Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01-NS084941) e la Commissione di ricerca biomedica Arizona (ADHS16-162406) ptr. WA ha ricevuto in passato, il sostegno da un appuntamento pre-dottorato per un istituti nazionali di salute formazione Grant (T32-HL007249).

Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate da un istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) e si conformano al National Institutes of Health (NIH) e Animal Research: Reporting In Vivo esperimenti (arrivo) linee guida. Nella Figura 1è illustrato il flusso procedura per il protocollo.
1. set-up per la procedura
<ol><li>Preparare il tampone del microvessel di cervello (BMB). Avviare pesando 54,66 g D-mannitolo, 1,90 g EGTA e 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (cioè, Tris) base in un bicchiere pulito. Aggiungere 1,0 L di acqua deionizzata. Miscelare i componenti del buffer BMB utilizzando un agitatore magnetico. Una volta che la soluzione è stata mescolata accuratamente, regolare il pH a 7.4 utilizzo 1,0 M HCl.</li>
	<li>Preparare la soluzione di destrano (75.000 MW) di 26% (w/v) prima anestetizzare gli animali. Preparare la soluzione di destrano come descritto nei passaggi seguenti. Nota: È criticamente importante preparare questa soluzione prima del tempo perché destrano può prendere circa 1,5-2 h da sciogliere in tampone acquoso.<ol>
<li>Pesare il destrano in polvere (26 g / 100 mL di tampone) in un becher pulito.</li>
		<li>Misurare il volume appropriato di BMB e versare in un becher separato, pulito.</li>
		<li>Versare lentamente BMB nel becher contenente destrano in polvere. Mescolare manualmente il destrano in polvere durante il versamento di BMB utilizzando un bastoncino per mescolare vetro.</li>
		<li>Regolare il pH a 7.4 con 1,0 M HCl immediatamente prima di utilizzare. Nota: Un isolamento tipico di microvasi cerebrali da 12 ratti Sprague-Dawley individuali (maschio o femmina; 3 mesi di età; 200-250 g ciascuna) richiede 200 mL di soluzione del dextrano (cioè, del dextrano 52 g in 200 mL di BMB).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. estrazione del tessuto di cervello dai ratti Sprague-Dawley
<ol><li>Dopo il trattamento sperimentale desiderato, anestetizzare ratti Sprague-Dawley utilizzando ketamina (50 mg/kg; 2,5 mL/kg i.p.) e xilazina (10 mg/mL; 2,5 mL/kg I, p.). Diluire la ketamina e xilazina in soluzione fisiologica 0,9% a concentrazioni finali di 20 mg/mL e 4,0 mg/mL rispettivamente. Eutanasia animali per decapitazione usando una ghigliottina affilata conformemente agli orientamenti IACUC. Utilizzare la stessa procedura per ratti Sprague-Dawley maschi e femminili.</li>
	<li>Resecare la pelle dal cranio del ratto facendo un singolo taglio trasversa utilizzando forbici chirurgiche.</li>
	<li>Utilizzando Pinze ossivore, attentamente rimuovere la piastra di cranio ed esporre il cervello.</li>
	<li>Rimuovere il cervello con una spatola. Staccare il cervello e inserire il tessuto cerebrale isolato in una provetta conica da 50 mL contenente 5 mL di BMB. Aggiungere 1,0 µ l di inibitore della proteasi cocktail / 1,0 mL di tampone BMB immediatamente prima dell'uso.</li>
</ol>3. brain Processing
<ol><li>Trasferire il tessuto cerebrale dalla provetta conica da 50 mL per una piastra Petri pulita.</li>
	<li>Usando il forcipe, rotolare delicatamente il cervello su carta da filtro diametro 12,5 cm per rimuovere esterne meningi, che sono liberamente aderite alla corteccia cerebrale. Premere il tessuto cerebrale contro la carta da filtro delicatamente e tirare il tessuto ancora. Girare la carta filtro frequentemente durante questo passaggio.</li>
	<li>Separare il plesso coroideo dagli emisferi cerebrali usando il forcipe. Nota: Il plesso coroideo appare come un tessuto chiaro membranoso localizzato sulla superficie dei ventricoli cerebrali.</li>
	<li>Delicatamente appiattire il tessuto cerebrale e rimuovete le meningi e bulbi olfattivi usando il forcipe rimanenti.</li>
	<li>Posizionare il tessuto cerebrale corticale in un mortaio di vetro ghiacciato. Aggiungere 5,0 mL di cocktail contenenti inibitore della proteasi BMB nel mortaio.</li>
	<li>Utilizzando un omogeneizzatore di cavi elettrici, omogeneizzare il tessuto cerebrale usando 15 pinneggiata a 3.700 giri/min. Eseguire omogeneizzazione utilizzando una smerigliatrice di tessuto 10ml mortaio e pestello. Tra omogeneizzazione di ogni singolo campione, pulire il pestello con etanolo al 70%. Nota: Omogeneizzazione colpi devono essere coerenti in termini di ritmo e grandezza.</li>
	<li>Versate l'omogeneizzato in provette da centrifuga con etichetta.</li>
</ol>4. centrifugazione passaggi
<ol><li>Aggiungere 8,0 mL di soluzione del dextrano 26% per ogni provetta da centrifuga con etichetta contenente omogeneato del cervello.</li>
	<li>Capovolgere la provetta due volte e poi accuratamente Vortexare il campione. Condurre il Vortex di ciascun campione con angolazioni multiple per garantire un'accurata miscelazione della soluzione omogeneato del cervello con soluzione del dextrano del 26%.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 5.000 x g per 15 min a 4 ° C. Nota: Per alcune analisi, è utile confrontare il cervello dei microvasi con parenchima cerebrale. Dovrebbe essere la valutazione dell'espressione proteica in parenchima cerebrale richiesto, il surnatante da questo passo di centrifugazione (cioè, frazione parenchimatica del cervello) possa essere raccolti e conservato a-80 ° C per un uso futuro.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante utilizzando un aspiratore e pipetta Pasteur in vetro. Nota: Attenzione deve essere presa per non disturbare il pellet. In caso contrario, sarà ridotto quantitativo dei microvasi cerebrali raccolti, che diminuirà notevolmente il rendimento di proteina da questa procedura.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 5,0 mL di BMB contenente l'inibitore della proteasi cocktail (cioè, 1,0 μL inibitore della proteasi cocktail per 1,0 mL di buffer di BMB). Vortice il pellet per garantire la completa miscelazione.</li>
	<li>Aggiungere mL 8,0 del dextrano del 26% a ogni provetta da centrifuga e vortice come descritto ai punti 4.1-4.2 del presente protocollo.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 5.000 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Utilizzando un termos e pipetta di vetro, aspirare il surnatante e garantire quel pellet contenente del microvessel cervello non viene interrotto. Nota: Materiale di eccesso che abbia aderito alla parete del tubo non contiene dei microvasi e dovrebbe essere accuratamente puliti e rimosso.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 4,5 a 4,8 un ulteriore due volte.</li>
	<li>Una volta 4 fasi di centrifugazione di destrano sono state completate, aggiungere 5,0 mL di BMB ogni pellet e vortexare per risospendere il campione. Nota: Dopo il completamento del passaggio 4.10, microvasi interi possono essere raccolti per l'analisi di localizzazione della proteina. Questo può essere realizzato prendendo un 50 μL aliquota del precipitato risospeso microvessel e sbavature su un vetrino per microscopio. Microvasi sono quindi calore-fisso a 95 ° C per 10 minuti in un blocco di riscaldamento seguito da fissazione in etanolo ghiacciata per un ulteriore 10 min diapositive possono quindi essere archiviati a 4 ° C fino a quando richiesto per gli studi di imaging.</li>
</ol>5. ultracentrifugazione per preparare campioni di membrane microvascolare cerebrale totale
<ol><li>Trasferire campioni l'omogeneizzatore bicchiere precedentemente raffreddato.</li>
	<li>Utilizzando un omogeneizzatore di cavi elettrici, omogeneizzare il tessuto cerebrale usando 8-10 su e giù colpi a 3.000 giri/min. Omogeneizzazione è condotto utilizzando una smerigliatrice di tessuto 10ml mortaio e pestello. Pulire il pestello con etanolo al 70% dopo omogeneizzazione di ogni singolo campione.</li>
	<li>Trasferire i campioni per pulire i tubi ultracentrifuga. Numero e pesare ogni singolo tubo. Equilibrio e accoppiare i tubi prima di caricarli nel rotore ultracentrifuga. Nota: Tutti i peso e accoppiamento di tubi ultracentrifuga devono svolgersi con i tappi su per garantire misure accurate di pesi del tubo.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 150.000 x g per 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Usando un termos e vetro pipetta Pasteur, aspirare il surnatante facendo attenzione di non disturbare il pellet di membrana capillare.</li>
	<li>In base alle dimensioni della pallina, aggiungere un volume adeguato di buffer di memoria, che è composto di acqua deionizzata e BMB in un rapporto di 1:1 (v/v). In genere, i pellet sono risospese in 400-500 μL di tampone di deposito. Aggiungere cocktail inibitore della proteasi per il buffer di memoria in un rapporto di 1,0 µ l per 1,0 mL di buffer di memoria.</li>
	<li>Campioni di vortice per risospendere il pellet in buffer di archiviazione.</li>
	<li>Utilizzando un pipetta Pasteur di vetro, trasferire campioni di membrana capillare in una microcentrifuga da 1,5 mL con etichetta.</li>
	<li>Esempio di passaggio attraverso un ago siringa 5 x affinché il campione è mescolato completamente e che non aggregati cellulari esistono.</li>
	<li>Conservare i campioni a-80 ° C fino a quando non necessari per l'analisi. Nota: Il contenuto proteico di ogni campione di membrana del microvessel è misurata utilizzando il metodo di Bradford.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).</li><li>Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Transporters+in+Central+Nervous+System+Drug+Delivery+and+Blood-Brain+Barrier+Protection:+Relevance+to+Treatment+of+Stroke.">Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke.</a> J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).</li><li>Ronaldson, P. T., Davis, T. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+signaling+alters+substrate+permeability+and+tight+junction+protein+expression+at+the+blood-brain+barrier+during+inflammatory+pain.">Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).</li><li>Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+inflammatory+hyperalgesia+modulates+morphine+delivery+to+the+brain:+a+role+for+P-glycoprotein.">Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein.</a> J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).</li><li>Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+pain+signals+an+increase+in+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier.">Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier.</a> J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).</li><li>Pop, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+brain+injury+alters+the+blood-brain+barrier+phenotype+in+parallel+with+beta-amyloid+and+cognitive+changes+in+adulthood.">Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).</li><li>Thompson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+stress+signals+an+increase+in+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+(Oatp1a4)+at+the+blood-brain+barrier:+relevance+to+CNS+drug+delivery.">Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).</li><li>Tome, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-glycoprotein+traffics+from+the+nucleus+to+the+plasma+membrane+in+rat+brain+endothelium+during+inflammatory+pain.">P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).</li><li>Slosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetaminophen+modulates+P-glycoprotein+functional+expression+at+the+blood-brain+barrier+by+a+constitutive+androstane+receptor-dependent+mechanism.">Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism.</a> Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).</li><li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/planar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells.">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+exposure+to+ethanol+downregulates+tight+junction+proteins+through+the+protein+kinase+Calpha+signaling+pathway+in+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells.">Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells.</a> Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).</li><li>Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-9+increases+the+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier+via+the+activin+receptor-like+kinase-1+receptor.">Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).</li><li>Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. 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M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).</li><li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions+contain+oligomeric+protein+assembly+critical+for+maintaining+blood-brain+barrier+integrity+in+vivo.">Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo.</a> J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).</li><li>Brzica, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+and+kidney+expression+of+sulfate+anion+transporter+sat-1+in+rats+exhibits+male-dominant+gender+differences.">The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).</li><li>Ronaldson, P. T., Bendayan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+viral+envelope+glycoprotein+gp120+produces+oxidative+stress+and+regulates+the+functional+expression+of+multidrug+resistance+protein-1+(Mrp1)+in+glial+cells.">HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells.</a> J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).</li><li>Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+C-type+lectins-mediated+host-pathogen+interactions+with+dextran.">Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran.</a> J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).</li><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Expression+of+P-glycoprotein+and+Organic+Anion+Transporting+Polypeptides+at+the+Blood-Brain+Barrier:+Understanding+Transport+Mechanisms+for+Improved+CNS+Drug+Delivery?.">Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?.</a> AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo articolo, viene descritto un metodo semplice ed efficace di preparazione dei campioni di proteine di membrana da microvasi appena isolati dal tessuto di cervello di ratto. Diversi approcci per isolamento di microvasi cerebrali di ratto e/o generazione di preparazioni della membrana da microvasculature isolato sono stati segnalati in letteratura13,20,21,22 , <sup class="xref...

Emato - encefalica (BBB) esiste a livello di interfaccia tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la circolazione sistemica e svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dell'omeostasi del cervello. In particolare, le funzioni BBB al proprio controllo soluto le concentrazioni nel liquido extracellulare del cervello e di fornire in modo efficiente quei nutrienti necessari per soddisfare le richieste metaboliche considerevole del CNS1dal tessuto cerebrale. Questi ruoli implicano che la BBB, che esiste principalmente a livello della cellula endoteliale microvascolare, deve possedere meccanismi discreti che permettono alcune sostanze per accedere il parenchima cerebrale, garantendo nel contempo che xenobiotici potenzialmente dannosi non può si accumulano. Infatti, cellule endoteliali microvascolari del cervello non sono fenestrate e pinocitosi limitato, che assicura una mancanza di permeabilità non selettivo2per mostre. Inoltre, le cellule endoteliali del microvessel di cervello esprimono proteine di giunzione junction e adherens strette che agiscono per formare un fisico "sigillo" tra cellule endoteliali adiacenti e limitare notevolmente paracellulare diffusione di sostanze ematica nel cervello parenchima. Infatti, la permeabilità selettiva di sostanze endogene ed esogene richiede espressione funzionale di assorbimento e efflusso trasportatori3. Nel complessive, strette giunzioni, giunzioni intermedie e trasportatori funzionano di concerto per mantenere le proprietà di barriera unico della BBB.
La BBB è una barriera dinamica che risponde agli stimoli fisiologici, fisiopatologici e farmacologici. Ad esempio, ipossia/riossigenazione stress ha dimostrato di modulare l'espressione di proteine di giunzione critici (cioè, occludina, zonulae occluden-1 (ZO-1)), che è associato con permeabilità paracellulare aumentato per gli indicatori vascolari come saccarosio4,5,6. Osservazioni simili sono state effettuate a BBB nella regolazione della ferita di cervello traumatica7 e dolore infiammatorio periferico8,9. Queste stesse malattie possono anche modulare i meccanismi di trasporto presso le BBB10,11,12,13,14. Infatti, ipossia/riossigenazione aumenta l'espressione funzionale di anioni organici che trasporta il polipeptide 1a4 (Oatp1a4) presso la BBB, che può portare ad un aumento significativo del trasporto di sangue al cervello di substrati specifici di trasporto Oatp come taurocholate e atorvastatina13. BBB proprietà possono anche essere alterate dalla farmacoterapia stessa, un meccanismo che possa costituire una base per entrambi profondi cambiamenti nell'efficacia droga nel cervello e per interazioni farmaco-farmaco. Ad esempio, meccanismi di recettori nucleari di bersagli di acetaminofene segnalazione in cellule endoteliali microvascolari del cervello, aumenta l'espressione funzionale del trasportatore di efflusso critico P-glicoproteina (P-gp) e modifica l'analgesia dipendente dal tempo conferiti dalla morfina, un analgesico oppioide e stabilito P-gp trasporto substrato15. Una conoscenza approfondita delle modifiche BBB, che può essere indotta da malattie o da farmaci, richiede anche l'identificazione e caratterizzazione di specifici meccanismi regolatori che controllano queste modifiche. Infatti, le vie di segnalazione discrete sono state identificate in cellule endoteliali microvascolari del cervello che controllano l'espressione molecolare di giunzione stretta proteine16,17 e trasportatori15, 18,19. Prese insieme, queste osservazioni indicano che vie molecolari complesse sono coinvolti nella regolazione delle giunzioni strette BBB e trasportatori in salute e malattia.
Una sfida significativa nello studio della BBB è il requisito assoluto di un metodo semplice ed efficace per l'isolamento dei microvasi da tessuto cerebrale derivato da animali da esperimento e successiva preparazione dei campioni di membrana. Questi campioni devono essere preparati in modo che sono sia arricchite in cellule endoteliali microvascolari del cervello e limitati in presenza di altri tipi di cellule. Sopra i passato parecchi anni, molteplici metodologie per l'isolamento di microvasculature dal cervello del roditore sono stati segnalati nella letteratura scientifica13,20,21,22. Questo articolo viene descritto un semplice, robusto e un metodo riproducibile per l'isolamento dei microvasi dal cervello del ratto e per la preparazione di campioni arricchita di membrana endoteliali che può essere utilizzato per l'analisi dell'espressione della proteina. Un vantaggio di questo protocollo di isolamento del microvessel è la capacità di ottenere la preparazione del campione di alta qualità e con resa sufficiente di proteina da un singolo animale sperimentale. In questo modo la considerazione della variabilità nell'espressione della proteina. Tale un anticipo in questo protocollo ha migliorato notevolmente la robustezza degli studi BBB perché over-estimation (o sottovalutazione) della vera grandezza dei cambiamenti della proteina a BBB ora può essere evitato. L'inclusione di più fasi di centrifugazione con destrano consente inoltre di arricchimento migliorata di microvasi in campioni sperimentali, facilitando la rimozione di costituenti cellulari indesiderate quali neuroni.

<table><tbody><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8340</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M4125</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#E3889</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T1503</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>Dextran (MW 75,000)</td><td>Spectrum Chemical Mftg Corp</td><td>#DE125</td><td>Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma</td></tr><tr><td>Zetamine</td><td>MWI Animal Health</td><td>#501072</td><td>General anesthetic</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Western Medical Supply</td><td>#5530</td><td>General anesthetic</td></tr><tr><td>0.9% saline solution</td><td>Western Medical Supply</td><td>N/A</td><td>General anesthetic diluent</td></tr><tr><td>Filter Paper (12.5 cm diameter)</td><td>VWR</td><td>#28320-100</td><td>Used for removal of meninges from brain tissue</td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>#60.540.386</td><td>Disposable tubes used for dextran centrifugation steps</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; Coomassie Plus (Bradford) Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23236</td><td>Measurement of protein concentration in membrane preparations</td></tr><tr><td>Wheaton Overhead Power Homogenizer</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#903475</td><td>Required for homogenization of samples</td></tr><tr><td>10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#358039</td><td>Required for homogenization of samples</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H1758</td><td>Required for pH adjustment of buffers</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23210</td><td>Protein standard for Bradford Assay</td></tr><tr><td>Standard Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#91100-12</td><td>Used for dissection of brain tissue</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>#16020-14</td><td>Used for opening skull to isolate brain</td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#352070</td><td>Used for collection of brain tissue following isolation</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#13-678-20C</td><td>Used for aspiration of cellular debris following dextran spins</td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#459836</td><td>Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman-Coulter</td><td>#41121703</td><td>Used for ultracentrifugation of samples</td></tr></tbody></table>

a simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels

Emato - encefalica (BBB) è un tessuto barriera dinamica che risponde ai vari stimoli fisiopatologici e farmacologici. Tali cambiamenti derivanti da questi stimoli possono notevolmente modulano la consegna della droga per il cervello e, per estensione, causano notevoli sfide nel trattamento del sistema nervoso centrale (CNS) malattie. Molte modifiche BBB che interessano la farmacoterapia, coinvolgono proteine localizzate ed espresse a livello delle cellule endoteliali. Infatti, tale conoscenza sulla fisiologia BBB nella salute e nella malattia ha suscitato notevole interesse nello studio di queste proteine di membrana. Da un punto di vista di ricerca di scienza di base, ciò implica un requisito per un metodo semplice ma robusto e riproducibile per l'isolamento dei microvasi dal tessuto di cervello raccolto da animali da esperimento. Per preparare campioni di membrana da microvasi appena isolati, è indispensabile che la preparazione del campione essere arricchiti in cellule endoteliali ma limitati in presenza di altri tipi di cellule dell'unità neurovascolare (cioè, gli astrociti, microglia, neuroni, periciti). Un ulteriore vantaggio è la possibilità di preparare i campioni da singoli animali al fine di acquisire la vera variabilità dell'espressione della proteina in una popolazione sperimentale. In questo manoscritto, vengono forniti dettagli per quanto riguarda un metodo che viene utilizzato per l'isolamento di microvasi cerebrali di ratto e preparazione dei campioni di membrana. Arricchimento del microvessel, dai campioni derivati, è ottenuta utilizzando quattro fasi di centrifugazione dove destrano è incluso nel buffer del campione. Questo protocollo può essere facilmente adattato da altri laboratori per le proprie applicazioni specifiche. Campioni generati da questo protocollo sono stati indicati per produrre dati sperimentali affidabili da esperimenti di analisi di proteine che possono notevolmente facilitare la comprensione delle risposte BBB a stimoli fisiologici, fisiopatologici e farmacologici.

Il flusso sperimentale per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana del microvessel è mostrato nella Figura 1. Utilizzando la procedura qui presentata, è dimostrato successo isolamento dei microvessels intatti dal cervello del ratto (Figura 2A). Questi vasi sono stati ottenuti dopo completamento di centrifugazione con destrano e immediatamente prima dell'inizio ultracentrifugaz...

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A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

Qui, è descritto un metodo per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana. Questo protocollo ha il chiaro vantaggio di produrre arricchito del microvessel campioni con proteina accettabile resa da singoli animali. Campioni possono quindi essere utilizzati per analisi di robusta proteina presso l'endotelio microvascolare cerebrale.

Un metodo semplice e riproducibile per preparare campioni di membrana da microvasi cerebrali appena isolati del ratto

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K Views.  University of Arizona, Tucson. Qui, è descritto un metodo per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana. Questo protocollo ha il chiaro vantaggio di produrre arricchito del microvessel campioni con proteina accettabile resa da singoli animali. Campioni possono quindi essere utilizzati per analisi di robusta proteina presso l'endotelio microvascolare cerebrale.

Video: A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Ricerca

Medicina

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Neuroscienze

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Purificazione delle navi cervello di topo

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per l'analisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Misurazioni simultanee di calcio intracellulare e potenziale di membrana nell'endotelio cerebrale Mouse appena isolato ed intatto

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Biologia

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Un metodo ad alta uscita per isolare i periciti cerebrali dal mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Endothelial Cell Culture from Rat Brain Microvessels: A Procedure to Isolate and Culture Endothelial Cells from Microvessels of Rat Brain

Source: Molino, Y. et al. <a href="https://www.jove.com/v/51278/setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb">Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2014)
This video presents the isolation of microvessels from a rat brain using a combination of density gradient centrifugation and enzymatic digestion mehods. The isolated microvessels can be cultured in a culture flask pre-coated with collagen and fibronectin matrix to obtain endothelial cell colonies.

Coltura di cellule endoteliali da microvasi cerebrali di ratto: una procedura per isolare e coltivare cellule endoteliali da microvasi di cervello di ratto

Source: Molino, Y. et al. Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Ricerca sul cancro

Cancers of the Nervous System

In vitro studies

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

Source: Collins, H. Y., et al., <a href="https://app.jove.com/v/57122">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

Isolamento e coltura di microglia da cervelli di ratto utilizzando terreni privi di siero

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Prepare a Petri Dish for CD11b ...

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Isolating Mouse Brain Vessels: A Protocol to Isolate Intact Vessels from Murine Brain Sample

Source: Boulay, A. C. et al. <a href="https://www.jove.com/video/53208" target="_blank">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the isolation of intact vessels from a mouse&#39;s brain that constitute the blood-brain barrier (BBB) along with neurons and glial cells. The isolated vessels can be used as an in vitro model to study their role in maintaining brain homeostasis.

Isolamento dei vasi cerebrali di topo: un protocollo per isolare i vasi intatti da un campione di cervello murino

Source: Boulay, A. C. et al. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the isolation of intact vessels from a ...

In vivo studies

Obtaining a Single-Cell Suspension from Frozen Rat Brain Tissue

Source: Rubio, F. J., et. al. <a href="https://app.jove.com/v/54358">Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the dissociation of frozen rat brain tissue into a single-cell suspension using enzymatic digestion and mechanical trituration. The prepared cells are fixed and permeabilized with ethanol for downstream applications like flow cytometry or gene expression analysis.

Source: Rubio, F. J., et. al. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat ...