著者は自然科学中国助成財団 (第 21372023、21778009 および 81701818); からの財政支援を認める科学省と中国 (第 2015DFA31590); 人民共和技術深セン科学技術イノベーション委員会 (第JCYJ20170412150719814、JCYJ20170412150609690、JCYJ20150403101146313、JCYJ20160301111338144、JCYJ20160331115853521、JSGG20160301095829250、および GJHS20170310093122365)。中国ポスドク科学財団 (610704 号 2017 M)。

1. 機器の準備
<ol><li>手動ペプチド合成装置の効率的なヒューム フードに真空マニホールド (資材表) を配置します。次に、真空マニホールドに三方活栓を置き、窒素またはアルゴン ガス管線に接続します。ゴム隔壁を使用してすべての未使用の入り江をキャップします。</li>
	<li>三方活栓 (図 1) を使用してマニホールドに樹脂充填柱 (0.8 x 4 cm、10 mL 貯水池は、材料表を参照) を接続します。押し出して真空ろ過やゴムバルブ ピペットとして真空システムに接続されたポンプを使用して、列に溶媒を削除します。</li>
	<li>使用触媒反応管 (図 2)、UV 照射による 10 350 nm ランプ (資材表) を搭載します。これらの触媒反応管はアルゴン ガス前と光反応の中に満ちていることを確保するため触媒反応管の空気吸入口を経由して、アルゴン ガス タンクに接続します。</li>
	<li>触媒反応管の UV ランプに切り替える前の UV 光から照射がある場合触媒反応管のドアが閉じていることを確認します。</li>
</ol>2. 樹脂の準備
注: 一般に、ペプチッド基板の建設が実施 fmoc 保護基固相ペプチド合成プロトコルを使用しています。これらは C 末端アミド残り次ペプチド切断を残すリンク アミド樹脂を使用して実行されます。このプロトコルは、ホワイト ペーパーで使用されます。
注意: N, N- diisoproylethylamine (DIPEA) 4-メチルモルホリン (NMM)、ジクロロ メタン (DCM) N, N- ジメチルホルムアミド (DMF)、有毒で有害な吸入、摂取、または皮膚接触によって。ジエチル エーテルは非常に可燃性です。トリフルオロ酢酸 (TFA) は、腐食性です。1, 2-エタンジチ (EDT) は高い悪臭です。したがって、すべての有機溶剤や化学物質必要があります適切な個人用保護具 (保護眼鏡、白衣、ニトリル手袋) で処理して化学の発煙のフード内で処理されます。
<ol><li>次の式を使用して必要な樹脂の量を計算します。 スケール (モル)/(積載量 (モル/g) 1,000 (mg/g) ガレージ) 樹脂 (mg) の質量を = など、25 µmol のスケート リンク アミド MBHA 樹脂 (0.5 mmol/g) の量 = 0.025 モル/(0.5 mmol/g 1,000 mg/g) = 50 mg。次に、列の樹脂の 50 mg の重量を量るし、三方活栓を使用して真空マニホールドにそれを設定します。</li>
	<li>(0.8 × 4 cm、10 mL 貯水池) 列でガレージに DCM の 1-2 の mL を追加します。樹脂を膨張するには、10 分の窒素またはアルゴンのストリームを使用した振ちましょう。次に、真空ろ過を使用して溶媒を除去します。</li>
</ol>3. N 末端 fmoc 保護および洗濯
<ol><li>N 末端 fmoc 保護ソリューションを脱保護の準備: ガラスの瓶で DMF に 50% (v/v) モルホリンの十分なボリューム (200 mL) を準備します。</li>
	<li>樹脂に 1-2 mL の脱保護ソリューションを追加、10 分間振とう、真空を使用してソリューションを排出します。その順序で DMF (1-2 の mL) および DCM (1-2 mL) を使用して、樹脂と 3 倍の合計は徹底的に反応容器を洗います。次に、および洗浄の手順 1 を繰り返します x。</li>
</ol>4. fmoc 保護保護アミノ酸の結合
<ol><li>Fmoc 保護アラ オ (5 当量、41.4 mg) の重量を量る 25 µmol スケールの手動合成の場合、例としてアラニン残基の結合を用いた 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium ヘキサフルオロリン酸 (HCTU; 4.9 当量、50.5 mg) で、ポリプロピレン容器、DMF (0.5 mL) に溶解します。</li>
	<li>追加 DIPEA (10 当量、43.5 μ l) 0.25 M を生成するためにアクティブにアミノ酸ソリューション (表 1)。おおよそ 1 分前のアクティブ化後、樹脂にソリューションに追加し、N2約 1-2 時間のバブルします。</li>
	<li>このステップからステップのシーケンスとして各アミノ酸ペプチド鎖を組み込む: 最初 N 端末 fmoc 保護グループをクリックし、洗濯、脱保護に HCTU を使用しての活性化を介してアミノ酸のカップリング。 注: 長い結合時間 (e.g。、2 h) お勧め場合次の立体障害のアミノ酸残基結合 [e.g。、fmoc 保護 Thr (tBu) - ああ、fmoc 保護 Cys (Trt) - あ、fmoc 保護彼 (Trt) - ああ、fmoc 保護 Arg (Pbf) - あ]。非天然アミノ酸を含むアルケン/アルキンは 5 ではなく 3 同等で使用され、3 時間反応する残っています。</li>
	<li>アローラet al.による記述でカイザーまたはクロラニルのテストを使用してペプチド合成の進行状況を監視します。36これらのテストは、無料の第一次および二次アミンの定性的な評価の存在の有無を提供します。また、ペプチドの約 2-3 mg は樹脂から切断し、LC-MS による分析できます。</li>
</ol>5. チオール-エン Hydrothiolation とチオール-イン環化反応
<ol><li>樹脂の環化反応 (図 3) でも、チオエーテル リンカーを構築します。<ol>
<li>Trt 脱保護ソリューション (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0) の約 50 mL を準備します。(システインプロテアーゼ) と mS5の治療-樹脂軸受 [NH2R mS5--A-A-システイン (Trt)-R'-樹脂、50 mg] 10 mL 列の Trt 脱保護ソリューションの 1-2 mL で。N2を使用して 10 分のためのソリューションを軽く振りま します。最後に、DCM の洗浄 (1 -2 mL) 3 倍の合計のため。 注: MS5を表しますアルキレン軸受建物ブロックをペプチド結合とチオ-エンの環化反応のための38の使用 (構造図6 を参照)。</li>
		<li>約 6 倍の合計はソリューションの色が黄色でなくなるまで、システイン、トリチル保護グループを削除するために上記の手順を繰り返します。</li>
		<li>2N でバブル洗浄、R mS5---A-Cys(-SH)-R'-樹脂 [無料チオとシステイン (-SH)] DMF (1-2 の mL) とその順序で DCM (1-2 の mL)。2 分のメタノール (1-2 mL) を用いた樹脂を縮小し、その後、濾過を使用して溶媒を除去します。次に、順番に列に約 5 分の N2ガスの蒸気の下で樹脂を乾燥させます。</li>
		<li>溶媒に伸ばされた長い針を通して約 1 h のバブルの窒素ガスによる脱 DMF を口フラスコ内、事前準備します。</li>
		<li>重量を量るペーパーを通して 10 mL 丸底フラスコに樹脂を転送します。2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone 光反応開始剤の添加に続いて脱 DMF の 2 mL の樹脂を中断 (MMP; 1 当量、5.6 mg)、4 methoxyacetophenone (地図; 1 当量、3.8 mg)。</li>
		<li>波紋を追加 (0.3 cm) をフラスコにバーし、適切なゴムのプラグがフラスコのキャップ、油ポンプを使用して窒素ガスでフラスコ内の空気を置換します。 注: 不活性雰囲気は固相に効果的なチオ-エン反応を厳密に必要ありません。ただし、図5 ソリューション フェーズでチオ-イン光反応の非常に必要は。それ以外の場合、硫黄は、UV 照射中に酸化されます。</li>
		<li>反応フラスコを触媒反応管にセットし、室温 (図 2) で 1 h の紫外光照射下の樹脂を攪拌します。 注意: 触媒反応管紫外線ランプを交換する前に、有害な紫外光照射がある場合触媒反応管のドアが閉じていることを確認します。 メモ: は、線形ペプチド前駆体製品の同一の分子量があり、新しいシーケンスの勧めよく光反応中の反応混合物をサンプリングします。一般に、線形、環状ペプチドは、大幅に異なる親水性を表示します。これが簡単に高速液体クロマトグラフィーを使用して区別します。また、5, 5' - ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸) (DTNB) 試薬を使用して無料チオール37の存在を研究することも可能性があります。</li>
		<li>列にフラスコから樹脂を転送し、吸引ろ過を使用して溶媒を除去します。洗浄し、樹脂の乾燥は 5.1.3 の手順で説明するよう。</li>
		<li>ヒューム フードの谷間カクテル (TFA/ヒント/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) の約 10 mL を準備します。</li>
		<li>2 mL のポリプロピレン容器に樹脂を転送コンテナーに胸の谷間カクテル (TFA/ヒント/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) の 1 つの mL を追加して、しっかりとスクリュー キャップを使用してコンテナーのシールします。その後、1.5-2 時間の発煙のフード 60 rpm の速度で軌道シェーカーでコンテナーが振ちましょう。 注意: TFA は腐食性の高いです。防護服を着用、効率的なヒューム フードで働きます。EDT は高い悪臭物質で、効率的なドラフトで処理する必要があります。</li>
		<li>N2ガスの流れ発煙のフードの下での蒸発によって TFA カクテルを削除します。次に、30 s と分離の冷たいジエチル エーテル (1 mL) を使用した残渣を沈殿させるそれを 2 分間 12,000 × g で遠心分離を経由。遠心分離、次をエーテル コンポーネントをそっと注ぐ。2 倍の沈殿物および遠心分離の手順を繰り返します。乾燥残渣を蒸発させます。</li>
		<li>最後に、1 mL H2O/アセトニ トリル (2:1) の残余を分解し、C18 分析カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる浄化 (4.6 x 250 mm 流量 1.0 mL/分)。使用 H2O (0.1% を含む TFA) と紫外 280 nm と 220 nm 波長 (表 2) を使用して 25 分モニター HPLC スペクトル上 70% アセトニ トリルに 20% から 2%/min の線形グラデーションで溶剤として純粋なアセトニ トリル。</li>
	</ol></li>
	<li>Macrolactamization (図 4) によって分子間チオ-エン反応しことを初めて見いだしたペプチドによるチオエーテル リンカーを構築します。<ol>
<li>線形ペプチド H2N A A A mS5ベアリング アルキレン残渣を合成 (2 R ')-R'-標準 fmoc 保護基固相ペプチド合成 (SPP) を用いた樹脂 (50 mg) に記載手順 2-4。次に、洗浄し、樹脂の乾燥は 5.1.3 の手順で説明するよう。</li>
		<li>5.1.4 の手順で説明されているように脱 DMF の 2 mL を含む 10 mL 丸底フラスコに樹脂を中断します。</li>
		<li>光開始剤を追加 MMP とマップ (MMP: 1 当量、5.6 mg;地図: 1 当量、3.8 mg)、fmoc 保護-システイン-ああ (3 当量、25.7 mg) と波紋 (0.3 cm) をフラスコにバーします。適当なゴムのプラグを使用してフラスコのキャップし、フラスコ内の空気を窒素に置き換える油ポンプを使用します。</li>
		<li>反応フラスコを触媒反応管に設定しました。(図 2) 常温 UV 照射下で 1-2 時間撹拌します。</li>
		<li>LC-MS 分析での反応を監視: 胸の谷間カクテルを用いた樹脂の 2-3 mg を切断します。冷たいジエチル エーテル (300 μ L) の残留物を沈殿、遠心沈降法による、残渣を分離、5.1.11 の手順で説明されているように乾燥残留物を蒸発させます。その後、H2O/アセトニ トリル (2:1) の 100 μ L に溶解します。0.22 μ m の多孔質膜を用いたペプチド ソリューションを濾液し、LC-MS を用いたエレクトロ スプレー イオン化 (ESI) でイオン化し、肯定的なモードで作動させる化合物を分析します。</li>
		<li>5.2.2 - の手順を繰り返し、必要に応じて完了する反応できるように 5.2.4 が実行されます。</li>
		<li>写真反応が完了した後、樹脂をカラムにフラスコから転送、吸引ろ過を使用して溶媒を除去します。洗浄し、樹脂の乾燥は 5.1.3 の手順で説明するよう。</li>
		<li>ベンゾトリアゾール-1-イル-oxytripyrrolidinophosphonium ヘキサフルオロリン酸の DMF 溶液を追加 (PyBob; 2.4 当量、31.2 mg)、1-1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HoBt; 2.4 当量、8.1 mg) と NMM (4 当量、11 μ L)、macrolactamization の列のガレージに。N2 2 h のこのソリューションをバブルします。<ol>
<li>さらに、監視手順 5.2.3 LC MS を使用してこのカップリング反応。必要に応じて、繰り返し反応をように、この手順が完了するまで実施します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>手順 3 と 4 で説明したように標準 fmoc 保護基 SPP を用いたペプチドは細長い。</li>
		<li>すべてのアミノ酸残基のアセンブリ、5.1.10 と 5.1.11 の手順で説明するように樹脂からペプチドを切断し、5.1.12 の手順で説明するよう、それを浄化します。</li>
	</ol></li>
	<li>ソリューション フェーズ (図 5) でビニール硫化リンカーを生成します。<ol>
<li>2-4 の手順で説明したように標準 fmoc 保護基 SPP を使用して線形のペプチドを軸受アルキン残渣を合成します。以前研究20で説明されているように確立されたプロトコルに従ってアミノ酸を軸受アルキンを合成します。</li>
		<li>切断し、樹脂からペプチドと 5.1.11 5.1.9 - の手順で説明するように冷たいジエチル エーテルを使用してそれを沈殿させます。胸の谷間と樹脂の沈殿物、2 分 12,000 × g で遠心分離を用いたペプチドを収集します。</li>
		<li>真空の結果として得られる残渣を乾燥させます。0.5 mM の最終的な集中に達するために脱 DMF (50 mL) 100 mL の丸底フラスコの中で溶解 (樹脂、0.025 モルの読み込みに基づいて (1000 mL/L/0.5 mmol/L) = 50 mL)。<ol>
<li>:Dic DMPA (0.5 当量、3.2 mg) を追加し、ソリューションに伸びる長い針を通して N2を使用して 10 分の反応液をし、その後します。次に、0.5 - 1 時間撹拌せず室温での紫外線の下で試料を照射します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>高真空下で DMF を削除し、その有機副産物を解消するためにジエチル エーテルを追加することで原油残渣を沈殿させます。その後、2 分間 12,000 × g で遠心分離を用いた残渣を分離します。遠心分離、次をエーテル コンポーネントをそっと注ぐ。乾燥残渣を蒸発させます。最後に、H2O/アセトニ トリル (2:1) 1 mL に溶解し、手順 5.1.7 で HPLC を用いてそれを浄化します。</li>
	</ol></li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

図 3に記載されている樹脂の分子内チオ ene 環、後続反応の重要な一歩になるトリチル グループのシステイン残基の除去が見つかった。さらに、図 6Bに描かれているは、前にペプチドの分子量と次の反応と同じことが判明しました。したがって、HPLC 識別または DTNB の試金の使用は、反応を監視するために必要です。図 4に記?...

タンパク質間相互作用 (Ppi) を調節する配位子の開発は、現代の創の魅力的なアプローチを提供します。したがって、Ppi1,2,3を調節することができる効率的に勉強の新規化学療法に多大な労力を投資されています。Ppi は一般的に浅い、大きい、および/または廃止された相互作用面で構成され、小さな分子は通常 PPIs4、5の変調の不適切な配位子と見なされます。適切な露出相互作用する表面積、短いペプチッドは蛋白質の構造の特徴を模倣するこの問題6,7に対処するための理想的な候補者を表しています。しかし、短いペプチッドは通常水溶液中における構造化ではありません。これは、ペプチッド バックボーンと明確に定義された立体配座の分子内水素結合ネットワークと競合する水の分子は水8のエントロピー有利なためにです。さらに、ペプチドの本質的に低く安定性とセル透磁率特性は主として生物学的応用9,10での使用を制限します。蛋白質のデータ ・ バンク (PDB) の分析によれば > PPIs の 50% を含む短い α ヘリックスの相互作用11。したがって、らせんの安定化に関してさまざまな化学的方法が開発されています。これらは二硫化/チオエーテル結合形成12,13,14閉環メタセシス15ラクタム リング形成16など、「クリックして」化学17、添加perfluoroarenes18,19、そしてビニール硫化層20。
安定したヘリカル ペプチド p53 を含む、さまざまな細胞内対象広く活用されてエストロゲン受容体、Ras、BCL 2 ファミリーのタンパク質、その他21,22,23,24。ALRN-6924 すべて炭化水素 MDM2 および MDMX のペプチド デュアル阻害剤をホチキス止め、臨床調査25現在使用されています。過去数年間で私たちのグループは、チオール-エン ・ チオール-イン反応26,27,28を用いた新規ペプチド安定化方法の開発に集中しています。一般的に、我々 は自然豊かなシステインを使用する場合これらの写真開始反応が温和な条件下で効率的なことを実証しました。さらに、我々 はこれらの反応はバイオ - 直交、ペプチッドおよび蛋白質の修正29に適用する実証されていること、機能グループの優秀な耐性を持っているを示しています。結果チオエーテル/ビニール テザー硫化ペプチド主制約ペプチドの化学の領域を向上させる、不安定なテザーに変更センターを提供して多数のバイオ応用30 の使用のために適当であると証明、31,32。日には、限られたレポートのみをチオール-エン ・ チオール-イン ペプチド環化に関して記載されています。システインと活性アルケン間ペプチド環化の樹脂の分子内チオール-エン反応は年 Ansethらによって 2009 年に公表された研究、実証33です。2015 年に周ら。34と35以降、順次チオール イン/省エネアンバサダー カップリング反応をホチキス止めの 2 成分根本的な開始されるチオール-エン反応を説明しました。最近では、チオエーテル/ビニール テザー硫化ペプチド20,26,27に基づいた作業のシリーズについて説明しました。このプロトコルでは、それがより広い研究コミュニティに役立つことを希望に上記のチオエーテル/ビニール テザー硫化ペプチドの詳細な合成について説明します。

<table><tbody><tr><td>Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g)</td><td>HECHENG</td><td>GRM50407</td><td></td></tr><tr><td>Standard Fmoc-protected amino acids</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-2-pyrrolidinone</td><td>Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd.</td><td>3230</td><td>skin harmful</td></tr><tr><td>N,N-Dimethyl formamide</td><td>Energy</td><td>B020051</td><td>skin harmful</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Energy</td><td>W330229</td><td>skin harmful</td></tr><tr><td>N,N-Diisoproylethylamine</td><td>Aldrich</td><td>9578</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>J&amp;amp;K</td><td>101398</td><td>corrosive</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>J&amp;amp;K</td><td>973821</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>J&amp;amp;K</td><td>248897</td><td>Stench</td></tr><tr><td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate&amp;nbsp;</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td>851012</td><td></td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>Aldrich</td><td>M109062</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>flammable</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxicity</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxicity</td></tr><tr><td>2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone</td><td>Energy</td><td>A050035</td><td></td></tr><tr><td>4-methoxyacetophenone</td><td>Energy</td><td>A050098</td><td></td></tr><tr><td>2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone</td><td>Energy</td><td>D070132</td><td></td></tr><tr><td>5,5&#039;-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)</td><td>J&amp;amp;K</td><td>281281</td><td></td></tr><tr><td>Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate</td><td>Energy</td><td>E020172</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxybenzotriazole</td><td>Energy</td><td>D050256</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylmorpholine</td><td>Energy</td><td>W320038</td><td></td></tr><tr><td>High Performance Liquid Chromatography</td><td>SHIMADZU</td><td>LC-30AD</td><td></td></tr><tr><td>Electrospray Ionization Mass</td><td>SHIMADZU</td><td>LCMS-8030</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>FreeZone</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentration system</td><td>Thermo</td><td>Savant</td><td></td></tr><tr><td>vacuum manifold</td><td>promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>three-way stopcocks</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>poly-prep chromatography columns&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr></tbody></table>

constructing thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides via photo-induced thiol-ene/yne hydrothiolation

ここでは、樹脂の分子内・分子間チオール-エン hydrothiolation を用いるスルフィド テザー ペプチドの準備のための詳しいプロトコルについて述べる。さらに、このプロトコルは、私、私 + 4 の位置でアルケン/アルキン側鎖を有する amino acids やシステイン残基間のソリューションで分子内チオール-イン hydrothiolation を使用してビニール硫化テザーのペプチドの製造について説明します。標準 fmoc 保護基固相ペプチド合成法 (SPP) を用いた線形ペプチドを合成しました。チオール-エン hydrothiolation は、分子内のチオ-エン反応やペプチドの長さに応じての分子間チオ-エン反応を使用して実行されます。本研究では線形のペプチッドの完全な合成を次のシステイン残基のトリチル グループの樹脂の脱保護を使用して短いペプチドの場合分子内チオ-エン反応を行った。樹脂は紫外線重合 4 methoxyacetophenone (地図表示) と 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP) を使用して設定されます。N, N- ジメチルホルムアミド (DMF) 溶媒中で fmoc 保護-システイン-OH を溶解することにより分子のチオール-エン反応を行った。これは、樹脂のアルケン軸受残渣を用いたペプチドと反応しました。その後、macrolactamization は、樹脂の活性化試薬として 4-メチルモルホリン (NMM)、1-1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HoBt) ベンゾトリアゾール-1-イル-oxytripyrrolidinophosphonium ヘキサフルオロリン酸 (PyBop) を使用して実行されます。ペプチド合成を続けて次の macrolactamization、標準 SPP を使用しています。チオ-イン hydrothiolation の場合、線形のペプチドが樹脂から切断が乾燥、脱 DMF で解散。これが、紫外光を用いた光反応開始剤 2, 2-ジメトキシ-2-phenylacetophenone (DMPA) 照射されます。次の反応、DMF が蒸発と原油残渣の沈殿し高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を使用して浄化します。これらのメソッドは、優れた官能性良好な収率を所有しているチオ-ene/イン クリック化学の使用によるチオエーテルつないだ環状ペプチドの生成を簡素化する機能でした。チオエーテル結合のペプチドへの導入はシステイン残基の求核性を活用して、ジスルフィド結合を基準にして酸化還元不活性。

Ac YmS5AAAC NH2ペプチドとその硬くて製品 Ac - Y-(シクロ-1, 5)-[mS5AAAC] - 高速液体クロマトグラフィーと MS スペクトル樹脂の分子内チオール-エン反応を使用して生成された NH2 図に描かれています。6B. その線形の前駆体を基準にして同じ分子量を持っている環状ペプチドが発見されました。しかし、その HPLC の保持時?...

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Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

チオエーテル/ビニール硫化テザー ヘリカル ペプチドによる光誘起チオール-エン/イン Hydrothiolation を構築します。

光誘起チオール-エン ・ チオール-イン hydrothiolation を使用して硫化テザー ヘリカル ペプチドによるチオエーテル/ビニールの建設のためプロトコルを提案します。

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

constructing-thioethervinyl-sulfide-tethered-helical-peptides-via

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K ビュー.  Peking University Shenzhen Graduate School. 光誘起チオール-エン ・ チオール-イン hydrothiolation を使用して硫化テザー ヘリカル ペプチドによるチオエーテル/ビニールの建設のためプロトコルを提案します。

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A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

リバーシブルジスルフィド架橋ミセルの生産のための簡便かつ効率的なアプローチ

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

生化学

Synthesis of Programmable Main-chain Liquid-crystalline Elastomers Using a Two-stage Thiol-acrylate Reaction

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline elastomers (LCEs) with facile control over network structure and programming of an aligned monodomain. Tailored LCE networks were synthesized using routine mixing of commercially available starting materials and pouring monomer solutions into molds to cure. An initial polydomain LCE network is formed via a self-limiting thiol-acrylate Michael-addition reaction. Strain-to-failure and glass transition behavior were investigated as a function of crosslinking monomer, pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate) (PETMP). An example non-stoichiometric system of 15 mol% PETMP thiol groups and an excess of 15 mol% acrylate groups was used to demonstrate the robust nature of the material. The LCE formed an aligned and transparent monodomain when stretched, with a maximum failure strain over 600%. Stretched LCE samples were able to demonstrate both stress-driven thermal actuation when held under a constant bias stress or the shape-memory effect when stretched and unloaded. A permanently programmed monodomain was achieved via a second-stage photopolymerization reaction of the excess acrylate groups when the sample was in the stretched state. LCE samples were photo-cured and programmed at 100%, 200%, 300%, and 400% strain, with all samples demonstrating over 90% shape fixity when unloaded. The magnitude of total stress-free actuation increased from 35% to 115% with increased programming strain. Overall, the two-stage TAMAP methodology is presented as a powerful tool to prepare main-chain LCE systems and explore structure-property-performance relationships in these fascinating stimuli-sensitive materials.

A novel methodology is presented to synthesize and program main-chain liquid-crystalline elastomers using commercially available starting monomers. A wide range of thermomechanical properties was tailored by adjusting the amount of crosslinker, while the actuation performance was dependent on the amount of applied strain during programming.

二段チオールアクリレート反応を使用してプログラム可能な、主鎖液晶エラストマーの合成

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline ...

化学

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

ステップ成長PEG-ペプチドハイドロゲルからβ細胞のスフェロイドの発生と復旧

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

生物工学

Self-assembling Morphologies Obtained from Helical Polycarbodiimide Copolymers and Their Triazole Derivatives

A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous networks, ribbons, worm-like aggregates, toroidal structures, and spherical particles) is described. These aggregates are morphologically influenced by extensive hydrophobic side chain-side chain interactions of the singular polycarbodiimide strands, as inferred by atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) techniques. Polycarbodiimide-g-polystyrene copolymers (PS-PCDs) were prepared by a combination of synthetic methods, including coordination-insertion polymerization, copper(I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition (CuAAC) &#34;click&#34; chemistry, and atom transfer radical polymerization (ATRP). PS-PCDs were found to form specific toroidal architectures at low concentrations in CHCl3. To determine the influence of a more polar solvent medium (i.e., THF and THF/EtOH) on polymer aggregation behavior, a number of representative PS-PCD composites have been tested to show discrete concentration-dependent spherical particles. These fundamental studies are of practical interest to the development of experimental procedures for desirable architectures by directed self-assembly in thin film. These architectures may be exploited as drug carriers, whereas other morphological findings represent certain interest in the area of novel functional materials.

Here, we present a protocol to prepare and visualize secondary structures (e.g., fibers, toroidal architectures, and nano-spheres) derived from helical polycarbodiimides. The morphology characterized by both atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) was shown to depend on molecular structure, concentration, and the solvent of choice.

ヘリカルポリカルボジイミド共重合体およびそれらのトリアゾール誘導体から得られた自己組み立てモルフォロジー

A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and porous metal-dithiolene network in the highly ordered single crystalline state. Unlike the highly reactive free-standing thiols, which tend to decompose and complicate the crystallization of metal-thiolate open frameworks, the thioester reacts in situ to provide the thiol species, serving to mitigate the reaction between the mercaptan units and the metal centers, and to improve crystallization consequently. Specifically, the thioester was synthesized in a one-pot procedure: an aromatic bromide (hexabromotriphenylene) reacted with excess sodium thiomethoxide under vigorous conditions to first form the thioether intermediate product. The thioether was then demethylated by the excess thiomethoxide to provide the thiolate anion that was acylated to form the thioester product. The thioester was conveniently purified by standard column chromatography, and then used directly in the framework synthesis, wherein NaOH and ethylenediamine serve to revert in situ the thioester to the thiol linker for assembling the single-crystalline Pb(II)-dithiolene network. Compared with other methods for thiol synthesis (e.g., by cleaving alkyl thioether using sodium metal and liquid ammonia), the thioester synthesis here uses simple conditions and economical reagents. Moreover, the thioester product is stable and can be conveniently handled and stored. More importantly, in contrast to the generic difficulty in accessing crystalline metal-thiolate open frameworks, we demonstrate that using the thioester for in situ formation of the thiol linker greatly improves the crystallinity of the solid-state product. We intend to encourage broader research efforts on the technologically important metal-sulfur frameworks by disclosing the synthetic protocol for the thioester as well as the crystalline framework solid.

Here, we present a one-pot, transition-metal-free synthesis of thiols and thioesters from aromatic halides and sodium thiomethoxide, followed by the preparation of single crystals of a metal-dithiolene network using thiol species generated in situ from the more stable and tractable thioester.

半導体 Gyroidal 金属硫黄フレームワークの結晶化に対するチオール ビルディング ブロックの合成

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting self-assembled supramolecular structures. The synthetic route takes advantage of solid-phase peptide synthesis with the on-resin coupling of the dithiolane precursor molecule, 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl)propanoic acid, and the microwave-assisted thioacetate deprotection of the peptide N-terminus before final cleavage from the resin to yield the 1,2-dithiolane modified peptide. After the high-performance liquid chromatography (HPLC) purification of the 1,2-dithiolane peptide, derived from the nucleating core of the A&#946; peptide associated with Alzheimer&#39;s disease, the peptide is shown to self-assemble into cross-&#946; amyloid fibers. Protocols to characterize the amyloid fibers by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), circular dichroism spectroscopy (CD) and transmission electron microscopy (TEM) are presented. The methods of N-terminal modification with a 1,2-dithiolane moiety to well-characterized self-assembling peptides can now be explored as model systems to develop post-assembly modification strategies and explore dynamic covalent chemistry on supramolecular peptide nanofiber surfaces.

A protocol for the synthesis of a 1,2-dithiolane modified peptide and the characterization of the supramolecular structures resulting from the peptide self-assembly.

1, 2-ジチオランの合成とキャラクタリゼーション自己組織化ペプチド

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

情報を持つペプトイドの合成と、その配列指向動的共有自己集合

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as a consequence, they are now used clinically. It is, therefore, critical to seek effective strategies for synthesizing cyclic peptides to promote their application in the field of drug discovery. This paper reports a detailed protocol for the efficient synthesis of cyclic peptides using on-resin or intramolecular (intermolecular) bisalkylation. Using this protocol, linear peptides were synthesized by taking advantage of solid-phase peptide synthesis with cysteine (Cys) and methionine (Met) coupled simultaneously on the resin. Further, cyclic peptides were synthesized via bisalkylation between Met and Cys using a tunable tether and an on-tether sulfonium center. The whole synthetic route can be divided into three major processes: the deprotection of Cys on the resin, the coupling of the linker, and the cyclization between Cys and Met in a trifluoroacetic acid (TFA) cleavage solution. Furthermore, inspired by the reactivity of the sulfonium center, a propargyl group was attached to the Met to trigger thiol-yne addition and form a cyclic peptide. After that, the crude peptides were dried and dissolved in acetonitrile, separated, and then purified by high-performance liquid chromatography (HPLC). The molecular weight of the cyclic peptide was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and the stability of the cyclic peptide combination with the reductant was further confirmed using HPLC. In addition, the chemical shift in the cyclic peptide was analyzed by 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectra. Overall, this protocol aimed to establish an effective strategy for synthesizing cyclic peptides.

This protocol presents the synthesis of cyclic peptides via bisalkylation between cysteine and methionine and the facile thiol-yne reaction triggered by the propargyl sulfonium center.

オンテザースルホニウム中心を用いた環状ペプチドの構築

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

チオエーテル/ビニール硫化テザーヘリカルペプチドによる光誘起チオール-エン/イン Hydrothiolation を構築します。

要約

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リバーシブルジスルフィド架橋ミセルの生産のための簡便かつ効率的なアプローチ

二段チオールアクリレート反応を使用してプログラム可能な、主鎖液晶エラストマーの合成

ステップ成長PEG-ペプチドハイドロゲルからβ細胞のスフェロイドの発生と復旧

ヘリカルポリカルボジイミド共重合体およびそれらのトリアゾール誘導体から得られた自己組み立てモルフォロジー

半導体 Gyroidal 金属硫黄フレームワークの結晶化に対するチオールビルディングブロックの合成

1, 2-ジチオランの合成とキャラクタリゼーション自己組織化ペプチド

合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates

情報を持つペプトイドの合成と、その配列指向動的共有自己集合

オンテザースルホニウム中心を用いた環状ペプチドの構築

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

チオエーテル/ビニール硫化テザー ヘリカル ペプチドによる光誘起チオール-エン/イン Hydrothiolation を構築します。

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半導体 Gyroidal 金属硫黄フレームワークの結晶化に対するチオール ビルディング ブロックの合成

1, 2-ジチオランの合成とキャラクタリゼーション自己組織化ペプチド

合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates

情報を持つペプトイドの合成と、その配列指向動的共有自己集合

オンテザースルホニウム中心を用いた環状ペプチドの構築

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

チオエーテル/ビニール硫化テザーヘリカルペプチドによる光誘起チオール-エン/イン Hydrothiolation を構築します。

半導体 Gyroidal 金属硫黄フレームワークの結晶化に対するチオールビルディングブロックの合成