Recentemente, il ruolo dei periciti cerebrali è diventato evidente nei disturbi neurologici e nella funzione cerebrale. Pertanto, lo sviluppo di un metodo di coltura affidabile per queste cellule è imperativo. Il nostro protocollo per l'estrazione di periciti cerebrali murini rappresenta uno strumento affidabile per gli studi in vitro e per fornire ai periciti un'elevata purezza e resa cellulare.
A dimostrare la procedura con Anupriya Mehra sarà Lucie Dehouck, una tecnico del mio laboratorio. Inizia posizionando il cervello da uno specifico topo C57BL/6 maschio privo di agenti patogeni da quattro a sei settimane su una pulitura sterile e priva di pelucchi asciutti e usando forcep di punta curva per rimuovere il cervelletto, lo striato e i nervi occipitali. Usa un batuffolo di cotone per rimuovere tutte le meningi visibili e capovolgere il tessuto cerebrale.
Aprire i lobi con leggeri tratti verso l'esterno e rimuovere tutti i vasi sanguigni visibili. Quindi posizionare il tessuto cerebrale privo di meningi in una piastra di Petri di 100 millimetri contenente 15 millilitri di tampone di lavaggio freddo B.To omogeneizzare il tessuto, trasferire il campione cerebrale in un tubo di malta della smerigliatrice di tessuto Dounce e aggiungere tre o quattro millilitri di tampone di lavaggio B al tubo. Utilizzare un pestello sciolto per tritare il tessuto 55 volte, quindi sciacquare il pestello con tampone di lavaggio B e tritare il liquame tissutale con un pestello stretto 25 volte.
Al termine dell'omogeneizzazione, aliquotare allo stesso modo il liquame tra due tubi da 50 millilitri e aggiungere 1,5 volte il volume di albumina di siero bovino freddo al 30%. Quindi scuotere vigorosamente i tubi per mescolare il liquame. Per isolare la frazione vascolare, sedimentare le cellule mediante centrifugazione e trasferire i supernatanti in due nuovi tubi.
Conservare il pellet nel tampone di lavaggio B sul ghiaccio. Resuspend i pellet in tre millilitri di tampone di lavaggio freddo B sul ghiaccio. Centrifuga i supernatanti raccolti e ripeti questo passo ancora una volta.
Scartare i supernaganti e rimescolare i pellet in tre millilitri di tampone di lavaggio B.Quindi mettere in comune i pellet rimescolati e portare il volume finale della sospensione della cella raggruppata a 10 millilitri con tampone di lavaggio fresco a freddo B.Dissociare ulteriormente le celle con una pipetta di 10 millimetri sei volte fino a quando non sono visibili ciuffi rimanenti di pellet e utilizzare un gruppo filtro sottovuoto e un colino in rete di nylon per filtrare la sospensione cellulare. Posizionare il colino in una piastra di Petri e sgombare la rete con tampone di lavaggio fresco B e raschiare per recuperare eventuali capillari. Quindi eseguire una seconda filtrazione con un filtro fresco.
Dividere il filtrato equamente tra due tubi e raccogliere le cellule per centrifugazione. Dopo aver scartato i supernatanti, mettere in comune i pellet in un unico tubo contenente tampone di lavaggio prebellimato B con enzimi e aggiungere collagenasi/dispasi prebellita al tubo. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua del tavolo tremante per 33 minuti precisamente a 37 gradi Celsius prima di interrompere la reazione con 30 millilitri di tampone di lavaggio freddo B.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e scartare con cura il supernatante.
Resostigliere rapidamente ma con cura il pellet nel tampone di lavaggio B sei volte e centrifugare nuovamente la sospensione. Dopo aver scartato il supernatante, resuspend il pellet in 18 millilitri di mezzo DMEM completo e semina due millilitri di sospensione cellulare in DMEM completo in nove pozzi di tre piastre a sei pozzi rivestite di Matrigel. Posizionare le colture cellulari in un incubatore sterile di anidride carbonica di 37 gradi Celsius 5% per 24 ore prima di rimuovere accuratamente i detriti da ogni pozzo e aggiungere nuovi supporti DMEM.
Dopo 48 ore, cambiare il mezzo in ogni pozzo ogni 48 ore. Il giorno da otto a 10 quando le cellule raggiungono la confluenza del 100%, passaggiamo le cellule in mezzo di coltura pericita su nuove piastre di gelatina rivestite con sei pozzi e restituiranno le cellule all'incubatore di coltura cellulare per altri sei-sette giorni con monitoraggio. Quindi dividere di nuovo le cellule il giorno 17 in mezzo pericito in nuove piastre rivestite di gelatina.
Dal passaggio zero al passaggio due, ci sono specifiche caratteristiche morfologiche con cui si possono identificare le cellule endoteliali e il conseguente graduale aumento dei periciti. In una coltura di passaggio zero, le cellule endoteliali allungate che si sviluppano da microvessel sono in abbondanza. Questa abbondanza si riduce dopo il passaggio uno e assente dopo il passaggio due.
Al contrario, i periciti appaiono come rare cellule quadrilatere nelle prime culture e diventano abbondanti con il passaggio due. La valutazione dell'espressione di NG2, CD146 e PDGFR beta può essere utilizzata per valutare la purezza della coltura di periciti mediante PCR quantitativa, immunocitochimica e macchia occidentale. La digestione enzimatica è un passo fondamentale per il successo del protocollo.
Assicurati di monitorare rigorosamente le concentrazioni enzimatiche e il tempo di incubazione.
