Questo progetto è stato finanziato dall'Università del Nebraska Medical Center (fondi di Start-up, MC-S); NIH-COBRE, 5P20GM103480 (T. jakzrobic) e l'American Chemical Society, PRF # 57434-DNI7(MC-S).

1. generale protocollo per la sintesi di PPA
<ol><li>Calcolare la scala di sintesi (solitamente mmol). Questa scala è basata sulla massa dell'importo-obiettivo PPA. Tenete a mente che l'efficienza di reazione di SPPS diminuisce gradualmente con un aumento di sequenza dell'amminoacido. Di conseguenza, l'efficienza di reazione esatta è difficile da calcolare.</li>
	<li>Calcolare il peso della resina da impiegare secondo il caricamento della resina. Il caricamento è trovato sul contenitore o il protocollo di analisi della resina ed espressa in mmol/g. La seguente formula può essere utilizzata per calcolare il peso della resina:</li>
	<li>Pesare con attenzione resina di cloruro di 2-chlorotrityl (nel nostro caso il caricamento è ~0.85 mmol)</li>
	<li>Versare la resina in un recipiente di sintesi sinterizzato con le seguenti specifiche: capacità – 50 mL, Fritted disco – 25 mm, porosità – media.</li>
	<li>Aggiungere 15 mL di diclorometano (DCM) alla resina.</li>
	<li>Appone alla nave di sintesi di un agitatore meccanico a velocità variabile (pallone shaker/agitatore) e girare i vasi per un angolo di 45° (o orizzontalmente) per massimizzare l'agitazione.</li>
	<li>Consentire le perle di resina a gonfiarsi per 15 min. gonfiore migliora il rendimento di reazione perché facilita la diffusione molecolare e l'accessibilità al sito attivo, aumentando l'efficienza di accoppiamento.</li>
	<li>Aggiungere 8 equivalenti (2 mmol per scala 0,25 mmol) della poliammina desiderata (spermina, spermidina, Diethyelenetriamine, 1,3-diaminopropane, ecc.) per la resina e lasciare reagire per 5 h. Nota: Un minore periodo di reazione ridurrebbe la resa.</li>
	<li>Fare un Kaiser prova (Vedi Tabella materiali) per confermare il successo accoppiamento del polyamine alla resina. Accoppiamento riuscito delle ammine primarie produce un colore viola/blu, che corrisponde all'ammina libera.</li>
	<li>Proteggere il gruppo di ammina primaria utilizzando 4 equivalenti di 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), disciolti in metanolo anidro (15 mL), agitando la miscela di reazione durante la notte11. Nota: Un tempo di reazione minore riduce il rendimento.</li>
	<li>Eseguire un test di Kaiser. Un'assenza di colore blu da resina perlina conferma protezione riuscita. In caso di esito negativo protezione dell'ammina primaria, ripetere il passaggio precedente.</li>
	<li>Scolare il DCM e lavare le resine due volte con una miscela di DCM e DMF (2:1, 15 mL).</li>
	<li>Sciogliere 20 equivalenti (5 mmol) di-tert butyl di-carbonato (Boc) in DCM (20 mL) e lasciare che la reazione procedere per 3 h.</li>
	<li>Fare un cloranile test (Vedi Tabella materiali) per confermare la completa protezione dell'ammina secondaria. Un test positivo (protezione) produce un colore giallo chiaro o incolore. Ammine secondarie gratis dare un colore verde/blu scuro, mentre le ammine primarie danno un colore rosso.</li>
	<li>Scolare la miscela solvente e lavare due volte con una miscela di DCM e DMF (2:1, 15 mL).</li>
	<li>Aggiungere una soluzione al 2% di idrazina in DMF (10 mL) e agitare per 1 h.</li>
	<li>Fare un Kaiser test per confermare il successo deprotezione dell'ammina primaria.</li>
	<li>
Aggiungere gli aminoacidi desiderati nell'ordine inverso in cui si sarebbe scrivere/disegnare loro. Peptidi sono attratti dalla termini N termini C ma sono sintetizzate in direzione opposta, C a N. Ad esempio, per un PPA che richiedono il peptide seguente nucleo - GLFD-, aggiungere l'acido aspartico (D), seguita da fenilalanina (F), leucina (L) e infine la glicina (G). Nota: Per la maggior parte degli aminoacidi, il cocktail di accoppiamento seguente è adatto per allegato alle resine della poliammina caricata.<ol>
<li>Mescolare 4 equivalenti (1 mmol) dell'amminoacido Fmoc-protetto, 3,95 equivalenti di 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexaﬂuorophosphate (HBTU) e 15 equivalenti di ammina diisopropylethyl (DIPEA).</li>
		<li>Scioglierli in una miscela di DCM e DMF (1:1, 15 mL) e Sonicare il cocktail per 2 min (fino al completo scioglimento).</li>
		<li>Aspettare altri 3-5 min per garantire l'attivazione dell'acido carbossilico dell'aminoacido.</li>
		<li>Aggiungere la miscela di reazione alla nave. Svolgere la reazione per 2-4 h a temperatura ambiente. Nota: Abbiamo trovato le seguenti alternative efficienti per HBTU (che solitamente richiedono minori quantità di aminoacidi e l'agente di accoppiamento): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima.</li>
		<li>Fare un Kaiser test per confermare il successo accoppiamento.</li>
		<li>De-proteggere il Fmoc-gruppo dall'amminoacido aggiungendo una soluzione di 20% di 4-metil piperidine (10 mL) in DMF. Farlo due volte, ogni volta che agitando la miscela di reazione per 15 min. Nota: Un'alternativa efficiente per la rimozione di Fmoc è piperazina/DBU12.<ol>
<li>Eseguire un lavaggio di DCM (15 mL) tra aggiunte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fare un Kaiser test per confermare il successo de-protezione dell'amminoacido.</li>
		<li>Lavare la resina accuratamente per rimuovere tutte le tracce di 4-metil. Lavare la resina due volte con DMF (10ml), ogni lavaggio dura per 5 min e infine con DCM (10 mL) per 10 min.</li>
		<li>Aggiungere tutti gli amminoacidi restanti successivamente ripetere l'accoppiamento e la de-protezione passaggi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Infine, dopo l'accoppiamento di tutti gli aminoacidi necessari, coniugato la coda idrofobica per l'ultimo amminoacido del costrutto della poliammina-peptide:
	<ol>
<li>Aggiungere 10 equivalenti della funzionalità desiderata degli acidi carbossilici a 9,5 equivalenti di HBTU e 12 equivalenti di DIPEA disciolto in DCM e DMF miscela (1:1, 20 mL). Nota: Tenere presente che alcune code potrebbero essere necessario una diversa proporzione di solvente (solitamente un maggiore % di DCM) o l'aggiunta o un altro solvente come N-metilpirrolidone (NMP).</li>
		<li>Sonicare il cocktail per 5 – 10 min fino alla dissoluzione (abbiamo visto richiede più tempo per la coda sciogliere completamente) e aggiungere alla nave. Nota: Per le code contenenti più siti reattivi, dovranno essere protetti prima di accoppiare li.</li>
		<li>Eseguire questa reazione (accoppiamento coda idrofobica) per almeno 5 ore, sebbene si consiglia di portarlo fuori tutta la notte per il massimo rendimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PPA scissione dal supporto solido
Lo scopo di questo passaggio è il clivaggio del PvP dalla resina e per rimuovere i gruppi di protezione di Boc dalla aminoacidi ed i residui delle poliammine.
<ol><li>Lavare la resina con DMF (8 mL per 2 min) e due volte con DCM (8 mL, ogni volta per 5 min). Prima di ogni aggiunta, è necessario svuotare il solvente dalla nave. Una volta che viene eseguita l'ultimo lavaggio, asciugare la resina sotto vuoto per 15 min.</li>
	<li>Preparare la soluzione di clivaggio utilizzando il seguente rapporto di miscela: 28:1:1 acido trifluoroacetico (TFA): H2O: Triisopropyl Silano (suggerimenti). Per prenotare 15 mL della fenditura cocktail 14 mL di TFA, aggiungere 0,5 mL di H2O e 0,5 mL di suggerimenti.</li>
	<li>Aggiungere questa soluzione di fenditura alla resina e agitare per 2 – 4 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Raccogliere la soluzione in 25 o 50 mL pallone da....</li>
	<li>Concentrare il TFA nel vuoto a 1 – 2 mL utilizzando un evaporatore rotante a pressione ridotta mentre riscaldando la miscela a 40 ° C (non superare i 55 ° C per evitare la decomposizione del PvP).</li>
	<li>Dopo evaporazione, aggiungere la soluzione ottenuta TFA (goccia a goccia) in un matraccio da fondo tondo contenente etere anidro freddo (15 mL). Questo verrà immediatamente precipitare il PPA.</li>
	<li>Inoltre, è possibile aggiungere anidro freddo etere (5 mL) al pallone originale dove si concentrava il TFA.</li>
	<li>Sonicare questa boccetta per recuperare ulteriori solidi e si combinano con la soluzione di etere dal punto 2.6. Nota: La pipetta di trasferimento può essere lavata con un piccolo volume di DCM. Evitare di introdurre DMF durante il processo, perché tende a formare una sostanza gelatinosa.</li>
	<li>Posizionare il pallone (coperto) all'interno del frigorifero e lasciate riposare una notte per massimizzare la precipitazione.</li>
	<li>Raccogliere il materiale precipitato utilizzando un disco sinterizzato filtro imbuto di filtrazione sotto vuoto. Le dimensioni dei pori ideale sono fini o medio.</li>
	<li>Lavare il precipitato due volte con etere freddo (5 – 10 mL) per rimuovere eventuali sostanze organiche residue.</li>
</ol>3. identificazione del prodotto grezzo utilizzando il metodo di goccia secchi MALDI
<ol><li>
Preparazione della matrice per l'analisi in modalità positiva:
	<ol>
<li>Per iniziare a peso molecolare analisi mediante spettrometria di massa Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI), aggiungere 10-20 mg di acido α-ciano-4-idrossicinnamico ad un tubo del microcentrifuge.</li>
		<li>Aggiungere una soluzione di acqua/acetonitrile (1:1, 1,0 mL) con 0,1% acido trifluoroacetico (TFA). Mescolare nel Vortex. Nota: Questa matrice deve essere utilizzata per peptidi caricati positivamente. Modalità negativa MALDI è simile ma richiede una matrice contenente 9-aminoacridine con 0,1% ammoniaca come solvente additivo.</li>
		<li>Aggiungere 1-2 µ l del campione per la piastra in acciaio inox per MALDI e asciugare il campione in aria. Aggiungere 1-2 µ l della matrice e asciugare di nuovo. Nota: Le piastre hanno marcature circolari griglia lungo la piastra di destinazione per individuare il punto particolare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare i campioni in strumento MALDI per verificare la loro identità. Ionizzazione electrospray (ESI) è una valida alternativa per confermare l'identità della PPA.</li>
</ol>4. purificazione di PPA tramite purificazione preparativa inverso-fase ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC)
<ol><li>
Sciogliere il precipitato di PPA in una quantità minima di acqua e acetonitrile.
	<ol>
<li>Come regola generale, sciogliere 100 mg del greggio secco PPA in meno di 5 mL di acetonitrile e acqua. Più idrofobo PPA potrebbe richiedere una maggiore percentuale di acetonitrile per sciogliere e potrebbe inoltre richiedere un più grande volume di solvente in generale, a seconda della carica netta di PPA (tabella 1).</li>
		<li>Se la dissoluzione completa non ha luogo, aggiungere 1% TFA (ACN o H2O). È anche possibile aggiungere tracce di altri solventi compatibili tra cui dimetilsulfossido, metanolo o isopropanolo (limitare il loro contenuto al 5%).</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solvente</td>
			<td colspan="2">Carica positiva PPAs</td>
			<td colspan="2">Carica negativa PPAs</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">0,1 TFA % in acqua</td>
			<td colspan="2">0,1% NH3 in acqua</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">0,1% TFA in ACN</td>
			<td colspan="2">0,1% NH3 in ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: sistemi solvente. Proposto sistema solvente per PPA a carico positivamente e negativamente.
<ol start="2"><li>Sonicare il PPA utilizzando un sonicatore corno per 20 min a 10 impulsi s con Amp1 del 48% o per 2-3 h in bagno ad ultrasuoni.</li>
	<li>
Quindi, di filtrare usando un filtro di 0,45 μm siringa seguito da filtrazione utilizzando un filtro di siringa di politetrafluoroetilene (PTFE) 0.20 μm. La soluzione di PPA deve essere limpida e priva di tutti i materiali in polvere.
	<ol>
<li>Se la filtrazione è troppo difficile, Sonicare per un periodo prolungato di tempo. Si consiglia vivamente che la soluzione di PPA è purificata immediatamente dopo filtrazione siringa, come stoccaggio prolungato potrebbe causare per aggregare o gelate, che richiederà un ri-sonicazione e, forse, ri-filtrazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durante e dopo la purificazione, utilizzare solventi HPLC grade o quelli che vengono filtrati attraverso un 0,25 μm siringa filtro/membrana. Nota: Le condizioni più comuni solventi per purificare PPA consistono in una sfumatura di H2O e ACN.</li>
	<li>Utilizzare uno strumento HPLC di inverso-fase standard per questo protocollo. Esso dovrebbe includere un programmatore di gradiente di eluizione, un sistema binario di consegna solvente, un rivelatore UV in grado di rilevare a 220 e 254 nm e un collezionista di frazione programmabile. La portata massima deve essere di 50 mL/min.</li>
	<li>Uso un C-18 invertito colonna in fase di separazione. Colonne delle dimensioni seguenti possono essere utilizzate in funzione della massa del solido viene purificato e rete carica del PvP (tabella 2).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Carica di PPA</td>
			<td>Dimensione delle particelle</td>
			<td>Dimensione della colonna</td>
			<td>Massa di greggio PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ ve cariche</td>
			<td>5 μm.</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>-ve cariche</td>
			<td>5 μm.</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ ve cariche</td>
			<td>5 μm.</td>
			<td>150 x 21.2 mm</td>
			<td>90 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>-ve cariche</td>
			<td>5 μm.</td>
			<td>150 x 21.2 mm</td>
			<td>90 mg</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: suggerito colonne: Dimensioni della colonna, dimensioni delle particelle e la capacità di carico massimo per iniezione per C18 reverse colonne HPLC fase
<ol start="7"><li>Iniettare PPA con un volume determinato di sia la capacità della colonna e dal volume del ciclo iniezione di HPLC. Eseguire il metodo del gradiente di HPLC secondo le impostazioni visto in tabella 3 (tempo di eluizione di 40 min).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tempo</td>
			<td>Solvente A (Acetonitrile)</td>
			<td>Solvente B (acqua)</td>
			<td>Portata (mL/min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
			<td rowspan="5">Portata dipende l'imballaggio di colonna e le sue dimensioni.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
<tr>
<td>35</td>
			<td>95%</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>38</td>
			<td>100%</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: gradiente suggerito: Gradiente di fase inversa suggerito la relativa composizione di acqua vs acetonitrile in un periodo di tempo. La portata dipende le specifiche di colonna.
<ol start="8"><li>
Analizzare le frazioni raccolte sulle varie provette usando MALDI e determinare quale tubo (o tubi) contengono il PPA. Questo requisito viene valutato studiando il peso molecolare trovato in ogni provetta.
	<ol>
<li>Verificare la purezza delle frazioni su un HPLC analitica. Utilizzare un sistema di HPLC-gradiente dotato di un rivelatore UV impostato a 220 nm.</li>
		<li>Se sono presenti impurità, fare un ulteriore ciclo di purificazione mediante HPLC. Sfumatura sopra utilizzata per HPLC preparatorio può essere scalata verso il basso da utilizzare con l'HPLC analitica utilizzando il software online convertitore di colonna. Ogni frazione molto essere ≥ 95% puro per la caratterizzazione fisica o valutazione biologica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere le frazioni in un pallone a fondo rotondo grande o il pallone di evaporazione e rimuovere tutti l'acetonitrile e la maggior parte dell'acqua. La soluzione finale di PPA dovrebbe essere non più di 10 mL.</li>
	<li>Trasferire questo concentrato di un tubo di centrifuga da 50 mL. Sappiate che PPA è sostanze detergenti simili; così, bolle verranno generate durante l'evaporazione del solvente. Abbiamo trovato che l'aggiunta di alcole etilico diminuisce la formazione di bolle.</li>
	<li>Concentrato di vuoto il concentrato. Durante l'evaporazione sotto vuoto, una grande quantità di PPA potrebbe aderire alle pareti del contenitore. Recuperare questo risciacquando ripetutamente il muro pallone con acqua di HPLC. Il volume totale di PPA concentrato e il rinsate dovrebbe essere non più di 30 mL.</li>
	<li>Posto la soluzione acquosa all'interno di un tubo da 50 mL.</li>
	<li>
Flash congelare questa soluzione PPA in azoto liquido: Nota: Flash congelamento risultati più piccoli cristalli di ghiaccio che sarà sublime più velocemente nei liofilizzatori. Inoltre, più lento congelamento potrebbe consentire la formazione di strutture supramolecolari auto-assemblate. Un'altra alternativa (ma meno auspicabile) è gradualmente congelare in un congelatore a-80 ° C o di congelare utilizzando un ghiaccio secco + miscela di acetone<ol>
<li>Prima di mettere la provetta da centrifuga nei liofilizzatori, perforare o allentare il tappo della provetta per permettere all'umidità di sfuggire il campione e ottenere raccolti nell'unità di refrigerazione. Impostare l'unità di liofilizzazione impostata-54 ° C e 0,016 mbar. Nota: Un'altra opzione è di rimuovere il tappo e collocare un tampone imbevuto (con un elastico) sopra l'apertura. Inoltre, abbiamo scoperto che permette di congelare campioni ad angolo o rompere il ghiaccio in piccole porzioni per una più veloce e migliore liofilizzazione a causa di un incremento della superficie.</li>
		<li>Se il solido inizia a sciogliersi, ciò potrebbe indicare che sono presenti tracce di un solvente organico (solitamente acetonitrile). Ripetere il passaggio di congelamento e valutare le condizioni della liofilizzazione.</li>
		<li>Se la fusione persiste, ci sono due possibili soluzioni:<ol>
<li>Split il campione in due porzioni (per essere inserito in tubi), diluire con acqua e congelare di nuovo. Non utilizzare questa soluzione spesso perché grandi quantità di solventi organici potrebbe danneggiare l'attrezzatura.</li>
			<li>In alternativa, posizionare il campione in una beuta e ulteriormente far evaporare il solvente organico sotto vuoto. Liofilizzazione un campione che è in forma liquida di solito porta a urtare e perdita del composto PPA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. deposito di PPA
<ol><li>Conservare la PPA in un da-20 ° C con i tappi serrati e sigillato con Parafilm su un tubo con un'etichetta adeguata.</li>
	<li>Prima dell'uso, portare il PPA torna a temperatura ambiente in una camera a vuoto per evitare la condensazione del vapore acqueo sulla PPA.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+and+x-ray-triggered+crystallization+at+long+range+in+self-assembling+filament+networks.">Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks.</a> Science. 327, 555-559 (2010).</li><li>Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+supramolecular+rigidity+of+peptide+fibers+through+molecular+structure.">Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).</li><li>Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+biomolecular+soft+matter.">Self-assembly of biomolecular soft matter.</a> Faraday Discussions. 166, 9-30 (2013).</li><li>Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterase-activated+release+of+naproxen+from+supramolecular+nanofibres.">Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres.</a> Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).</li><li>Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+biomolecules+for+nanoengineered+biomaterials+for+regenerative+medicine.">Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine.</a> Nanotechnology in Regenerative Medicine. , 39-49 (2012).</li><li>Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Polyamine-Based+Peptide+Amphiphiles+with+Tunable+Morphology+and+Physicochemical+Properties.">Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties.</a> Macromolecular bioscience. 17, (2017).</li><li>Nel, A. E., M&#228;dler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+biophysicochemical+interactions+at+the+nano-bio+interface.">Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface.</a> Nature Materials. 8, 543 (2009).</li><li>Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+cationic+lipid-based+nanoparticles+facilitate+endosomal+escape+and+reduction-triggered+cytosolic+siRNA+release.">Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release.</a> Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).</li><li>Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupicky&#769;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-immolative+polycations+as+gene+delivery+vectors+and+prodrugs+targeting+polyamine+metabolism+in+cancer.">Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer.</a> Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).</li><li>Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-containing+amine+oxidases+contribute+to+terminal+polyamine+oxidation+in+peroxisomes+and+apoplast+of+Arabidopsis+thaliana.">Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biology. 13, 109 (2013).</li><li>Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dde+-+A+selective+primary+amine+protecting+group:+A+facile+solid+phase+synthetic+approach+to+polyamine+conjugates.">Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates.</a> Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).</li><li>Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piperazine+and+DBU:+a+safer+alternative+for+rapid+and+efficient+Fmoc+deprotection+in+solid+phase+peptide+synthesis.">Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis.</a> RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).</li><li>Casero, R. A., Marton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+polyamine+metabolism+and+function+in+cancer+and+other+hyperproliferative+diseases.">Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373 (2007).</li><li>Wuts, P. G. M., Greene, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protection for the Amino Group. In Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. , 696-926 (2006).</li><li>Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+racemization+and+aspartimide+formation+in+microwave-enhanced+Fmoc+solid+phase+peptide+synthesis.">Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis.</a> Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per dichiarare

I protocolli descritti qui possono essere utilizzati per sintetizzare PPA come pozzi come PAs e relative molecole peptidici (ad esempio di ibrido PA-peptoids). Anche se la sintesi di peptidi utilizzando SPPS è una procedura semplice, la sintesi di peptidi contenenti molecole biologiche homing può essere particolarmente impegnativa. Poliammine come spermina, spermidina, diethyelenetriamine, ecc., possono funzionare come molecole homing per il targeting cancro cellule13. Il PPA possa assemblarsi in nanostrutture con diverse morfologie6. Loro carica positiva può anche aiutare con un diverso profilo metabolico (se confrontato con il PA tradizionale) e più lungo tempo di circolazione (a causa di fuga endosomal). Tuttavia, sintetizzando PPA e loro analoghi può essere una sfida particolare per la presenza di ammine primarie e secondarie. La strategia sintetica presentata supera questa sfida l'uso razionale del gruppo protezione ortogonale. La molecola di Dde subisce in modo selettivo reazione solo con ammine primarie11. BOC, d'altra parte, indiscriminatamente reagisce con le ammine primarie e secondarie e, pertanto, può essere aggiunta solo dopo l'ammina primaria è protetto. Vorremmo ricordare che altri gruppi di protezione possono essere utilizzati invece di Boc. Ad esempio, reazione con l'anidride acetica sarà definitivamente acetilano le ammine secondarie (questo gruppo non verrà rimosso durante la scissione). Allo stesso modo, l'uso di anidride trifluoacetic fornirà una protezione di base sensibile mentre il benzylcarbamate darà un gruppo che può essere rimosso da H2/Ni14. Una volta che le poliammine sono protetti secondo le necessità, la sintesi del PvP può procedere utilizzando standard SFF. L'accoppiamento la coda idrofobica al resto del costrutto della poliammina-peptide richiede non solo un periodo di tempo più lungo per coppia, ma richiede anche il doppio della quantità molare di aminoacidi. Alcune delle code idrofobiche non potrebbe sciogliere bene a temperatura ambiente in alcuni solventi tradizionali o può precipitare anche dopo dissoluzione iniziale. Tali reazioni sono meglio effettuate sotto lieve riscaldamento (40 ° C) trasferendo tutti i reagenti per il pallone. In alternativa, potrebbe essere utilizzato un recipiente rivestito sintetizzatore per scaldarsi i reattivi durante la reazione. Se disponibile, un sintetizzatore a microonde può essere di aiuto con l' accoppiamento15.
Anche se molte forme di spettroscopia di massa sono disponibili per determinare le masse di PPA, abbiamo usato la spettroscopia MALDI ai fini della nostra identificazione. Abbiamo trovato MALDI per essere più efficaci nel produrre le cime dello ione molecolare, riducendo al minimo la frammentazione e la formazione del complesso. MALDI dovrebbe essere programmato per generare un ione che corrisponde allo stato di ionizzazione più probabile del PvP. Oltre alla programmazione dello strumento per produrre ioni di una carica particolare, abbiamo anche bisogno di combinare i campioni con la matrice appropriata che è adatta per la modalità che useremo.
PAs hanno spesso la tendenza a forma addotti sale sulla piastra MALDI. Questo problema si verifica più spesso con le molecole caricate negativamente. Il più comune sali sono quelli di sodio (Na+ = 23 Da) e potassio (K+ = Da 39). Questi addotti maggio essere soppressi con l'aggiunta di 1 – 2 µ l di acido acetico. Il PPA di solito fornisce H+ del complesso. È consigliabile utilizzare solo nanopore acqua o acqua di HPLC in tutto il sintetico e processo di purificazione per evitare l'introduzione di ulteriori ioni. Contenitori in vetro borosilicato e recipienti di reazione possono contenere quantità apprezzabili di ioni di sodio che percolare nel prodotto finale. Sciacquare la vetreria con cura utilizzando nanopurewater per l'ultimo lavaggio.
Identificare i picchi di ione molecolare diventa anche difficile se la soluzione di matrice non è completamente saturo con la matrice solida. Per garantire la saturazione, dovrebbe esserci sempre una piccola quantità di matrice solida che ha non solubilizzato.
Come nota finale, si prega di considerare che alcuni PPA o PAs non potrebbero formare un precipitato con l'aggiunta di etere. Ciò è stata osservata principalmente nel più idrofilo KDT. In tali eventi, ci prima evaporare tutti etere, neutralizzare il TFA in eccesso con NH4OH e aggiungere acqua e Acetonitrile (con 0,1% TFA o NH4OH) per solubilizzare completamente e quindi proseguire per purificare come al solito.
Il protocollo descritto qui può essere utilizzato per sintetizzare varianti altamente puri di autoassemblanti poliammina basata peptide anfifili (PPA) e anche PAs. La procedura di protezione/deprotezione ortogonale può essere utilizzata in altre situazioni che richiedono mascheramento selettivo dei gruppi amminici primari e secondari.

Autoassemblanti peptide anfifili (PAs) sono una classe di biomateriali in genere composto da segmenti seguenti: (a) idrofilo testa, regione linker (b) e (c) idrofobo. La maggior parte PAs descritti nella letteratura possiedono una testa idrofila composta da cariche o polare dell'amminoacido residui1,2,3,4. PAs hanno trovato una vasta gamma di applicazioni nel campo della biomedicina tra cui la consegna della droga, malattia diagnostica, medicina rigenerativa, ecc5. Base alla loro sequenza dell'amminoacido, PAs può formare un'ampia varietà di nanostrutture tra cui micelle sferiche e nano-filamenti. Recentemente abbiamo segnalato una classe di ibridi basati su poliammina peptide anfifili, chiamato PPA6. Le morfologie, autoassemblanti cinetica e degradazione metabolica, di questi biomateriali, sono stati trovati per essere collegati al loro gruppo testa solubilizzante. Inoltre, le nanostrutture di PPA non hanno mostrato tossicità verso le cellule di mammiferi (linee MiaPaCa2 e delle cellule HeLa) alle concentrazioni testate. Nanovettori basati su PPA sono veicoli di consegna della droga attraente perché: (1) della poliammina assorbimento ed il metabolismo è stato indicato per essere aumentato in cellule cancerogene, nanostrutture (2) cationico può raggiungere endosomal fuga7,8, che conduce alla più alta circolazione e soggiorno all'interno di una cella e (3) dovrebbero avere un distinto profilo metabolico se confrontato con il PA; ad esempio, essi saranno più stabile verso proteasi trovate nel corpo umano (anche se essi forse sensibili ad altri enzimi, quali ammino ossidasi)9,10. Inoltre, PPA è stati trovati per avere diverse morfologie, proprietà fisico-chimiche, rigidità delle nanoparticelle e cinetica di assemblaggio a seconda della lunghezza e carica di singoli PPA molecola6. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la sintesi, la identificazione e la purificazione di PPA che può essere applicato anche alla preparazione di PAs o simili molecole del peptide ibride.
Perché poliamine non sono comunemente disponibili in commercio nelle loro forme protette, e perché proteggere le ammine primarie e secondarie delle poliamine è della massima importanza per loro coniugazione con amminoacidi e altre molecole, che abbiamo descritto il procedura sintetica per raggiungere la loro protezione. L'obiettivo generale del presente protocollo è quello di fornire un metodo semplice per coniugazione poliamine agli aminoacidi. Poliammine mancano un gruppo carbossilico; così, essi non possono essere accoppiate a Rink ammide o resine Wang. Invece, resine come cloruro di 2-chlorotrityl sono raccomandate per il protocollo sintetico. La sfida principale per la sintesi di PPA è la presenza di gruppi funzionali di ammina primaria e secondaria. Per i nostri scopi, abbiamo protetto tutte le ammine secondarie nella poliammina, mantenendo il gruppo amminico primario sulla poliammina libera per consentire la reazione di accoppiamento. La reazione è stato fatto su un supporto solido, seguendo i principi della sintesi del peptide di fase solida (SPPS) per facilitare il work-up dopo ogni passaggio di accoppiamento e deprotezione. Il seguente protocollo è per entrambi la sintesi manuale e automatizzata di PPA (anche se sarà difficile la verifica di alcuni passi in un sistema automatizzato). La sintesi di queste molecole possono anche essere effettuata su un sintetizzatore automatico o con l'ausilio di un reattore a microonde (automatico o semi-automatica). Lo schema di reazione è stata riassunta nella Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57908/57908fig1.jpg"> Figura 1: (A) A regime di reazione generale per la sintesi di PPA. Poliammine rappresentativo (B) che possono essere utilizzati per sintetizzato PPA descritto qui. <a href="/files/ftp_upload/57908/57908fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl chloride resin&#160;</td>
			<td>AappTec</td>
			<td>RTZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynthwareTM synthesis vessel&#160;</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>SYNP120050M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC406920250</td>
			<td>Fisher Sci. Catalogue #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrist Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>401000-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser test kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS004772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Methanol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC610981000</td>
			<td>Fisher Sci. Catalogue #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloranil test kit</td>
			<td>TCI</td>
			<td>TCC1771-KIT</td>
			<td>VWR Catalogue #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert butyl di-carbonate&#160;</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC194670250</td>
			<td>Fisher Sci. Catalogue #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC296815000</td>
			<td>FIsher Sci. Catalogue #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)</td>
			<td>p3biosystems</td>
			<td>31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-methyl piperidine&#160;</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC127515000</td>
			<td>FIsher Sci. Catalogue #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid</td>
			<td>AappTec</td>
			<td>CXZ035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropyl Silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>233781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ether</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E138-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-Aminoacridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Syringe Filters: PTFE Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-730-21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facile protocol for the synthesis of self-assembling polyamine-based peptide amphiphiles (ppas) and related biomaterials

Basato su poliammina Peptide anfifili (PPA) sono una nuova classe di autoassemblanti anfifilici biomateriali-relazionati con il peptide anfifili (PAs). Tradizionale PAs possiedono caricate aminoacidi come solubilizzanti gruppi (lisina, arginina), che sono direttamente collegati ad un segmento del lipido o possono contenere una regione linker fatta di amminoacidi neutri. Messa a punto la sequenza del peptide di PAs può produrre diverse morfologie. Allo stesso modo, PPA possieda un segmento idrofobo e aminoacidi neutri, ma contenga anche molecole di poliammine come acqua solubilizzanti (idrofili) gruppi. Come è il caso con PAs, PPA anche possibile auto-assemblarsi in morfologie diverse, tra cui asticelle, nano-nastri intrecciati e nano-fogli di fuse, quando disciolto in acqua. Tuttavia, la presenza di ammine primarie e secondarie su una molecola singola poliammina pone una sfida significativa quando sintetizzando PPA. In questa carta, indichiamo un protocollo semplice, basato su precedenti di letteratura, di raggiungere una sintesi facile di PPA utilizzando sintesi del peptide di fase solida (SPPS). Questo protocollo può essere esteso alla sintesi di PAs e altri sistemi simili. Abbiamo anche illustrare i passaggi che sono necessari per la scissione da resina, identificazione e purificazione.

Dopo la sintesi e la purificazione e prima valutazione fisico-chimiche o biologiche, è consigliabile le masse della PPA sono ri-controllate e la purezza accertato mediante HPLC analitica. Per la caratterizzazione di materiali o valutazione biologica, PPA necessario disporre di una purezza di > 95%. La figura 2 Mostra l'analisi HPLC (in alto) e spettri MALDI (in basso) che confermano la presenza del prodotto. Sistemi di analisi HPLC integrerà l'area sotto la curva (AUC) e una AUC > 95% possono essere legate alla purezza del prodotto. Nei sistemi basati su UV HPLC, aspettiamo di vedere un picco singolo, tagliente. Gli spettri MALDI dovrebbero corrispondere a quella del peso molecolare calcolato del PvP entro ± 1 Da (a seconda della modalità di analisi di MALDI).
L'auto-assemblaggio della PPA possono essere visualizzati e analizzati usando tecniche una miriade, compreso microscopia elettronica in trasmissione (TEM) (Figura 3A, B), microscopia a forza atomica (AFM) (Figura 3, D), piccolo angolo di raggi x Dispersione (SAXS), microscopia elettronica (SEM), e Dynamic Light Scattering (DLS). Successful autoassemblaggio si tradurrà in nanostrutture ben definito in TEM e AFM. Errore di auto-assemblarsi comporterà sia la formazione di aggregati irregolari che sono diverse centinaia di nanometri di dimensione.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57908/57908fig2.jpg"> Figura 2: Cromatogramma HPLC analitica rappresentante (in alto) e spettro MALDI (in basso) del PPA C16V2un2spermina. Questa figura è stata modificata da Samad et al 20176; riutilizzato con il permesso di John Wiley & Sons, 2018. <a href="/files/ftp_upload/57908/57908fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57908/57908fig3.jpg"> Figura 3: microfotografia microscopio elettronico (TEM) rappresentante trasmissione. (A) TEM immagine mostra la formazione di nanofibra e fusa nanosheets, (B) Magnified inserto mostrando la formazione di pacchi di nano-, (C) atomica della forza micrografo di microscopia (AFM), (D) e altezza mappa derivata dalla Micrografo per C16V2A2KDiethyelenetriamine. Gli assi X e Y di (D) rappresenta rispettivamente nano-foglio larghezza e altezza di nano-foglio. Questa figura è stata modificata da Samad et al 20176; riutilizzato con il permesso di John Wiley & Sons, 2018. <a href="/files/ftp_upload/57908/57908fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles PPAs and Related Biomaterials

La sintesi delle poliammine-basato del peptide anfifili (PPA) è una sfida significativa per la presenza di multiple azoti ammina, che richiede l'uso giudizioso di proteggere i gruppi per mascherare queste funzionalità reattive. In questo articolo, descriviamo un metodo facile per la preparazione di questi nuova classe di molecole autoassemblanti.

Facile protocollo per la sintesi di auto-assemblaggio basato su poliammina Peptide anfifili (PPA) e biomateriali correlate

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). ...

facile-protocol-for-synthesis-self-assembling-polyamine-based-peptide

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials

8.0K Views.  University of Nebraska Medical Center. La sintesi delle poliammine-basato del peptide anfifili (PPA) è una sfida significativa per la presenza di multiple azoti ammina, che richiede l'uso giudizioso di proteggere i gruppi per mascherare queste funzionalità reattive. In questo articolo, descriviamo un metodo facile per la preparazione di questi nuova classe di molecole autoassemblanti.

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

Produzione di disolfuro-stabilizzati peptide transmembrana per gli studi strutturali

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Ricerca

Chimica

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

Split-e-pool Sintesi e caratterizzazione di peptidi Terziario Ammide Biblioteca

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

A Direct, Early Stage Guanidinylation Protocol for the Synthesis of Complex Aminoguanidine-containing Natural Products

The guanidine functional group, displayed most prominently in the amino acid arginine, one of the fundamental building blocks of life, is an important structural element found in many complex natural products and pharmaceuticals. Owing to the continual discovery of new guanidine-containing natural products and designed small molecules, rapid and efficient guanidinylation methods are of keen interest to synthetic and medicinal organic chemists. Because the nucleophilicity and basicity of guanidines can affect subsequent chemical transformations, traditional, indirect guanidinylation is typically pursued. Indirect methods commonly employ multiple protection steps involving a latent amine precursor, such as an azide, phthalimide, or carbamate. By circumventing these circuitous methods and employing a direct guanidinylation reaction early in the synthetic sequence, it was possible to forge the linear terminal guanidine containing backbone of clavatadine A to realize a short and streamlined synthesis of this potent factor XIa inhibitor. In practice, guanidine hydrochloride is elaborated with a carefully constructed protecting array that is optimized to survive the synthetic steps to come. In the preparation of clavatadine A, direct guanidinylation of a commercially available diamine eliminated two unnecessary steps from its synthesis. Coupled with the wide variety of known guanidine protecting groups, direct guanidinylation evinces a succinct and efficient practicality inherent to methods that find a home in a synthetic chemist&#39;s toolbox.

Here, we present a protocol for direct, early stage guanidinylation that enables rapid total synthesis of aminoguanidine-containing small organic molecules. An advanced synthetic intermediate used in the synthesis of a blood coagulation factor XIa inhibitor was prepared using this protocol.

Un diretto, Early Stage Guanidinylation protocollo per la sintesi di complessi Aminoguanidine contenenti prodotti naturali

The guanidine functional group, displayed most prominently in the amino acid arginine, one of the fundamental building blocks of life, is an important ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of trifluoromethoxylated aromatic compounds remains a formidable challenge in organic synthesis. Conventional approaches often suffer from poor substrate scope, or require use of highly toxic, difficult-to-handle, and/or thermally labile reagents. Herein, we report a user-friendly protocol for the synthesis of methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate using 1-trifluoromethyl-1,2-benziodoxol-3(1H)-one (Togni reagent II). Treating methyl 4-(N-hydroxyacetamido)benzoate (1a) with Togni reagent II in the presence of a catalytic amount of cesium carbonate (Cs2CO3) in chloroform at RT afforded methyl 4-(N-(trifluoromethoxy)acetamido)benzoate (2a). This intermediate was then converted to the final product methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate (3a) in nitromethane at 120 &#176;C. This procedure is general and can be applied to the synthesis of a broad spectrum of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives, which could serve as useful synthetic building blocks for the discovery and development of new pharmaceuticals, agrochemicals, and functional materials.

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

An operationally simple procedure for the synthesis of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives via a two-step sequence of O-trifluoromethylation of N-aryl-N-hydroxyacetamide followed by thermally induced intramolecular OCF3-migration is reported.

Protocollo per la sintesi di<em&gt; Ortho</em&gt; Derivati ​​all&#39;anilina -trifluoromethoxylated

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins with the synthesis of a hydrophilic poly(oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) (POEGMA) homopolymer using reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization. Under mild visible light irradiation (&#955; = 460 nm, 0.7 mW/cm2), this macro-chain transfer agent (macro-CTA) in the presence of a ruthenium based photoredox catalyst, Ru(bpy)3Cl2 can be chain extended with a second monomer to form a well-defined block copolymer in a process known as Photoinduced Electron Transfer RAFT (PET-RAFT). When PET-RAFT is used to chain extend POEGMA with benzyl methacrylate (BzMA) in ethanol (EtOH), polymeric nanoparticles with different morphologies are formed in situ according to a polymerization-induced self-assembly (PISA) mechanism. Self-assembly into nanoparticles presenting POEGMA chains at the corona and poly(benzyl methacrylate) (PBzMA) chains in the core occurs in situ due to the growing insolubility of the PBzMA block in ethanol. Interestingly, the formation of highly pure worm-like micelles can be readily monitored by observing the onset of a highly viscous gel in situ due to nanoparticle entanglements occurring during the polymerization. This process thereby allows for a more reproducible synthesis of worm-like micelles simply by monitoring the solution viscosity during the course of the polymerization. In addition, the light stimulus can be intermittently applied in an ON/OFF manner demonstrating temporal control over the nanoparticle morphology.

This article describes a process for producing polymeric self-assembled nanoparticles using visible light mediated dispersion polymerization. Using low energy visible light to control the polymerization allows for the reproducible formation of self-assembled worm-like micelles at high solids content.

Sintesi facile di micelle vermiforme dalla luce visibile mediata polimerizzazione in dispersione Utilizzando Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Self-assembling Morphologies Obtained from Helical Polycarbodiimide Copolymers and Their Triazole Derivatives

A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous networks, ribbons, worm-like aggregates, toroidal structures, and spherical particles) is described. These aggregates are morphologically influenced by extensive hydrophobic side chain-side chain interactions of the singular polycarbodiimide strands, as inferred by atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) techniques. Polycarbodiimide-g-polystyrene copolymers (PS-PCDs) were prepared by a combination of synthetic methods, including coordination-insertion polymerization, copper(I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition (CuAAC) &#34;click&#34; chemistry, and atom transfer radical polymerization (ATRP). PS-PCDs were found to form specific toroidal architectures at low concentrations in CHCl3. To determine the influence of a more polar solvent medium (i.e., THF and THF/EtOH) on polymer aggregation behavior, a number of representative PS-PCD composites have been tested to show discrete concentration-dependent spherical particles. These fundamental studies are of practical interest to the development of experimental procedures for desirable architectures by directed self-assembly in thin film. These architectures may be exploited as drug carriers, whereas other morphological findings represent certain interest in the area of novel functional materials.

Here, we present a protocol to prepare and visualize secondary structures (e.g., fibers, toroidal architectures, and nano-spheres) derived from helical polycarbodiimides. The morphology characterized by both atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) was shown to depend on molecular structure, concentration, and the solvent of choice.

Morfologie autoassemblanti Ottenuto da elicoidali policarbodiimide copolimeri e loro derivati ​​triazolici

A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

Protocollo per la sintesi in fase solida di oligomeri di RNA contenente un 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethyl Modifica e caratterizzazione attraverso il Dicroroo circolare

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Facile protocollo per la sintesi di auto-assemblaggio basato su poliammina Peptide anfifili (PPA) e biomateriali correlate

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Produzione di disolfuro-stabilizzati peptide transmembrana per gli studi strutturali

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D ¹H NMR

Split-e-pool Sintesi e caratterizzazione di peptidi Terziario Ammide Biblioteca

Un diretto, Early Stage Guanidinylation protocollo per la sintesi di complessi Aminoguanidine contenenti prodotti naturali

Protocollo per la sintesi di

Sintesi di proteine bioconiugati

Sintesi facile di micelle vermiforme dalla luce visibile mediata polimerizzazione in dispersione Utilizzando Photoredox Catalyst

Morfologie autoassemblanti Ottenuto da elicoidali policarbodiimide copolimeri e loro derivati triazolici

Protocollo per la sintesi in fase solida di oligomeri di RNA contenente un 2'-

Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids

Facile protocollo per la sintesi di auto-assemblaggio basato su poliammina Peptide anfifili (PPA) e biomateriali correlate

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