Questo lavoro è stato supportato dal LABEX MemoLife e dal ARSEP (Fondazione per l&#39;aide à la recherche sur la sclérose en placche)

1. Soluzioni e materiali <ol><li> Preparare le soluzioni di isolamento dei vasi: B1, aggiungere 1,5 ml di HEPES 1M a 150 ml di HBSS; B2, aggiungere 3,6 g di destrano al 20 ml di B1; B3, aggiungere 1 g di BSA a 100 ml di B1. </li><li> Modificare il portafiltro tagliando il fondo al largo della parte superiore avvitamento. </li><li> Preparare le soluzioni di immunoistochimica: soluzione di fissaggio, 4% paraformaldeide in PBS pH 7,4; Permeabilization / soluzione bloccante, diluire siero di capra al 5% e Triton X100 al 0,25% in PBS pH 7,4. Nota: Fixation dipende dal tipo di anticorpi primari utilizzati. </li></ol> 2. Dissection Nota: le condizioni sterili non sono richieste, a meno che le navi sono utilizzati per scopi di colture cellulari. <ol><li> Preparare un bicchiere da 150 ml con 20 ml di B1. Continuate a ghiaccio e coprire con parafilm per evitare la contaminazione dell&#39;aria. </li><li> Profondamente anestetizzare il mouse sotto una cappa con un piccolo asciugamano di carta imbevuto di 1 ml di isoflurano puro che viene aggiunto into la gabbia. L&#39;anestesia è verificata da una mancanza di reazione ad una presa punta. Uccidere il mouse dislocazione cervicale. NOTA: Questi passaggi sono realizzate nel rispetto della normativa nazionale e istituzionale. </li><li> Opzionale: eseguire perfusione intracardiaca con 20 ml di PBS 1x per eliminare il contenuto del sangue 24. </li><li> Sezione la pelle con un bisturi dal collo al naso e tirarlo via. Rimuovere tutti i peli contaminanti con PBS 1x. </li><li> Per aprire il cranio, prima inserire forbici anteriormente al bulbo olfattivo, e aprire le forbici per rompere il cranio in due parti. </li><li> Rimuovere con attenzione il cervello con una spatola cerebrale. Sezionare plessi corioidei dei ventricoli laterali come sarebbero contaminare il sangue di preparazione nave 38. NOTA: Opzionale: La preparazione finale conterrà vasi parenchimali e le meningi. Se non si desidera, le meningi possono essere staccata seguendo la procedura descritta da 38. </li><li> Transfer cervello nel becher contenente soluzione B1 su ghiaccio. Fino a 8 cervelli possono essere trattati insieme. </li></ol> 3. tessuto cerebrale omogeneizzazione <ol><li> Utilizzando due bisturi, manualmente e vigorosamente battere il cervello nella soluzione B1 ottenere successivamente pezzetti di circa 2 mm. </li><li> Omogeneizzare preparato, con un Dounce omogeneizzatore automatizzata, l&#39;esecuzione di 20 colpi a 400 rpm. Assicurarsi che il tubo di vetro è mantenuto in ghiaccio e che la parte superiore del douncer è in soluzione quando si spostano su e giù, in modo da impedire la formazione di sacche d&#39;aria. Se diversi campioni sono preparati, lavare il douncer con acqua ionizzata tra ogni omogeneizzazione. </li></ol> 4. Vessel Purificazione <ol><li> Trasferire l&#39;omogeneizzato in un tubo di plastica da 50 ml e procedere alla centrifugazione a 2.000 g per 10 min a 4 ° C. Un grande interfaccia bianca (principalmente mielina) formerà sulla parte superiore del serbatoio pellet (rosso se è stata eseguita alcuna perfusione). </li><li> Scartare il surnatante. Il pellet nave e l&#39;interfaccia bianco rimarrà attaccato insieme. Aggiungere 20 ml di soluzione B2 ghiacciata e agitare il tubo manualmente e vigorosamente per 1 min. </li><li> Procedere alla seconda centrifugazione a 4.400 g per 15 minuti a 4 ° C. La mielina ora formare uno strato bianco densa alla superficie del supernatante. </li><li> Staccare accuratamente lo strato mielina dalle pareti del tubo tenendo il tubo e ruotare lentamente per permettere il surnatante di passare lungo le pareti. Eliminare mielina con il surnatante. Il pellet contenente i vasi rimane attaccato al fondo della provetta. </li><li> Tamponare la parete interna del tubo con carta assorbente avvolto intorno ad un pipetta da 5 ml e rimuovere tutti i residui di liquido, evitare di toccare il pellet recipiente. Tenere il tubo capovolto su una carta assorbente per drenare eventuali residui di liquido. </li><li> Sospendere il pellet in 1 ml di soluzione B3 ghiacciata pipettando su e giù con punte basso vincolante, keeping la provetta in ghiaccio, quindi aggiungere altri 5 ml di soluzione B3. Assicurarsi che le navi sono disperse, per quanto possibile e non formano aggregati. </li></ol> 5. Filtrazione <ol><li> Preparare un becher su ghiaccio con 30 ml di soluzione B3 ghiacciata. Coprire con parafilm per evitare la contaminazione dell&#39;aria. </li><li> Collocare un filtro da 20 micron a maglia su un portafiltro modificato sulla sommità di un pallone becker ed equilibrare applicando 10 ml di soluzione B3 ghiacciata. </li><li> Versate la preparazione nave sul filtro e sciacquare i vasi con 40 ml di soluzione B3 ghiacciata. </li><li> Recuperare il filtro con pinze pulite e immergere immediatamente nel bicchiere contenente la soluzione B3. Staccare i vasi dal filtro scuotendolo delicatamente. </li><li> Versare il contenuto becher in un tubo di plastica da 50 ml e centrifugare a 2000 g per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Nota: in alternativa, la sospensione dei vasi cerebrali &#39;dal punto 4.6 può essere filtrata su un filtro a maglie micron 100.In questo caso, più grandi vasi sono preferenzialmente trattenuta dal filtro mentre il flow-through contiene microvasi (principalmente capillari), che vengono poi filtrati su un filtro 20 micron a maglie come sopra. </li><li> Risospendere il pellet di microvasi in 1 ml di soluzione B3 ghiacciata e trasferirlo pipettando in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. Centrifugare a 2.000 g per 5 minuti a 4 ° C. </li></ol> 6. Fissazione, permeabilizzazione e blocco <ol><li> Vasi di trasferimento pipettando nella 0,2 ml provette PCR contenenti PBS usando una bassa punta vincolante 1,0 ml. Fare attenzione a non toccare i vasi in quanto potrebbero aderire alla parte esterna della punta. Eseguire le seguenti operazioni al microscopio binoculare. </li><li> Per ciascuno dei seguenti cambiamenti medi, lasciare i tubi in ghiaccio fino vasi hanno raggiunto il fondo, e pipettare la maggior parte dei liquidi con puntali gel-caricamento lunghi e cosa. </li><li> Eliminare la maggior parte PBS e aggiungere 200 ml di soluzione di fissativo.Sospendere i vasi agitando delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare la soluzione fissativo e sostituirlo con 200 ml di PBS 1x (primo lavaggio), incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e ripetere l&#39;operazione 3 volte. Ogni volta, verificare che le navi sono affondate correttamente al fondo delle provette e pipetta su PBS 1x, assicurando le navi non sono toccati. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, sostituire PBS 1x dal / soluzione di bloccaggio permeabilizzazione e incubare 1 ora a temperatura ambiente, risospendere i vasi agitando delicatamente di tanto in tanto. </li></ol> 7. Immunostaining <ol><li> Sostituire la / soluzione di bloccaggio permeabilizzazione con il mix di anticorpi primari (vedi riferimenti degli anticorpi utilizzati qui e diluizioni nella tabella modello Materials) diluito in / soluzione di blocco permeabilizzazione, e incubare a 4 ° CO / N. </li><li> Dopo 3 lavaggi in PBS a temperatura ambiente, incubare le navi con il mix di anticorpi secondari diluito in PBS per 2 orea RT. </li><li> Nota: si consiglia vivamente di eseguire una colorazione nucleare con Hoechst (1: 2.000) o DAPI (1: 2.000), al fine di distinguere le navi di possibile contaminazione peli o polveri sotto il microscopio. </li><li> Dopo 3 lavaggi in PBS, risospendere le navi in ​​50 ml di PBS. </li></ol> 8. Montaggio e di osservazione <ol><li> Preparare una punta con un capillare di vetro siliconato: tagliare una punta di pipetta P200 con un bisturi e regolare il capillare all&#39;interno. Il volume approssimativo del capillare è di 40 microlitri. </li><li> Trasferire le navi ad un vetrino utilizzando il capillare di vetro siliconato e rimuovere con attenzione il liquido con un pezzo di carta assorbente. </li><li> Applicare una sola goccia di soluzione di montaggio sulle navi e in possesso di un vetrino a 45 ° permettendo al calo di diffusione lungo il bordo dello slip. Lasciate andare la vetrino e lasciare medio di diffondersi lentamente. Lasciare asciugare O / N a RT con protezione dalla luce. Le navi possono essere osservati sotto un flmicroscopio confocale ent. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La barriera ematoencefalica regola il passaggio di sostanze fisiologiche dentro e fuori del sistema nervoso centrale e lo protegge da sostanze potenzialmente nocivi presenti nel sangue. E &#39;coinvolto in diverse patologie del sistema nervoso centrale, tra cui le malattie neurodegenerative 2 e tumori cerebrali 28. La bassissima permeabilità della BBB ostacola anche il passaggio di agenti terapeutici mirati cellule neurali e lo sviluppo di metodi che intendono aprire reversibilmente BBB senza cons...

Il corretto funzionamento del sistema nervoso centrale (CNS) richiede un ambiente extracellulare altamente regolato, e le sue richieste metaboliche sono enormi rispetto ad altri organi 1. Il CNS è anche estremamente sensibile a una vasta gamma di prodotti chimici, generalmente innocui agli organi periferici, ma ad esso, neurotossico. Per un corretto funzionamento, la maggior parte del &#39;vascolare CNS costituisce una barriera endoteliale; la barriera emato-encefalica (BBB), che controlla il flusso di molecole e ioni così come il passaggio di cellule immunitarie tra il sangue e il cervello, mantenendo quindi una corretta omeostasi 2, ma anche limitando l&#39;ingresso di farmaci terapeutici, trattamenti ostacolano pertanto di disturbi neurologici 3. A livello cellulare, il BBB è sostenuta principalmente da ampi giunzioni strette tra le cellule endoteliali, espressione polarizzata dei trasportatori di efflusso e un tasso molto basso transcitosi 4. Proprietà e funzioni del BBB sono per lo più indotte da NEcellule ighboring 4. In particolare, periciti svolgono un ruolo importante nel indurre e mantenere la BBB 5,6. Essendo le cellule contrattili, periciti regolano anche il flusso di sangue 7 come le cellule della muscolatura liscia che circondano i grandi vasi. Infine, astrociti, le principali cellule gliali del cervello, inviano grandi processi denominati endfeet intorno la maggior parte del sistema vascolare cerebrale 8 e modulare l&#39;integrità BBB e quiescenza immunitario 9, il trasferimento di metaboliti di neuroni 10, e indurre l&#39;accoppiamento stretto tra l&#39;attività neuronale e il flusso di sangue 11,12. La possibilità di studiare le proprietà molecolari e cellulari del sistema cerebrovascolare è fondamentale per caratterizzare meglio il suo contributo alla fisiologia del cervello e fisiopatologia. Per affrontare questo problema, sono state sviluppate strategie per isolare il sistema cerebrovascolare del cervello, che consentono per la preparazione di frammenti dei vasi cerebrali intatti. Cerebral nave purification è stata inizialmente descritta utilizzando cervelli bovini 13 e migliorato e adattato ad altre specie, in particolare roditori 14. In questo ultimo studio, l&#39;uso di filtri di varie dimensioni è stato introdotto per separare vasi cerebrali in per frazioni arricchite in vasi di diametri diversi. È interessante notare che, in tali preparati, le cellule endoteliali mantenuto le loro proprietà metaboliche 15, funzionalità trasportatore 16 e 17 di polarizzazione. Qui, descriviamo in dettaglio questo protocollo e inoltre dimostrare che le navi isolate mantengono la maggior parte di loro in strutture in situ. Le cellule endoteliali restano legati da giunzioni strette e circondate da una lamina basale continuo. Periciti e cellule muscolari lisce rimangono attaccati allo strato endoteliale, così come membrane astrociti perivascolari. Tuttavia, astrociti, cellule microgliali, neuroni e oligodendrociti sono eliminati. Infine, si descrive una procedura per eseguire immunocolorazione sui vasi cerebrali isolate. </p&gt; Fino ad ora la maggior parte degli studi molecolari e cellulari riguardanti il sistema cerebrovascolare sono stati eseguiti su cellule dei vasi cerebrali purificate dissociati da cellule di smistamento utilizzando cellulari specifici ceppi di topi giornalista o procedure basate immunocolorazione-18,19. Sebbene queste tecniche consente l&#39;isolamento delle popolazioni cellulari quasi puro cerebrovascolari, cellule isolate perdono completamente la loro morfologia e in situ interazioni, che a sua volta, influisce notevolmente le loro proprietà molecolari e cellulari. Il protocollo qui descritto, consentendo l&#39;isolamento di interi frammenti cerebrovascolari senza necessità di anticorpi specifici o macchie di topi transgenici, offre una buona alternativa come la struttura complessiva di isolati vasi cerebrali è conservato, quindi, diminuendo ripercussioni sulla loro proprietà molecolari. Isolato imbarcazioni potrebbero quindi essere utilizzati per studiare l&#39;attività dei geni, la sintesi proteica e la regolamentazione a BBB come recentemente descritto 20,21 </sup&gt;. Infine, rispetto alla cattura microdissezione laser 22,23 il presente protocollo è poco costoso, facile da eseguire e rapidamente adattabile a qualsiasi laboratorio.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Grinder Size C</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>3431E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5415&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance, Modular Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact System Provides High Quality Leica LED1000</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low binding tips (P1000)</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>14200T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 20&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 100&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1014356290F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips, Thickness 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P10143263NR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;PARAFILM&#174; M (roll size 4 in. &#215; 125 ft)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Life technology</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>ET330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&#174; 488 Conjugate; Dilution 1/100</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (rabbit) ; dilution 1/400</td>
			<td colspan="2">kindly provided by Dr Markus A Ruegg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>33-9100</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti GFAP (mouse, clone GA5)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3893</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti AQP4 (rabbit)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Cx43 (mouse, Clone&#160; 2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610061</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Olig2 (rabbit)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>&#160;dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NF-M (mouse)</td>
			<td colspan="2">provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.</td>
			<td>&#160;dilution 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Iba1 (rabbit)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>&#160;dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11029</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11034</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21424</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 555 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21429</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of mouse brain vessels

Nel cervello, la maggior parte del sistema vascolare costituito da una barriera selettiva, la barriera emato-encefalica (BBB) ​​che regola lo scambio di molecole e cellule immunitarie tra il cervello e il sangue. Inoltre, la grande richiesta metabolica neuronale richiede un regolamento momento per momento del flusso sanguigno. In particolare, le anomalie di questi regolamenti sono le caratteristiche distintive eziologici della maggior parte delle patologie cerebrali; compresi glioblastoma, ictus, edema, epilessia, malattie degenerative (es: la malattia di Parkinson, il morbo di Alzheimer), tumori cerebrali, così come le condizioni infiammatorie come la sclerosi multipla, la meningite e sepsi indotta disfunzioni cerebrali. Pertanto, la comprensione degli eventi di segnalazione che modulano la fisiologia cerebrale è una sfida importante. Molto comprensione delle proprietà cellulari e molecolari dei vari tipi di cellule che compongono il sistema cerebrovascolare può essere acquisita da coltura primaria o separazione delle cellule dal tessuto cerebrale di recente dissociato. Però,proprietà come polarità cellulare, morfologia e rapporti intercellulari non sono mantenuti in tali preparazioni. Il protocollo che descriviamo qui è concepito per purificare frammenti dei vasi cerebrali, mantenendo l&#39;integrità strutturale. Abbiamo dimostrato che i vasi isolati costituiti da cellule endoteliali sigillate da giunzioni strette che sono circondati da una lamina basale continuo. Periciti, cellule muscolari lisce e le membrane astrociti endfeet perivascolari rimangono attaccati allo strato endoteliale. Infine, si descrive come eseguire gli esperimenti di immunoistochimica sui vasi cerebrali purificate.

Qui, descriviamo un protocollo che consente l&#39;isolamento meccanico dei vasi cerebrali 14. La figura 1 riassume le fasi principali di questa tecnica. L&#39;architettura dei vasi cerebrali è complesso e comprende vari tipi di cellule, cioè, cellule endoteliali sigillate da giunzioni strette e circondati da periciti, cellule muscolari lisce e processi piede astrociti 9. Così, dopo l&#39;isolamento dei vasi cerebrali, abbiamo voluto caratterizzare la struttura dei vasi ...

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Purification of Mouse Brain Vessels

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Purificazione delle navi cervello di topo

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K Views.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes. 

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Ricerca

Neuroscienze

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni

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Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

Produzione, purificazione e controllo di qualità per i vettori basati su Virus Adeno-associato

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

Purificazione della Frazione ricca di Filopodia Dendritica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, and a ventricular zone niche, which generates the inhibitory GABAergic Purkinje cells, which are neurons that constitute the deep cerebellar nuclei and Bergman glia. Recently, a third stem cell niche has been described that arises as a secondary germinal zone from the ventricular zone niche. The cells of this niche are defined by the cell surface marker prominin-1 and are localized to the developing white matter of the postnatal cerebellum. This niche accounts for the late born molecular layer GABAergic interneurons along with postnatally generated cerebellar astrocytes. In addition to their developmental role, this niche is gaining translational importance in regards to its involvement in neurodegeneration and tumorigenesis. The biology of these cells has been difficult to decipher because of a lack of efficient techniques for their purification. Demonstrated here are efficient methods to purify, culture, and differentiate these postnatal cerebellar stem cells.

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Demonstrated here is an efficient and cost-effective method to purify, culture, and differentiate white matter stem cells from postnatal mouse cerebellum.

Purificazione della Prominin-1- Cellule staminali dal cervelletto del topo postnatale

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol describes in vivo labeling and subsequent purification of newly synthesized proteins using an engineered mouse line to direct protein labeling to specific cellular populations. It is an inducible line by Cre recombinase expression of L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS*), enabling azidonorleucine (ANL) incorporation to the proteins, which otherwise will not occur. Using the method described here, it is possible to purify cell-type-specific proteomes labeled in vivo and detect subtle changes in protein content due to sample complexity reduction.

This protocol describes how to perform cell-type-specific protein labeling with azidonorleucine (ANL) using a mouse line expressing a mutant L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS*) and the necessary steps for labeled cell-type-specific proteins isolation. We outline two possible ANL administration routes in live mice by (1) drinking water and (2) intraperitoneal injections.

Purificazione e identificazione di proteine specifiche per tipo cellulare da tessuti complessi utilizzando una linea murina di topo di metionina tRNA sintetasi mutante