2-phenylacetophenone (DMPA). A seguito della reazione, DMF è evaporata e il residuo grezzo è precipitato e purificati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Questi metodi potrebbero funzionare per semplificare la generazione di peptidi ciclici thioether-legato a causa dell'uso della chimica thio-ene/yne clic che possiede tolleranza superiore gruppo funzionale e buona resa. L'introduzione delle obbligazioni thioether peptidi sfrutta la natura nucleofila di residui di cisteina e redox-inerte rispetto i legami bisolfurico.

Gli spettri di HPLC e MS del peptide Ac-YmS5AAAC-NH2 e il suo prodotto ciclizzata Ac - Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 che sono stati generati usando la fotoreazione su resina intramolecolare del tiolo-ene sono raffigurati in Figura 6B. il peptide ciclico è stato trovato per avere un peso molecolare identico rispetto al suo precursore lineare. Tuttavia, suo tempo di ritenzione HPLC è stato osservato per essere circa...

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Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Costruzione di peptidi elicoidale Via foto-indotta del tiolo-ene/yne Hydrothiolation Thioether/vinile solfuro-tethered

Vi presentiamo un protocollo per la costruzione di thioether/vinile peptidi elicoidale solfuro-tethered utilizzando foto-indotta del tiolo-ene/tiolo-yne hydrothiolation.

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

constructing-thioethervinyl-sulfide-tethered-helical-peptides-via

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K Views.  Peking University Shenzhen Graduate School. Vi presentiamo un protocollo per la costruzione di thioether/vinile peptidi elicoidale solfuro-tethered utilizzando foto-indotta del tiolo-ene/tiolo-yne hydrothiolation.

Video: Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Un approccio Facile ed efficiente per la produzione di micelle reversibile Disulfide Croce-linked

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Ricerca

Biochimica

Synthesis of Programmable Main-chain Liquid-crystalline Elastomers Using a Two-stage Thiol-acrylate Reaction

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline elastomers (LCEs) with facile control over network structure and programming of an aligned monodomain. Tailored LCE networks were synthesized using routine mixing of commercially available starting materials and pouring monomer solutions into molds to cure. An initial polydomain LCE network is formed via a self-limiting thiol-acrylate Michael-addition reaction. Strain-to-failure and glass transition behavior were investigated as a function of crosslinking monomer, pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate) (PETMP). An example non-stoichiometric system of 15 mol% PETMP thiol groups and an excess of 15 mol% acrylate groups was used to demonstrate the robust nature of the material. The LCE formed an aligned and transparent monodomain when stretched, with a maximum failure strain over 600%. Stretched LCE samples were able to demonstrate both stress-driven thermal actuation when held under a constant bias stress or the shape-memory effect when stretched and unloaded. A permanently programmed monodomain was achieved via a second-stage photopolymerization reaction of the excess acrylate groups when the sample was in the stretched state. LCE samples were photo-cured and programmed at 100%, 200%, 300%, and 400% strain, with all samples demonstrating over 90% shape fixity when unloaded. The magnitude of total stress-free actuation increased from 35% to 115% with increased programming strain. Overall, the two-stage TAMAP methodology is presented as a powerful tool to prepare main-chain LCE systems and explore structure-property-performance relationships in these fascinating stimuli-sensitive materials.

A novel methodology is presented to synthesize and program main-chain liquid-crystalline elastomers using commercially available starting monomers. A wide range of thermomechanical properties was tailored by adjusting the amount of crosslinker, while the actuation performance was dependent on the amount of applied strain during programming.

Sintesi di programmabile principale catena Elastomeri liquido-cristallini Utilizzando una a due stadi Thiol-acrilato di reazione

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline ...

Chimica

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

Generazione e recupero dei β-cellule Spheroids dal passaggio di crescita PEG-peptide idrogel

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Bioingegneria

Self-assembling Morphologies Obtained from Helical Polycarbodiimide Copolymers and Their Triazole Derivatives

A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous networks, ribbons, worm-like aggregates, toroidal structures, and spherical particles) is described. These aggregates are morphologically influenced by extensive hydrophobic side chain-side chain interactions of the singular polycarbodiimide strands, as inferred by atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) techniques. Polycarbodiimide-g-polystyrene copolymers (PS-PCDs) were prepared by a combination of synthetic methods, including coordination-insertion polymerization, copper(I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition (CuAAC) &#34;click&#34; chemistry, and atom transfer radical polymerization (ATRP). PS-PCDs were found to form specific toroidal architectures at low concentrations in CHCl3. To determine the influence of a more polar solvent medium (i.e., THF and THF/EtOH) on polymer aggregation behavior, a number of representative PS-PCD composites have been tested to show discrete concentration-dependent spherical particles. These fundamental studies are of practical interest to the development of experimental procedures for desirable architectures by directed self-assembly in thin film. These architectures may be exploited as drug carriers, whereas other morphological findings represent certain interest in the area of novel functional materials.

Here, we present a protocol to prepare and visualize secondary structures (e.g., fibers, toroidal architectures, and nano-spheres) derived from helical polycarbodiimides. The morphology characterized by both atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) was shown to depend on molecular structure, concentration, and the solvent of choice.

Morfologie autoassemblanti Ottenuto da elicoidali policarbodiimide copolimeri e loro derivati ​​triazolici

A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and porous metal-dithiolene network in the highly ordered single crystalline state. Unlike the highly reactive free-standing thiols, which tend to decompose and complicate the crystallization of metal-thiolate open frameworks, the thioester reacts in situ to provide the thiol species, serving to mitigate the reaction between the mercaptan units and the metal centers, and to improve crystallization consequently. Specifically, the thioester was synthesized in a one-pot procedure: an aromatic bromide (hexabromotriphenylene) reacted with excess sodium thiomethoxide under vigorous conditions to first form the thioether intermediate product. The thioether was then demethylated by the excess thiomethoxide to provide the thiolate anion that was acylated to form the thioester product. The thioester was conveniently purified by standard column chromatography, and then used directly in the framework synthesis, wherein NaOH and ethylenediamine serve to revert in situ the thioester to the thiol linker for assembling the single-crystalline Pb(II)-dithiolene network. Compared with other methods for thiol synthesis (e.g., by cleaving alkyl thioether using sodium metal and liquid ammonia), the thioester synthesis here uses simple conditions and economical reagents. Moreover, the thioester product is stable and can be conveniently handled and stored. More importantly, in contrast to the generic difficulty in accessing crystalline metal-thiolate open frameworks, we demonstrate that using the thioester for in situ formation of the thiol linker greatly improves the crystallinity of the solid-state product. We intend to encourage broader research efforts on the technologically important metal-sulfur frameworks by disclosing the synthetic protocol for the thioester as well as the crystalline framework solid.

Here, we present a one-pot, transition-metal-free synthesis of thiols and thioesters from aromatic halides and sodium thiomethoxide, followed by the preparation of single crystals of a metal-dithiolene network using thiol species generated in situ from the more stable and tractable thioester.

Sintesi di un tiolo Building Block per la cristallizzazione di un quadro di Gyroidal metallo-zolfo ossidi semiconduttori

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting self-assembled supramolecular structures. The synthetic route takes advantage of solid-phase peptide synthesis with the on-resin coupling of the dithiolane precursor molecule, 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl)propanoic acid, and the microwave-assisted thioacetate deprotection of the peptide N-terminus before final cleavage from the resin to yield the 1,2-dithiolane modified peptide. After the high-performance liquid chromatography (HPLC) purification of the 1,2-dithiolane peptide, derived from the nucleating core of the A&#946; peptide associated with Alzheimer&#39;s disease, the peptide is shown to self-assemble into cross-&#946; amyloid fibers. Protocols to characterize the amyloid fibers by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), circular dichroism spectroscopy (CD) and transmission electron microscopy (TEM) are presented. The methods of N-terminal modification with a 1,2-dithiolane moiety to well-characterized self-assembling peptides can now be explored as model systems to develop post-assembly modification strategies and explore dynamic covalent chemistry on supramolecular peptide nanofiber surfaces.

A protocol for the synthesis of a 1,2-dithiolane modified peptide and the characterization of the supramolecular structures resulting from the peptide self-assembly.

Sintesi e caratterizzazione di 1,2-Dithiolane per volta peptidi autoassemblanti

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

Sintesi dei Peptoidi a informazione e del loro autoassemblaggio covalente dinamico diretto in sequenza

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as a consequence, they are now used clinically. It is, therefore, critical to seek effective strategies for synthesizing cyclic peptides to promote their application in the field of drug discovery. This paper reports a detailed protocol for the efficient synthesis of cyclic peptides using on-resin or intramolecular (intermolecular) bisalkylation. Using this protocol, linear peptides were synthesized by taking advantage of solid-phase peptide synthesis with cysteine (Cys) and methionine (Met) coupled simultaneously on the resin. Further, cyclic peptides were synthesized via bisalkylation between Met and Cys using a tunable tether and an on-tether sulfonium center. The whole synthetic route can be divided into three major processes: the deprotection of Cys on the resin, the coupling of the linker, and the cyclization between Cys and Met in a trifluoroacetic acid (TFA) cleavage solution. Furthermore, inspired by the reactivity of the sulfonium center, a propargyl group was attached to the Met to trigger thiol-yne addition and form a cyclic peptide. After that, the crude peptides were dried and dissolved in acetonitrile, separated, and then purified by high-performance liquid chromatography (HPLC). The molecular weight of the cyclic peptide was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and the stability of the cyclic peptide combination with the reductant was further confirmed using HPLC. In addition, the chemical shift in the cyclic peptide was analyzed by 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectra. Overall, this protocol aimed to establish an effective strategy for synthesizing cyclic peptides.

This protocol presents the synthesis of cyclic peptides via bisalkylation between cysteine and methionine and the facile thiol-yne reaction triggered by the propargyl sulfonium center.

Costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Costruzione di peptidi elicoidale Via foto-indotta del tiolo-ene/yne Hydrothiolation Thioether/vinile solfuro-tethered

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un approccio Facile ed efficiente per la produzione di micelle reversibile Disulfide Croce-linked

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Generazione e recupero dei β-cellule Spheroids dal passaggio di crescita PEG-peptide idrogel

Morfologie autoassemblanti Ottenuto da elicoidali policarbodiimide copolimeri e loro derivati triazolici

Sintesi di un tiolo Building Block per la cristallizzazione di un quadro di Gyroidal metallo-zolfo ossidi semiconduttori

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Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

Sintesi dei Peptoidi a informazione e del loro autoassemblaggio covalente dinamico diretto in sequenza

Costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola

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