FG è supportato da Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fondazione Cariplo (Grant 2014-0655) e Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB). IZ è supportato da NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton trovato, CCFA Senior Research Awards (412708), il Eleanor e il Miles Shore 50 ° anniversario Fellowship Program e la Fondazione Cariplo ( 2014-0859).

Tutte le procedure sono state approvate sotto l'istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) e operate sotto la supervisione del dipartimento di risorse animali ai bambini dell'ospedale (arco) al Children Hospital di Boston o sono stati approvati dall'italiano Ministero della salute e realizzata sotto il Comitato istituzionale di Animal Care presso l'Università di Milano-Bicocca.
1. preparazione di albicans del c.
<ol><li>Cultura C. albicans, ceppo CAF3-113, in provette contenenti medium ricco (lievito estratto peptone destrosio (YEPD), Estratto di lievito 1% (p/v), 2% (p/v) di Bacto Peptone, 2% (p/v) di glucosio) completate con uridina (50 mg/L) a 25 ° C. In queste condizioni, albicans del c. si sviluppa come un lievito. Nota: Altri ceppi di c. albicans possono essere utilizzati, come la clinica isolare c. albicans SC5314 ceppo13. Dal momento che recentemente abbiamo dimostrato che il processo ulceroso è indotta dall'attivazione del sistema immunitario innato14, teoricamente ogni ceppo di c. albicans che mantiene le sue componenti della parete cellulare e la struttura, così come il capacità di produrre proiezioni ifale, potrebbe essere utilizzato.</li>
	<li>Monitorare la cultura contando la concentrazione cellulare utilizzando un analizzatore di contatore delle cellule.</li>
	<li>Raccogliere la cultura quando raggiunge una concentrazione di circa 8 x 106 cellule/mL. In alternativa, è possibile utilizzare uno spettrofotometro per misurare il OD600. Nota: Di solito, un valore di OD600 = 1 corrisponde ad una concentrazione di lievito di 3 x 107 cellule/mL, ma si raccomanda una titolazione.</li>
	<li>Risospendere la cultura nel mezzo YEPD-uridina, utilizzando HEPES (50 mM, pH 7.5) come agente tampone e incubare la coltura a 37 ° C per indurre la formazione di ife. Verifica ifale formazione sotto un microscopio a 100 ingrandimenti. Formazione ifale è visibile 5 h dopo la coltura a 37 ° C; Tuttavia, utilizzare le celle 16 h dopo incubazione a 37 ° C quando la percentuale ifale raggiunge quasi il 95% della coltura totale.</li>
	<li>Per arricchire ulteriormente la preparazione in concentrazione ifale, centrifuga aliquote della cultura a 3.300 x g per 5 min. eliminare il supernatante e risospendere il pellet in PBS sterile ad una concentrazione di 1 x 108 IFE/mL.</li>
</ol>2. cutanea profonda iniezione
<ol><li>24 h prima della procedura di infezione, anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e poi radere il fianco dei topi utilizzare un tagliacapelli elettrico. Nota: Dopo qualsiasi procedura che coinvolge l'anestesia, posizionare i topi sotto una lampada di riscaldamento fino a quando non hanno recuperato in modo efficiente.</li>
	<li>Riposare i topi per 24 h evitare qualsiasi infiammazione dovuto il processo di rasatura.</li>
	<li>24 h dopo la procedura di rasatura, anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).</li>
	<li>Controllare il riflesso di zampa per garantire che i topi sono anestetizzati. Valutare il riflesso di zampa pinzando saldamente la zampa. Se l'anestesia è raggiunto, l'animale non sente dolore e non si muove.</li>
	<li>Iniettare albicans del c. IFE nel derma profondo utilizzando una siringa da insulina 0,3 mL con un ago di 30 x 8 mm in un volume finale di 50 µ l/iniezione, corrispondente a 5 x 106 IFE/iniezione.<ol>
<li>Tendere la pelle del fianco rasato utilizzando due dita al fine di iniettare il volume direttamente nel derma profondo. Inserire l'ago con un angolo di 10-15° con la smussatura dell'ago rivolto verso l'alto.</li>
		<li>Con questa angolazione, l'agente patogeno sarà iniettato con una profondità di circa 300-500 µm. Per garantire che l'iniezione è ben eseguita, verificare che la forma volume iniettato un bump che è assorbita qualche min dopo l'iniezione. Nota: L'urto formata dopo l'iniezione sarà di circa 1 cm2. Questa è l'area che verrà rimosso al punto di tempo designato per l'analisi molecolare o istologica.</li>
		<li>Per intervalli di tempo di meno di 24 h (consigliato) è possibile delimitare la zona di infezione con un pennarello, poiché l'urto formata con l'iniezione persiste per alcuni minuti, dopo di che viene assorbito. Per intervalli di tempo di 24 ore o più, questo passaggio non è necessario, perché o un'ulcera o una ciste sarà chiaramente visibile.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. raccolta e preparazione per colorazione istologica del campione
<ol><li>Eutanasia i topi secondo procedure istituzionali.</li>
	<li>Utilizzando pinze chirurgiche, tirare la pelle al confine del sito iniettato, precedentemente contrassegnato con il pennarello. Utilizzando le forbici chirurgiche, accise sul sito infetto dal taglio di pelle che segue la linea tracciata. Nota: Fare attenzione a separare la pelle dal peritoneum usando le forbici punta rotonda.</li>
	<li>Immergere la pelle in uno stampo di base USA e getta riempito con temperatura di taglio ottimale (OCT) composto, con il lato interno della pelle rivolto verso l'alto. Congelare il campione in azoto liquido fino a quando il composto diventa bianco. Non lasciate che l'azoto liquido coprire il campione prima di esso è completamente congelato come questo danneggerebbe il campione. Nota: attenzione! Durante la fase 3.3, indossare una maschera facciale per la protezione da azoto liquido.</li>
	<li>Se gli esempi non vengono utilizzati immediatamente per la preparazione del vetrino, memorizzarle rapidamente a-80 ° C. Nota: Campioni possono essere conservati a-80 ° C a tempo indeterminato.</li>
</ol>4. preparazione dei vetrini
<ol><li>Tagliare il campione a metà per preparare le fettine per istologia a partire dal centro del campione.</li>
	<li>Tagliare fette spesse 5-µm con un criostato. Nota: Per campioni di pelle, la temperatura del criostato deve non essere supera a-25 ° C. Un' più alta temperatura causerebbe una fusione parziale di H-personalizzazione e pertanto i campioni sarebbero non essere mantenuti nella giusta posizione durante la procedura di taglio.</li>
	<li>Utilizzare vetrini caricati positivamente per raccogliere le fette.</li>
	<li>Se le fette raccolte non vengono utilizzate subito dopo la preparazione, li conservare a-20 ° C. A questo punto, fette possono essere memorizzati a-20 ° C a tempo indeterminato.</li>
</ol>5. ematossilina ed eosina
<ol><li>Macchia le diapositive mediante immersione in ematossilina di Gill per 4 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min.</li>
	<li>Macchia che le diapositive mediante immersione in soluzione di eosina Y per 1 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min, sciacquare le diapositive utilizzando acqua distillata prima di continuare il protocollo.</li>
	<li>Disidratare mediante immersione in aumento in serie delle concentrazioni delle soluzioni di etanolo (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Immergere i vetrini per 15 s in ogni soluzione di etanolo.</li>
	<li>Cancellare le diapositive per almeno 2 min per immersione in un agente di compensazione istologico.</li>
	<li>Montare le diapositive utilizzando il mezzo di montaggio e vetrini coprioggetto.</li>
	<li>Acquisire immagini delle diapositive con scanner per diapositive un microscopio a un ingrandimento 40x.</li>
</ol>6. acido periodico di Schiff (PAS) colorazione
<ol><li>Difficoltà le diapositive con ≥ 99.5% acetone a temperatura ambiente per 1 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 1 min.</li>
	<li>Macchia le diapositive mediante immersione in soluzione di acido periodico (1 g/dL) per 5 min, lavare i vetrini in 3 cambi di acqua distillata.</li>
	<li>Macchia le diapositive per immersione nel reattivo di Schiff per 15 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min.</li>
	<li>Colorare i vetrini mediante immersione in ematossilina di Gill per 5 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 30 s.</li>
	<li>Disidratare i vetrini mediante immersione in 3 cambi di etanolo al 100%. Immergere i vetrini per 15 s ogni volta.</li>
	<li>Cancellare le diapositive per almeno 2 min per immersione in un agente di compensazione istologico.</li>
	<li>Montare le diapositive utilizzando il mezzo di montaggio e vetrini coprioggetto.</li>
	<li>Acquisire immagini delle diapositive con scanner per diapositive un microscopio.</li>
</ol>7. raccolta e preparazione per estrazione del RNA del campione
<ol><li>Eutanasia i topi secondo procedure istituzionali. Rimuovere i campioni di pelle come descritto al punto 3.2.</li>
	<li>Immergere i campioni in una provetta da 2 mL-salvapercussore con 1 mL di reagente per l'estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinium acido. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e i campioni possono essere conservati a-80 ° C.</li>
	<li>Tagliare il campione in pezzi di circa 0,2 cm2 utilizzando pinze chirurgiche. Nota: attenzione! La maggior parte dei reagenti per isolamento del RNA sono tossiche e mutagene. Punti 7.3 e 7.4 deve essere fatto sotto una cappa aspirante.</li>
	<li>Smash il campione con un laminatoio del branello ad una velocità di 20 oscillazioni/s per 20 min. in alternativa, un vasaio meccanico possa essere utilizzato.</li>
	<li>Controllare l'effettiva omogeneizzazione dei campioni cercando la presenza di parti intatte della pelle. Ripetere questo passaggio se i campioni non sono completamente omogeneizzati.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 16.000 x g per 1 min. tenere i surnatanti estrazione del RNA e scartare il pellet. Questo passaggio viene eseguito per eliminare peli e detriti che potrebbero bloccare le colonne di estrazione.</li>
	<li>Procedere con l'estrazione di RNA mediante RNA purificazione colonne14.</li>
	<li>Utilizzare uno spettrofotometro per valutare la concentrazione e purificazione di RNA. Se RNA estratti non vengono utilizzati immediatamente per la preparazione di cDNA, conservare i campioni a-80 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Belkaid, Y., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dialogue+between+skin+microbiota+and+immunity.">Dialogue between skin microbiota and immunity.</a> Science. 346 (6212), 954-959 (2014).</li><li>Kashem, S. W., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+Immunity+to+Candida+albicans.">Skin Immunity to Candida albicans.</a> Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).</li><li>Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+trends+in+skin+mycoses+worldwide.">Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.</a> Mycoses. 51, 2-15 (2008).</li><li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+Bloodstream+Infections+in+US+Hospitals:+Analysis+of+24,179+Cases+from+a+Prospective+Nationwide+Surveillance+Study.">Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study.</a> Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).</li><li>Romani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+fungal+infections.">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Candida+infections.">Pathogenesis of Candida infections.</a> J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).</li><li>MacCallum, D. M., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+events+in+the+intravenous+challenge+model+for+experimental+Candida+albicans+infections+in+female+mice.">Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice.</a> Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).</li><li>Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -. Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+external+traumatic+wound+infections.">Animal models of external traumatic wound infections.</a> Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).</li><li>Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD86+(B7-2),+but+not+CD80+(B7-1),+expression+in+the+epidermis+of+transgenic+mice+enhances+the+immunogenicity+of+primary+cutaneous+Candida+albicans+infections.">CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).</li><li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination.">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li><li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response.">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li><li>Leoni, G., Neumann, P. -. A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+role+of+immune-epithelial+interactions.">Wound repair: role of immune-epithelial interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).</li><li>Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans.">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li><li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems.">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li><li>Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Skin+Abscess+in+a+Heart+Transplant+Recipient.">Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient.</a> Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).</li><li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+danger+theory:+20+years+later.">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287 (2012).</li><li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+play+in+four+acts:+Staphylococcus+aureus+abscess+formation.">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui abbiamo descritto un metodo di c. albicans infezione per studiare il processo infiammatorio che è iniziato al fungina ingresso nel derma profondo.
Anche se la formazione di ascesso della pelle è un evento relativamente raro su c. albicans infezione15, iniezione del fungo direttamente nel derma profondo permette non solo lo studio della formazione di ascesso fungoso-driven, ma anche l'analisi di specifici immune cellule che partecipano per contene...

Il corpo umano è ricoperto da un numero estremamente elevato di microrganismi. La superficie della pelle è l'habitat di quasi 1 milione di batteri per centimetro quadrato1. Questo numero, tuttavia, non riflette la varietà di microrganismi che colonizza la pelle. Oltre ai batteri, il corpo umano è colonizzato da numerose specie fungine, tra cui c. albicans, che è in grado di sopravvivere sia presso le mucose e la pelle livello2.
Negli ultimi anni, la percentuale di persone con diagnosticata di infezioni fungine è enormemente aumentato. Ciò è dovuto principalmente al maggior numero di persone immunocompromised, cioè, pazienti HIV-positivi e pazienti che sono passati attraverso la chemioterapia o farmaci immunosoppressori dopo trapianto3. In uno studio di sorveglianza effettuato negli Stati Uniti, Wisplinghoff et al hanno mostrato che il 9,5% delle infezioni nosocomiali flusso sanguigno erano causati da Candida specie4. Dovuto il caso aumentato di infezioni fungine e soprattutto per l'elevata percentuale di specie di Candida trovate durante infezioni del torrente sanguigno, capire come questo agente patogeno sfugge al controllo del sistema immunitario è estremamente importante.
C. albicans è un fungo dimorphic che cresce in diverse forme morfologiche come lievito, blastospores, pseudoife ed ife a seconda le condizioni ambientali5. Nella sua forma ifale, albicans del c. dimostra la sua capacità di invasività più alto e ha la capacità di penetrare l' epitelio6.
Infezioni da c. albicans sono stati studiati utilizzando diversi approcci sperimentali. Il modello più comune di infezione è l'iniezione endovenosa di c. albicans lievito7. Tuttavia, questo modello non prendere in considerazione tutti i processi che accadono prima il fungo riesce a diffondersi nel flusso sanguigno. Un altro modello sfrutta la capacità dei albicans del c. di invadere l'epitelio. Questo metodo, noto anche come la carta vetrata modello8, è stato sviluppato da Gaspari, et al. , 1998,9e consiste nell'usare la carta vetrata per abradere la pelle, eliminando così lo strato corneo prima di applicare i albicans del c.. Questa procedura permette al fungo di penetrare l'epitelio, consentendo così l'analisi delle capacità invasiva di questo agente patogeno. Infine, altri modelli di infezioni per la gastrointestinale10 e respiratorie11 sono stati utilizzati in diversi studi.
La formazione di una ferita (come nel modello di carta vetrata) provoca l'attivazione di parecchie vie, compreso il reclutamento delle cellule immuni e attivazione, al fine di promuovere la guarigione di processo12. Questo può alterare o mascherare la risposta immunitaria in particolare contro l'agente patogeno, così conducendo alla confusione risultati.
Qui descriviamo un metodo di infezione della pelle che evita la formazione di ferita iniziale e l'induzione di un ambiente infiammatorio basale. Per mantenere la struttura epiteliale intatta, iniettiamo direttamente albicans del c. nella sua forma ifale nel derma profondo. Anche se una singola iniezione può suscitare lieve infiammazione, la quantità di infiammazione è limitata e limitata rispetto alla formazione di una ferita aperta come nel modello di carta vetrata. L'approccio che descriviamo qui permette lo studio della risposta immunitaria all'infezione fungina e diffusione, evitando l'ambiente infiammatoria eccessiva e preesistente causata da danni meccanici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4053L</td>
			<td>warm in 37 &#176;C bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-OCT compound</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>R0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s Hematoxilyn</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>09-178-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>09-209-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>scharlau</td>
			<td>ET00232500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citro-HISTOCLEAR</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>R0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt, mounting medium</td>
			<td>bio-optica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining system</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology</td>
			<td>Applichem PanReac</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Applichem PanReac</td>
			<td>A1070,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes 2 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30121597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Wear eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter-Particle Count</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5415 R</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC 3000 Microtome Cryostat</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLiser</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base mould disposable</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged bio microscope slides</td>
			<td>bio-optica</td>
			<td>09-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips 24 x 50 mm</td>
			<td>thermo scientific</td>
			<td>11911998</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep dermal injection as a model of candida albicans skin infection for histological analyses

La pelle è un organo estremamente esteso del corpo e, a causa di questa grande superficie, è continuamente esposto a microrganismi. Danni alla pelle possono portare facilmente a infezioni nel derma che può, a sua volta, provoca la diffusione di agenti patogeni nel sangue. Comprendere come il sistema immunitario combatte le infezioni allo stadio molto precoce e come l'host può eliminare gli agenti patogeni è un passo importante per impostare la base per futuri interventi terapeutici. Qui descriviamo un modello di infezione dei albicans del Candida che può visualizzare i processi che si verificano precocemente durante un'infezione, anche quando l'agente patogeno ha superato la barriera epiteliale, come pure la risposta immunitaria da albicans del c. invasione. Abbiamo usato questo modello di infezione per eseguire analisi istologiche che mostrano le cellule immunitarie che infiltrano la pelle così come la presenza e la localizzazione dell'agente patogeno. I campioni raccolti dopo l'infezione possa essere elaborato per l'estrazione di RNA.

Attraverso l'iniezione dell'agente patogeno direttamente nel derma profondo, la morfologia strutturale del tessuto rimane intatto (Figura 1A).
Il mantenimento dell'integrità strutturale della pelle permette la rilevazione delle cellule immuni e loro localizzazione presso il sito di infezione. Il maggiore ingrandimento mostrato in Figura 1B rivela che l'ascesso si compo...

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Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Profondo cutaneo iniezione come un modello di infezione della pelle Candida albicans per analisi istologiche

Qui descriviamo un protocollo che permette l'analisi istologica e molecolare dei campioni della pelle dopo iniezione intradermica di Candida albicans . Questo protocollo mantiene l'integrità strutturale della pelle e permette per la localizzazione di cellule del sistema immunitario del tessuto-residente o recentemente reclutate come pure la distribuzione di agente patogeno.

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

deep-dermal-injection-as-model-candida-albicans-skin-infection-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

10.6K Views.  University of Milano-Bicocca. Qui descriviamo un protocollo che permette l'analisi istologica e molecolare dei campioni della pelle dopo iniezione intradermica di Candida albicans . Questo protocollo mantiene l'integrità strutturale della pelle e permette per la localizzazione di cellule del sistema immunitario del tessuto-residente o recentemente reclutate come pure la distribuzione di agente patogeno.

Video: Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Uso di<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come organismo modello per studiare<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infezione

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Studiare comunità microbiche<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nei Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of experimental models needs to be as rigorous as that applied for human samples. Indeed, drawing reliable and accurate conclusions is critically influenced by the quality of tissue section preparation. Here, we describe a protocol for histopathological analysis of murine tissues that implements several automated steps during the procedure, from the initial preparation to the paraffin embedding of the murine samples. The reduction of methodological variables through rigorous protocol standardization from automated procedures contributes to increased overall reliability of murine pathological analysis. Specifically, this protocol describes the utilization of automated processing and embedding robotic systems, routinely used for the tissue processing and paraffin embedding of human samples, to process murine specimens of intestinal inflammation. We conclude that the reliability of histopathological examination of murine tissues is significantly increased upon introduction of standardized and automated techniques.

Lack of standardization for murine tissue processing reduces the quality of murine histopathological analysis as compared to human specimens. Here, we present a protocol to perform histopathological examination of murine inflamed and uninflamed colonic tissues to show the feasibility of robotic systems routinely used for processing and embedding&#160;human samples.

Utilizzo di sistemi robotici per elaborare e incorporare colici murini campioni per le analisi istologiche

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

Quotidiano fototerapia con luce rossa per sviluppo di Biofilm di regolare dei albicans del Candida

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualizzazione degli albicani Candida nel tratto gastrointestinale Murine utilizzando l'ibridazione fluorescente in Situ

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

Chiarire e imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

Un saggio ex vivo per studiare Candida albicans Morphogenesi ifale nel tratto gastrointestinale

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, mouth, vagina, and skin. Despite the availability of antifungal medication, the mortality rate of invasive candidiasis remains ~50%. Unfortunately, the incidence of drug-resistant C. albicans is increasing globally. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) may offer an alternative or adjuvant treatment to inhibit C. albicans biofilm formation and overcome drug resistance. Rose bengal (RB)-mediated aPDT has shown effective cell killing of bacteria and C. albicans. In this study, the efficacy of RB-aPDT on multidrug-resistant C. albicans is described. A homemade green light-emitting diode (LED) light source is designed to align with the center of a well of a 96-well plate. The yeasts were incubated in the wells with different concentrations of RB and illuminated with varying fluences of green light. The killing effects were analyzed by the plate dilution method. With an optimal combination of light and RB, 3-log growth inhibition was achieved. It was concluded that RB-aPDT might potentially inhibit drug-resistant C. albicans.

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

The growing incidence of drug-resistant Candida albicans is a serious health issue worldwide. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) may offer a strategy to fight against drug-resistant fungal infections. The present protocol describes Rose bengal-mediated aPDT efficacy on a multidrug-resistant C. albicans strain in vitro.

Terapia fotodinamica mediata dal Bengala Rosa per inibire la Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...