Ringraziamo Thomassin Jenny-Lee per il suo aiuto nella redazione del manoscritto. Il lavoro è stato supportato da ANR concede MITOPATHO e PATHIMMUN, concede dal Labex Memolife e PSL IDEX Shigaforce. Chunhui Sun è un beneficiario di una sovvenzione di pH.d. dal Consiglio di borsa di studio di Cina. Laurent Combettes e Guy Tran Van Nhieu sono destinatari di un cambio di WBI-Francia Tournesol programma N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'enseignement supérieur et de la Recherche dans le cadre des Partenariats Hubert Curien).

1. preparati
<ol><li>
Preparazione di batteri
	<ol>
<li>I batteri del piatto — ceppo selvaggio-tipoShigella esprimendo l'adesina AfaE (M90T-AfaE) — su un trypticase agar soia (TCS) piastra contenente 0,01% Congo rosso (CR) e li Incubare per 18 h a 37 ° C. Nota: Per aumentare la loro riproducibilità, le piastre di Shigella ottenute al passaggio 1.1.1 sono conservate a 4 ° C e devono essere utilizzate entro una settimana, perché tutte le colonie su supporto CR alla fine diventerà rosse nel corso del tempo.</li>
		<li>Inoculare TCS brodo di pre-coltura selezionando 3 colonie rosse dalle piastre striatura. Nota: Un'inoculazione con 3 colonie viene eseguita per limitare la probabilità di scegliere un singolo clone cui plasmide di virulenza ha subito una ricombinazione genetica.</li>
		<li>Crescere le colture batteriche liquide in un incubatore d'agitazione per 16 h a 37 ° C a 200 giri/min. Aggiungere ampicillina ad una concentrazione finale di 75 mg/mL. Le concentrazioni di antibiotiche non devono superare 3 x la concentrazione inibitoria minima, come un eccesso di antibiotico può portare alla perdita del plasmide di virulenza grande. Nota: La manutenzione del plasmide di virulenza di Shigella deve essere verificata da colture batteriche su piastre CR completati con concentrazioni di antibiotiche appropriate di placcatura. La presenza di colonie bianchi indica una perdita di plasmide.</li>
		<li>Inoculare la cultura TCS con la pre-coltura batterica ad una diluizione di 1: 100. Incubare a 37 ° C in un incubatore d'agitazione per 2 h a 200 giri/min. Garantire che la densità ottica a 600 nm (OD600nm) è di 0,2 - 0,4.</li>
		<li>Centrifugare la coltura batterica per 2 min a 13.000 x g a 21 ° C e risospendere il pellet in un volume equivalente di mezzo EM (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, glucosio di 5 mM e 25 mM HEPES pH = 7.3).</li>
		<li>Diluire la sospensione batterica in un buffer di EM un finale OD600nm di 0.1 e utilizzarlo da subito o conservarlo a 21 ° C e utilizzarlo entro i prossimi 60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle cellule
	<ol>
<li>Cellule HeLa di cultura in DMEM con 1 g/L di glucosio completati con 10% siero fetale di vitello (FCS) e farle crescono a 37 ° C con 10% CO2. Crescere TC-7 coltivate in DMEM con 4,5 g/L di glucosio, contenente 10% FCS e gli aminoacidi non essenziali in un incubatore a 37 ° C contenente 10% CO2.</li>
		<li>Per la manutenzione delle cellule, dividere le celle regolarmente, per evitare un'inibizione di crescita-contatto collegata agli Stati confluenti; Questo è fondamentale per un'elevato Ca2 + sonda caricamento/efficienza transfezione.</li>
		<li>Piastra di cellule HeLa sulla sterile 25 mm diametro circolare coprioggetti in piastre da 6 pozzetti ad una densità di 3 x 105 cellule/pozzetto il giorno prima dell'esperimento per le cellule HeLa.</li>
		<li>Per cellule TC-7, tripsinizzano e contare le celle. Semi a 4 x 105 cellule/pozzetto e incubare li 5-7 giorni a 37 ° C in un 10% CO2-incubatore prima degli esperimenti per consentire una polarizzazione.<ol>
<li>Aggiornare il mezzo di coltura cellulare ogni giorno fino al giorno dell'esperimento. Nota: Chambers USA e getta di diametro 35 mm con fondo di vetro può anche essere utilizzato come alternativa ai pozzetti contenenti coprioggetti. Se questi ultimi sono utilizzati, controllo della temperatura attraverso un piatto riscaldato o obiettivo non è sufficiente, e una camera di incubazione termostato montato sul tavolino del microscopio è necessario.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, rimuovere il supporto e lavare le cellule 3 x con il mezzo di 1ml EM a 21 ° C.</li>
	<li>Caricare le celle con 3mm Fluo-4am14 in un buffer di EM per 30 min a 21 ° C. Nota: Mentre il caricamento delle cellule HeLa Sub-confluenti non genera problemi principali, il caricamento di cellule polarizzate TC-7 è spesso eterogeneo e scarsamente efficiente. Per queste cellule, abbiamo trovato che l'efficienza di caricamento è migliorata con l'aggiunta dell'agente disperdente — pluronic acido — ad una concentrazione finale di 0,1% e l'anione-trasportatore inibitore bromosulfophtalein ad una concentrazione finale di 20 µM per il Fluo-4-AM-contenente EM. L'uso di raziometrici chimico sonde o geneticamente codificato-FRET sonde che richiedono dual-acquisizione non è compatibile con la velocità di acquisizione necessaria per l'imaging del locale Ca2 + le risposte.</li>
	<li>Lavare i campioni 3 x con EM buffer e ulteriormente li Incubare in 1 mL di tampone di EM a 21 ° C per consentire l'idrolisi della parte dell'AM. Uso Fluo-4 caricato cellule immediatamente o entro i prossimi 90 min (mantenuta a 21 ° C).</li>
</ol>2. infezione e acquisizione di immagini di locale Ca2 + risposte
<ol><li>Posizionare il vetrino coprioggetto contenente le celle di Fluo-4 caricato in una camera di imaging o con fondo di vetro camera. Lavare i campioni nella camera di imaging o USA e getta con fondo di vetro camera 3x con buffer di EM per rimuovere i composti potenzialmente derivanti da lisi cellulare. Aggiungere 1 mL di tampone di EM.</li>
	<li>Posizionare la camera su un palcoscenico di microscopio di fluorescenza invertito riscaldato a 33 ° C. Nota: Questa temperatura è selezionata come un compromesso tra le temperature ottimali compatibili con il processo di invasione di Shigella e il rallentamento del Ca2 + le risposte di visualizzare risposte locali. Usiamo un 63 X obiettivo a immersione in olio (NA = 1.25) dotati di anelli di contrasto di fase.</li>
	<li>Selezionare un campo di microscopia e impostare i parametri di acquisizione, incluso il tempo di esposizione e binning se necessario, per ottimizzare il segnale fluorescente Fluo-4. Nota: Le principali sfide del locale Ca2 + formazione immagine sono la bassa ampiezza e la piccola durata delle risposte, che richiedono acquisizione almeno ogni 30 ms più commercialmente disponibili retro-illuminato EM-CCD o C-MOS telecamere presentano la necessaria sensibilità per rilevare locale Ca2 + risposte utilizzando Fluo-4. Sensibilità di rilevazione è anche una questione importante per limitare photodamage o manufatti quali risposte spontanee collegate all'eccitazione fluorescente di Fluo-4 ad alta frequenza. Qui, un'illuminazione basati su LED di 470 nm, con un filtro di eccitazione di 480 ± 40 nm passa-banda, un filtro dicroico 505 nm e un 527 emissione del passa-banda ± 30 nm usato al 5% della sua massima intensità combinata con un filtro a densità neutra 1,0 sono stati utilizzati per ridurre al minimo questi problemi sotto un flusso di acquisizioni di durata limitata. Un'analisi del Ca2 + segnali locali di lotti di 120 flussi di s è stata effettuata ordinariamente. In queste condizioni di bassa illuminazione, fluoroforo photobleaching non è stata osservata durante le acquisizioni di min-flusso 2. Acquisizioni successive sullo stesso campione possono essere eseguite, condizione diversi campi sono utilizzati. Come regola generale, un primo flusso di acquisizione viene eseguito su un campo di controllo in assenza di stimolazione di batteri per garantire l'assenza di risposte spontanee. Se si osservano le risposte spontanee, i campioni sono lavati con un tampone di EM fino a quando non risposte sono osservate.</li>
	<li>Per aggiungere i batteri al campione, rimuovere 500 µ l di tampone di EM dalla camera e aggiungere 500 µ l della sospensione batterica preparata al punto 1.1.6 per ottenere un finale OD600nm di 0.05, con la cura adeguata per evitare di spostare il campo selezionato microscopia; i volumi di garantiscono una corretta miscelazione dei batteri e una distribuzione omogenea dei batteri su campioni di cellule.</li>
	<li>Eseguire un'acquisizione su aggiunta batterica. In alternativa, eseguire un'acquisizione 10 min dopo l'aggiunta di batterico, che corrisponde al tempo necessario per i batteri di sedimento sulle cellule nelle circostanze usate. Alla fine del flusso acquisizione, acquisire un'immagine di contrasto di fase del campo selezionato per visualizzare i batteri a contatto con le cellule e il volant di membrana associato ai siti di invasione batterica.</li>
	<li>Ripetere la procedura di acquisizione come descritto al punto 2.5, a intervalli che sono favorevoli alla durata delle acquisizioni di immagine, file risparmio e selezione di un nuovo campo per coprire l'intero processo. Nota: Per Shigella, abbiamo trovato che acquisizione flussi ogni 5 min per 20 min, seguendo la sedimentazione batterica di 10 min, ha permesso di coprire la maggior parte degli eventi invasione.</li>
	<li>Al termine della procedura di acquisizione, è necessario aggiungere una concentrazione finale di 2 µM di Ca2 + ionoforo ionomicina campioni per determinare la massima ampiezza di Ca2 + segnali. Acquisire immagini ogni 3-5 s fino al segnale di stabilizzazione, di solito per meno di 10 min.</li>
	<li>Seguire con l'aggiunta di Ca2 + chelante EGTA ad una concentrazione finale di 10 mM per determinare il segnale di fluorescenza in assenza di Ca2 +. Acquisire immagini ogni 3-5 s fino al segnale di stabilizzazione, di solito per meno di 10 min. Nota: A causa della relativamente lenta dinamica delle variazioni2 + Ca globale, eseguire queste acquisizioni ogni 3-5 s (non in modalità streaming), permettendo per Ca2 + imaging nello stesso campo microscopico durante i trattamenti successivi.</li>
</ol>3. analisi
<ol><li>Rapidi2 + variazioni di Ca citosolici nel tempo come la percentuale di ΔF/F0, dove ΔF rappresenta la variazione dell'intensità di fluorescenza media della regione di interesse (ROI) e F0 la fluorescenza di base nello stesso ROI, a cui un regione non rilevanti del campo privo di cellule viene sottratto.<ol>
<li>Rimuovere i livelli basali di fluorescenza per ogni cella in diversi campi, corrispondenti ai livelli basali; questi livelli possono essere determinati in modo non ambiguo a causa della bassa frequenza e relativamente di breve durata di Ca2 + risposte locali in un'acquisizione di flusso specificato. Nota: Quantificare caratteristiche sorprendenti delle risposte relazionate alle domande poste e il modello patogeno studiato. Classicamente, vari parametri sono presi in considerazione per analizzare il Ca2 + segnali, tra cui la frequenza delle cellule risultati locali o globali Ca2 + risposte, così come la durata, ampiezza e frequenza di queste risposte. Nel caso di Shigella e risposte locali, un altro aspetto importante dell'analisi è l'associazione spaziale delle risposte con i siti di invasione batterica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per quantificare la percentuale di cellule rispondenti le risposte globali o locali, disegnare ROIs in cellule, nelle serie temporali corrispondenti alle variazioni di intensità di Fluo-4.<ol>
<li>Impostare parametri precisi per identificare locale Ca2 + risposte, ad esempio un'ampiezza di variazioni dello sfondo sopra triplice della linea di base delle cellule di fluorescenza media intensità o una durata di almeno 200 ms, per evitare segnando un falso positivo. Nota: Come regola generale, anche i piccoli Ca2 + risposte locali possono essere distinto da qualsiasi rumore di fondo dal loro profilo. Il ROIs dovrebbe essere sufficiente per integrare abbastanza segnali di fluorescenza per consentire la rilevazione delle variazioni locali. A seconda dell'intensità della rilevazione Fluo-4, questi ROIs può corrispondere a cerchi con diametri che vanno da 2-5 mM.</li>
		<li>Misurare le variazioni dell'intensità di fluorescenza di Fluo-4 media in 2 regioni in una zona distinta della cella stessa, per determinare se le risposte sono locali o globali. Nota: L'analisi di un gran numero di cellule è facilitato dall'uso di software che permette la visualizzazione on-line delle variazioni dell'intensità di fluorescenza media nel tempo per le regioni selezionate di imaging. Software di imaging disponibili in commercio ha una tale opzione, ma questo può essere eseguito anche utilizzando il freeware di Icy , utilizzando il plugin di ROI intensità Evolution .</li>
		<li>Determinare la percentuale di cellule che mostrano risposte locali. Nota: Questa percentuale è calcolata dal numero totale delle cellule analizzate nel campo della microscopia, che dovrebbe essere in numero sufficiente per supportare un statisticamente significato utilizzando un test non parametrico.</li>
		<li>Determinare la durata delle risposte locali. Nota: Locale Ca2 + le risposte possono essere ulteriormente distinti secondo le loro gamme di durata (cioè, meno di 500 ms, tra 5 e 10 s, o superiore a 10 s) e la loro associazione con siti di invasione di Shigella .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificare l'ampiezza delle risposte. In primo luogo, calibrare i Ca2 + e delle cellule sfondo i livelli massimi determinati come descritto al punto 2.1.7. Poiché il carico di Fluo-4 può variare per ogni cella, è possibile eseguire queste determinazioni per le singole celle nel campo.<ol>
<li>L'ampiezza delle risposte si esprime come percentuale relativa della risposta massima.</li>
		<li>Eseguire il test statistico utilizzando un test di normalità, seguito da un test parametrico per analizzare le differenze di potenziale nell'ampiezza delle risposte tra i campioni.</li>
		<li>Determinare l'associazione di queste risposte riguardante i siti di invasione batterica dalla loro rispettiva localizzazione per il volant di membrana batterica-indotta visualizzati nelle immagini di contrasto di fase corrispondente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier.">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signaling.">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+calcium+ATPases:+from+generic+Ca(2+)+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca(2).">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li><li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Ca2++signals:+a+question+of+timing.">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li><li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+calcium+oscillations.">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li><li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells.">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li><li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome.">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li><li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+III+secretion+systems:+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells.">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li><li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles.">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).</li><li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion.">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567 (2013).</li><li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+PtdIns(4,5)P(2)+into+PtdIns(5)P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology.">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li><li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism.">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host &amp; Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li><li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+Ca2++requirement+of+calpain+activation.">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li><li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fluorescent+Ca2++indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2++signals.">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li><li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2++signals+during+invasion+of+epithelial+cells.">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li><li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes,+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus.">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Questo manoscritto descrive il protocollo che abbiamo progettato per seguire Ca2 + segnali locali durante la cinetica relativamente breve di un'invasione di Shigella , nonché global Ca2 + le risposte durante la cinetica estesa di Shigella. Di seguito, chiave possono essere rilevati problemi che devono essere affrontate per ottimizzare l'individuazione di Ca2 + segnali, riducendo al minimo qualsiasi interferenza con i processi biologici.
Chimica ...

CA2 + regola tutti i processi conosciuti delle cellule, tra cui la riorganizzazione del citoscheletro, le risposte infiammatorie e vie di morte cellulare relazionate al ospite-patogeno interazioni1,2,3. In condizioni fisiologiche, basale concentrazioni Ca2 + citosoliche sono basse, in alcune centinaia di nM, ma possono essere soggetti ad aumenti transitori dopo stimolazione agonista. Queste variazioni mostrano spesso comportamento oscillatorio attraverso l'azione delle pompe e canali alle membrane del reticolo endoplasmatico e del plasma. Il modello di queste oscillazioni si caratterizza per il periodo, la durata e l'ampiezza del Ca2 + aumenta e viene decrittografato dalle cellule che, a loro volta, innescano risposte specifiche in quello che è noto come il Ca2 + codice4,5 . Un aumento marcato la concentrazione Ca2 + citosolico in condizioni patologiche può portare alla morte cellulare connessa con la permeabilizzazione delle membrane mitocondriali e il rilascio di pro-apoptotici o necrotico fattori6, 7.
Shigella, l'agente eziologico della dissenteria bacillare, invade le cellule epiteliali iniettando effettori nelle cellule ospiti utilizzando un tipo di secrezione di III (T3SS) sistema8,9. Un'invasione di Shigella delle cellule dell'ospite è associata con Ca2 + segnali locali e globali suscitati dalla T3SS. Per quanto riguarda poro-formare tossine, il Traslocone T3SS inserisce in membrane cellulari host e è necessario per l'iniezione di T3SS effettori è probabile responsabile dell'attivazione di PLC e la (1, 4, 5) l'inositolo trifosfato (InsP3)-dipendente Ca2 + rilascio. La combinazione di stimolazione localizzata PLC e l'accumulo di actina polimerizzata in siti di un risultato di invasione di Shigella in un insolitamente lunga durata InsP3-dipendente Ca2 + rilascio10. L'effettore III tipo IpgD, un fosfatidil 4,5 bifosfato (PIP2) -4-fosfatasi, limita la quantità di locale di PIP2, controllando così la quantità di substrato disponibile per PLC generare InsP3, che contribuisce al confino di locale Ca2 + risposte all'invasione batterica siti11,12. Questi Ca2 + risposte locali probabile contribuiscono per la polimerizzazione dell'actina Shigella invasione siti10. Ca2 + risposte globale che sono anche suscitate da Shigella, tuttavia, sono indispensabili per il processo di invasione batterica ma innescare l'apertura del connexin adenosina alla membrana del plasma e il rilascio di ATP in extracellulare vano. ATP rilasciato agisca in modo paracrino, a sua volta, stimola Ca2 + oscillatorio responses in cellule accanto alla cellula infettata. IpgD è anche responsabile per la modellatura del global Ca2 + le risposte nelle risposte erratiche isolate con dinamica lenta. Finalmente, dopo un'infezione batterica prolungata, IpgD conduce all'inibizione di InsP3-mediata di Ca2 + segnali. Attraverso la sua interferenza con segnalazione di Ca2 + , IpgD ritarda a Ca2 +-dipendente calpaina attivazione che conduce lo smontaggio delle strutture di adesione focale e il distacco prematuro della infettato cellule13.
Mentre Ca2 + segnali sono coinvolti in aspetti critici della patogenesi, l'uso di un microorganismo solleva una serie di sfide tecniche che non vengono rilevati negli studi classici agonista. I protocolli descritti qui utilizzano il comunemente usato fluorescente Ca2 + indicatore chimico Fluo-4 che abbiamo progettato per caratterizzare il Ca2 + segnali locali durante un'infezione Shigella . Passaggi critici per la rilevazione di questi segnali sono discusse, così come le procedure attuate per la loro analisi quantitativa necessarie per caratterizzare il ruolo di effettori batterici nella segnalazione di Ca2 + .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="694">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">F14201</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Metamorph version 7.7</td>
			<td style="width:120px;">Universal Imaging</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">CoolLED illumination system pE-2</td>
			<td style="width:120px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">micro-dish 35 mm, high&#160;</td>
			<td style="width:120px;">IBIDI</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Trypticase Soy (TCS) broth</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11768</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">TCS agar</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Congo red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>75768</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">M90T-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">ipgD-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells

CA2 + è un ione onnipresente coinvolti in tutti i processi cellulari conosciuti. Mentre global Ca2 + le risposte possono influenzare il destino delle cellule, variazioni locali in Ca2 + citosolico le concentrazioni libere, legate per rilasciare da negozi interni o un afflusso attraverso i canali della membrana plasmatica, regolano i processi delle cellule corticali. Gli agenti patogeni che aderiscono a o invadere host cellule grilletto una riorganizzazione del citoscheletro di actina sottostante la membrana plasmatica di host, che probabilmente colpisce sia globale che locale di Ca2 + segnalazione. Perché questi eventi possono verificarsi alle basse frequenze in modo pseudo-stocastico sopra estesa cinetica, l'analisi del Ca2 + segnali indotti da agenti patogeni solleva grandi sfide tecniche che devono essere affrontate.
Qui, segnaliamo i protocolli per la rilevazione di globale e locale Ca2 + segnali su un'infezione di Shigella delle cellule epiteliali. In questi protocolli, manufatti legati ad un'esposizione prolungata e photodamage connesso con l'eccitazione di sonde Ca2 + fluorescenti sono Troubleshooting controllando rigorosamente i parametri di acquisizione su periodi di tempo definiti durante un Shigella invasione. Le procedure vengono implementate per analizzare rigorosamente l'ampiezza e la frequenza di Ca2 + segnali citosolici globali durante la cinetica di infezione estesa utilizzando la sonda chimica Fluo-4.

Invasione di Shigella è associato con atipico lunga durata Ca2 + risposte locali:
A seguito del protocollo di cui sopra, le cellule HeLa Fluo-4-caricati sono state sfidate con WT Shigella e acquisizioni di flusso sono stati effettuati per analizzare segnali di Ca2 + . Un esperimento rappresentativo è mostrato in Figura 1, con serie di time-lapse immagini dell'i...

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Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Qui, presentiamo protocolli per visualizzare le risposte di calcio (Ca2 +) indotte dalle cellule HeLa infettate da Shigella. Ottimizzando i parametri di infezione batterica e di imaging con sonde Ca2 + fluorescenti, atipico globali e locali Ca2 + segnali indotti da batteri sopra una vasta gamma di cinetica di infezione sono caratterizzati.

Ca2 + risposte di imaging durante l'infezione delle cellule epiteliali Shigella

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

5.4K Views.  Collège de France. Qui, presentiamo protocolli per visualizzare le risposte di calcio (Ca2 +) indotte dalle cellule HeLa infettate da Shigella. Ottimizzando i parametri di infezione batterica e di imaging con sonde Ca2 + fluorescenti, atipico globali e locali Ca2 + segnali indotti da batteri sopra una vasta gamma di cinetica di infezione sono caratterizzati.

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In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In vitro di Adesione batterica su mammiferi cellule epiteliali

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Uso di<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Isolamento dei mastociti peritoneo-derivati e loro caratterizzazione funzionale con Ca2 +-imaging e degranulazione saggi

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Ca^{2 +} risposte di imaging durante l'infezione delle cellule epiteliali Shigella

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