Name: synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
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Gli autori vorrei ringraziare il signor Michael Connolly e Dr. Ronald Zuckermann (The Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory) per l'assistenza tecnica in sintesi peptoid. Riconosciamo il sostegno della National Science Foundation (-1301505). Tutti gli esperimenti di spettrometria di massa sono stati condotti presso l'impianto di spettrometria di massa di chimica presso l'Università del Pacifico.

1. sintesi di Peptoid
Nota: La sintesi inizia con la resina di attivazione gonfiore la resina e rimuovendo il gruppo di protezione. Questa è seguita da una crescente della catena di peptoid sulla resina attraverso ripetuti cicli di aggiunta del monomero. Il primo monomero accoppiato alla resina è il residuo del C-terminale. Il peptoid è allungata da C-terminale a N-terminale. Una volta ottenuta la sequenza desiderata peptoid, la resina viene clivata off e il prodotto peptoid è purificato.
<ol><li>Preparazione dei reagenti Nota: I reagenti liquidi sono misurati utilizzando una micropipetta e i reagenti solidi vengono misurati utilizzando una bilancia analitica.<ol>
<li>Mescolare 6,2 mL di N, n' '-diisopropylcarbodiimide (DIC) e 43,8 mL di N, N-dimetilformammide (DMF) per preparare un 0,8 M della soluzione DIC/DMF.</li>
		<li>Sciogliere g 5,56 di BMA in 50,0 mL di DMF per preparare una soluzione di 0,8 M BMA/DMF.</li>
		<li>Mescolare 2 mL di piperidina (Pip) e 8 mL di DMF per ottenere 20% soluzione di Pip/DMF.</li>
		<li>Sciogliere 1,9 mL di Npe in 13,1 mL di DMF per raggiungere 1.0 M Npe/DMF.</li>
		<li>Sciogliere 1,3 mL di Nme in 13,7 mL DMF per raggiungere 1.0 M Nme/DMF.</li>
		<li>Sciogliere 0,32 mL di Nae in 2 mL di DMF per raggiungere 1.0 M Nae/DMF. Attenzione: la maggior parte delle sostanze chimiche utilizzate nella sintesi sono pericolosa. Acido trifluoroacetico (TFA), DIC, Pip e BMA sono pericolosi per la pelle, occhi e vie respiratorie. DMF e diclorometano (DCM) sono sospetti cancerogeni. Tutte le reazioni devono essere eseguite in una cappa aspirante e appropriati dispositivi di protezione individuale devono essere utilizzato. Si prega di controllare il foglio di dati materiale di sicurezza (MSDS) di tutte le sostanze chimiche utilizzate nella sintesi.</li>
	</ol></li>
	<li>Attivazione di resina
	<ol>
<li>Misurare 84 mg di resina di ammide Rink (resina, 0.047 mmol, caricamento 0,56 mmol/g) e aggiungerlo ad un vaso di reazione di fase solida in polipropilene da 10 mL. Inserire lo stantuffo nel recipiente.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di DMF per il recipiente di reazione e tappo il recipiente con un tappo a pressione. Posizionare il vaso su uno shaker e agitare il recipiente a temperatura ambiente con un angolo di movimento di circa 12 gradi e 385 oscillazioni/min per 30 min. scarico la soluzione a un contenitore per rifiuti rimuovendo il tappo e lo stantuffo del recipiente di reazione.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di soluzione di Pip/DMF 20% alla nave e la nave di cap. Agitare su agitatore per 2 min e svuotare la soluzione nel contenitore dei rifiuti.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di soluzione di Pip/DMF 20% alla nave, tappo serbatoio e agitare a temperatura ambiente per 12 min. Rimuovi il tappo e svuotare la soluzione nel contenitore dei rifiuti.</li>
		<li>Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DMF, tappatura della nave e agitando il vaso per un minimo di 1 Togliere il tappo e svuotare la soluzione premendo lo stantuffo. Lavare la resina con DMF per altre 4 volte.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiunta del monomero e acetilazione del N-terminale Nota: Ogni ciclo di aggiunta del monomero comporta lo spostamento, bromoacetylation e reazione a due passi.<ol>
<li>Eseguire il primo ciclo di aggiunta del monomero a forma Nme-resina.</li>
		<li>Eseguire una reazione di bromoacetylation. Mescolare 1 mL di soluzione di 0,8 M BMA/DMF e 1 mL di soluzione di 0,8 M DIC/DMF in un becher. Trasferire il composto in un recipiente di reazione contenente la resina e la nave di cap. Posizionare il vaso su shaker e agitare a temperatura ambiente per 20 min. Rimuovi il tappo e svuotare la soluzione nel contenitore dei rifiuti.</li>
		<li>Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DMF, tappatura della nave, d'agitazione per 1 min e drenante la soluzione premendo lo stantuffo. Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DCM, agitando il vaso per 1 min, e la soluzione di drenaggio. Lavare la resina con DCM ancora una volta e poi lavare con DMF due volte.</li>
		<li>Eseguire una reazione di spostamento. Aggiungere 1 mL di soluzione di 1,0 M Nme/DMF, la nave di cap, agitare il recipiente a temperatura ambiente per 60 min. Rimuovi il tappo e drenare la soluzione premendo lo stantuffo.</li>
		<li>Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DMF, agitando il vaso per 1 min e drenante la soluzione premendo lo stantuffo. Lavare la resina disegnando in 1 mL di Diclorometano, agitare per 1 min, e la soluzione di drenaggio. Lavare DCM una volta di più, seguita da lavaggio con DMF due volte.</li>
		<li>Ripetere i cicli di aggiunta del monomero da passaggi 1.3.2 a 1.3.5 per formare Nae-(Npe-Nme)4-resina. Quando si ripete il passaggio della reazione di spostamento (1.3.4), utilizzare una soluzione di ammina specifico in base alla sequenza di peptoid. Nota: La catena peptoid è allungata da C-terminale a N-terminale con il residuo del C-terminale associato alla resina.</li>
		<li>Eseguire acetilazione del N-terminale per formare Ac-Nae-(Npe-Nme)4-resina.</li>
		<li>Anidride acetica mix 92 µ l della, 43,5 µ l di N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) e 2 mL di DMF in un becher per fare cocktail circa 2 mL di acetilazione.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di acetilazione cocktail al recipiente contenente la resina, la nave di cap e agitare a temperatura ambiente per 60 min. Togliere il tappo e svuotare la soluzione premendo lo stantuffo.</li>
		<li>Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DMF, agitando il vaso per 1 min e drenante la soluzione premendo lo stantuffo. Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DCM, agitando il vaso per 1 min, e la soluzione di drenaggio. Ripetere il lavaggio della resina con DCM ancora una volta, quindi lavare con DMF altre due volte.</li>
		<li>Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DCM, agitando il vaso per 1 min e drenante la soluzione premendo lo stantuffo. Ripetere il lavaggio due volte con DCM. Rimuovere il tappo e lasciare che la resina asciugare all'aria nel vaso di reazione per 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Clivaggio e purificazione
	<ol>
<li>Mescolare 3,8 mL di TFA, 100 µ l di triisopropylsilane (suggerimenti) e 100 µ l di grado HPLC H2O in un becher per fare cocktail 4 mL di clivaggio.</li>
		<li>Aggiungere 4 mL di preparata clivaggio cocktail al recipiente contenente la resina, la nave di cap e agitare a temperatura ambiente per 2 h.</li>
		<li>Rimuovere il tappo e raccogliere la soluzione filtrato in una provetta da centrifuga polipropilene 50 mL. Aggiungere 1 mL di TFA al vaso, tappo e agitare per 1 minuto raccogliere la soluzione filtrato nella stessa provetta da centrifuga.</li>
		<li>Evaporare TFA soffiando delicatamente in un flusso di gas di azoto fino a circa 1 mL soluzione viscosa è a sinistra.</li>
		<li>Aggiungere 15 mL di etere etilico per la soluzione rimanente, tappo della provetta da centrifuga e viene quindi incubato in un congelatore a-20 ° C per 2 h per una notte. Il greggio peptoid precipita come solido bianco.</li>
		<li>A pellet il solido utilizzando una centrifuga a 4.427 x g per 10 min. Rimuovi il tappo della provetta centrifugo e decantare etere etilico in un becher con attenzione senza perdere il solido. Attenzione: l'etere dietilico è un solvente organico infiammabile. Si prega di utilizzare una centrifuga di sicuro di etere etilico.</li>
		<li>Lavare il solido con l'aggiunta di 10 mL di etere etilico ghiacciata nella centrifuga tubo contenente il solido, tappatura del tubo e l'immissione nella centrifuga. Eseguire centrifugazione a 4.427 x g per 10 min. Rimuovi la centrifuga tubo da centrifuga e decantare etere etilico in un becher con attenzione senza perdere il solido.</li>
		<li>Asciugare il solido soffiando delicatamente in un flusso di gas azoto.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di grado HPLC H2O per sciogliere il solido essiccato. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di siringa in nylon con dimensione dei pori di 0.45 µm e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga polipropilene pre-pesata 50 mL.</li>
		<li>Shell congelare la soluzione immissione e ruotando la centrifuga provetta contenente la soluzione di peptoid in un 12-ounce, a doppio strato tazza polistirolo espanso 1/3 riempita con azoto liquido. Lyophilize la soluzione congelata durante la notte per produrre peptoid solido.</li>
		<li>Ripetere ancora una volta di liofilizzazione dissolvendo il solido peptoid in 10 mL di grado HPLC H2O, shell congelamento in azoto liquido e liofilizzazione durante la notte. Il peptoid risultante è sufficientemente puro per analisi di sequenza mediante spettrometria di massa.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Sig. ra misure e analisi di sequenza
Nota: L'esperimento di MS/MS viene effettuata in uno spettrometro di massa quadrupole triplice accoppiato ad una sorgente di ionizzazione (ESI) di electrospray. Raccolta dei dati viene controllata tramite il software di acquisizione dati accompagnato con lo strumento. La procedura generale include 1) effettua l'esperimento di spettrometria di massa di scansione completa e registrare lo spettro di massa, 2) eseguire il CID MS/MS sperimentare e registrazione dello spettro MS/MS e 3) confrontando i dati spettrali di MS/MS con teorica schema di frammentazione predetto in base alla funzionalità strutturale della peptoid.
<ol><li>Preparazione della soluzione campione
	<ol>
<li>Pesare 1,0-2,0 mg peptoid solido in un flaconcino di vetro di 3-5 mL. Aggiungere 1 mL miscelati di solvente di acetonitrile e acqua (ACN/H2O, 1:1, v/v) per sciogliere il peptoid. Questo dà la soluzione di riserva campione con una concentrazione di circa 10-3 M.</li>
		<li>Trasferimento di 20 µ l di soluzione madre in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e aggiungere 1 mL miscelati di solvente di ACN/H2O per produrre una soluzione di campione diluito di circa 10-5 M.</li>
		<li>Rimuovi qualsiasi eventuali particelle insolubili nella soluzione campione diluito eseguendo centrifugazione a 4.427 x g per 3 min circa 700 µ l della parte superiore della soluzione di trasferimento in un'altra centrifuga di 1,5 mL tubo per rendere il peptoid MS soluzione di lavoro con concentrazione di circa 10-5 M.</li>
		<li>Regolare la concentrazione della soluzione di lavoro di MS basata sull'intensità di segnale osservato durante le misurazioni di spettrometria di massa.</li>
		<li>Un modo alternativo per rimuovere eventuali particelle insolubili possibili nella soluzione del campione diluito è passare la soluzione di campione attraverso una siringa filtro 0,20 µm e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga da 1,5 mL per rendere il peptoid MS soluzione di lavoro di circa 10-5 M.</li>
	</ol></li>
	<li>Registrazione di spettri di massa
	<ol>
<li>Eseguire miscela di solventi di ACN/H2O (1:1, v/v) con la fonte electrospray di ionizzazione (ESI) e impostare lo strumento in uno standard agli ioni positivi, scansione completa modalità di spettrometria di massa con una gamma di rapporto massa / carica (m/z) di 100-1500. Nota: Parametri di funzionamento tipici: Tensione dell'ago di ESI, 5 kV Tensione capillare, 40 V Essiccazione di temperatura del gas (azoto), 200 ° C.</li>
		<li>Aggiungere circa 300 µ l di soluzione di lavoro di peptoid MS (circa 10-5 M) in una 500 µ l o una siringa da 1 mL e collegare la siringa all'entrata del ESI utilizzando della tubazione capillare polietere etere chetone (PEEK). Posizionare la siringa nella pompa a siringa e impostare la portata a 10 µ l/min per infondere la soluzione di esempio nell'ingresso dell'ESI.</li>
		<li>Accendere la tensione dell'ago ESI per attivare il processo ESI e poi accendere il rivelatore. Impostare la visualizzazione in modalità profilo e la gamma di m/z di 100-1.500. Mostra un profilo di spettro di massa mostrato nella finestra del profilo. Il picco a m/z 1.265 (visualizzato come m/z di 1,264.6) corrisponde alla peptoid peptoid ione o protonata.</li>
		<li>Registrare lo spettro di MS per 2 min. Nella finestra"metodo", utilizzare 2 min come la "fase di esecuzione." Aprire la finestra di registrazione e inserire un nome di file corretto e iniziare a registrare lo spettro. Nota: Lo spettro di massa risultante è illustrato nella Figura 3.</li>
		<li>Ottimizzare l'intensità del picco a m/z di 1.265. Impostare l'intervallo di m/z di 1.150-1.350 e regolare la tensione capillare durante la visualizzazione dell'intensità di picco in mV mostrato nella finestra del profilo. Ad esempio, aumentare la tensione capillare a 50 V o superiore e Mostra la variazione dell'intensità di picco. L'intensità di picco ottimale è intorno a 150-200 mV. Nota: Regolazione della tensione capillare può cambiare significativamente l'abbondanza di determinati ioni. Aumentando la tensione capillare può migliorare l'intensità dello ione peptoid. Tuttavia, un'alta tensione capillare può anche indurre la dissociazione dello ione peptoid alla sorgente di ioni e diminuire l'intensità osservata. Regolazione della temperatura del gas di essiccazione può migliorare l'intensità del picco a m/z 1.265, ma è meno efficace di regolazione della tensione capillare. Se il picco a m/z 1.265 non raggiunge l'intensità ottima, regolare la concentrazione di campione (o esempio, doppia la concentrazione della soluzione di lavoro di MS).</li>
		<li>Accendere lo strumento nella modalità di MS/MS. Impostare lo ione precursore a 1.265 m/z e il MS/MS range a m/z di 100-1.400 di massa. Nella finestra"metodo" utilizzare 1.265 m/z come la "prima messa Q1" e lasciare vuoto il "Ultima messa Q1". Utilizzare m/z 100 come "Q3 prima messa" e m/z 1.400 Mass "Q3 ultimo." Nota: In modalità MS/MS, le prime funzioni di quadrupolo unità (Q1) come un filtro di massa per isolare lo ione peptoid come lo ione precursore, la seconda unità di quadrupolo (Q2) è una cella di collisione e il terzo quadrupolo unità (Q3) funzioni come un analizzatore di massa.</li>
		<li>Insieme l'energia di collisione a 40 eV e il gas di collisione (argon, in questo caso) della pressione a 1,5 mTorr.</li>
		<li>Mostra un profilo di spettro totale visualizzato nella finestra del profilo. Il picco a m/z di 1.265 corrisponde allo ione peptoid, e i picchi con valori inferiori a m/z rappresentano i frammenti dallo ione peptoid.</li>
		<li>Regolare l'energia di collisione per ottimizzare la visualizzazione dello spettro di frammentazione. Ad esempio, aumentare l'energia di collisione a 45 eV e Mostra il cambiamento del profilo dello spettro. Nota: In generale, aumentando l'energia di collisione migliorerà l'abbondanza degli ioni frammento e ridurre l'abbondanza dello ione peptoid. Aumentando la pressione del gas di collisione consentirà inoltre di migliorare l'abbondanza degli ioni frammento. Attenzione: Non aumentare la pressione del gas di collisione oltre 2 mTorr.</li>
		<li>Registrare lo spettro MS/MS per 2 min. Nella finestra"metodo" utilizzare 2 min come la "fase di esecuzione." Aprire la finestra di registrazione e inserire un nome di file corretto e iniziare a registrare lo spettro.</li>
		<li>Ripetere 1 - 2 tempi di registrazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi di sequenza di peptoid Nota: Nella circostanza di CID, lo ione di peptoid sarebbe frammento presso i legami ammidici lungo la spina dorsale di peptoid per produrre una serie di frammenti N-terminali chiamati B-ioni e una serie di frammenti C-terminale chiamato Y-ioni<ol>
<li>Disegnare la struttura chimica della peptoid acetilato inserendo l'estremità N-terminale sul lato sinistro e C-terminale sul lato destro e una linea tratteggiata a ogni legame dell'ammide per generare uno schema di frammentazione, come mostrato nella Figura 2a. Disegnare un protone con un cerchio tratteggiato per indicare l'elemento portante della carica. A partire dal lato sinistro della struttura, posizionare le etichette sulle linee tratteggiate per indicare i frammenti N-terminali come B1, B2, B8. A partire dal lato destro, posizionare le etichette sulle linee tratteggiate per indicare i frammenti C-terminale come Y1, Y2, a Y8. Nota: Un software di disegno chimico può essere utilizzato per disegnare la struttura di peptoid.</li>
		<li>Immaginate di frammentazione presso il legame di ammideth 4 dal lato sinistro e disegnare le strutture del frammento N-terminale e il frammento C-terminale con accuse formali corretto, come mostrato nella Figura 2b. Inserire l'etichetta di B4 sul frammento N-terminale e inserire l'etichetta di Y5 sul frammento C-terminale. Calcolare il valore m/z B4 sommando le masse nominale degli elementi nella struttura per produrre un valore di 580 e posto m/z 580 sul frammento N-terminale. Calcolare il valore m/z Y5 e posto m/z 685 sul frammento C-terminale.</li>
		<li>Calcolare i valori di m/z per tutti e otto gli ioni B e tutti e otto gli ioni Y e assemblarli in una tabella, come mostrato nella tabella 1. Nota: I valori m/z dei frammenti possono essere calcolati utilizzando un prodotto chimico software di disegno.</li>
		<li>Aprire lo spettro MS/MS registrato di peptoid utilizzando il software di modifica di dati accompagnato con lo strumento. Impostare le preferenze di etichettatura "Visualizza etichette di ioni" ed etichetta soglia al 3%. Questo genera uno spettro MS/MS con valori m/z etichettati sulle cime.</li>
		<li>Esportare il MS/MS dati spettrali come file di testo nel file CSV formattare e ricostruire lo spettro utilizzando software di elaborazione dati. Inserire i valori m/z sulle cime. Lo spettro di MS/MS risultante è mostrato in Figura 4. Nota: Alcuni spettrometri di massa sono dotati di software di elaborazione dati in grado di generare lo spettro MS/MS. In questo caso, non è necessario esportare i dati spettrali di MS/MS.</li>
		<li>Assegnare i valori m/z mostrati sullo spettro MS/MS a quelli mostrati nella tabella 1 per identificare il corrispondenti B - e Y-ioni. Ad esempio, il picco a m/z 580 è identificato come la B4-ione e m/z 685 viene identificato come il Y5-ioni. Etichettare le cime con i corrispondenti simboli B e Y sullo spettro, come mostrato nella Figura 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+N-substituted+glycine+peptoid+libraries.">Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li><li>Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+method+for+the+preparation+of+peptoids+[oligo(N-substituted+glycines)]+by+submonomer+solid-phase+synthesis.">Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).</li><li>Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Multistep+Synthesis+of+a+Bioactive+Peptidomimetic+Oligomer+for+the+Undergraduate+Laboratory.">Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory.</a> J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).</li><li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+submonomer+synthesis+of+peptoid+Polymers+and+their+self-assembly+into+highly-ordered+nanosheets.">Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets.</a> J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).</li><li>Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type/Arginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity.">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+studies+of+protonated+and+alkali+metalated+peptoids:+Enhanced+sequence+coverage+by+metal+cation+addition.">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li><li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids.">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li><li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation.">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un peptoid nonamer, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, è stato sintetizzato utilizzando il protocollo presentato. L'apparecchio per la sintesi coinvolge un vaso di siringa-come reazione di fase solida in polipropilene e un agitatore meccanico. I vasi di reazione sono commercialmente disponibili e a basso costo. Agitatore meccanico è un apparato comune nei laboratori di chimica. Con l'uso di un recipiente di reazione simil-siringa, soluzioni possono essere trascinati e spinto fuori la nave spostando manualment...

Peptoids sono una classe di polimeri sequenza controllata con strutture di spina dorsale che imita la struttura dei peptidi. Peptoids possono essere sintetizzati da diverse ammine, che permette di peptoids ad esporre proprietà altamente sintonizzabile1,2. Peptoids sono stati utilizzati come modelli molecolari per la ricerca biofisica, considerati come agenti terapeutici e progettato come leganti per proteine3,4,5,6. Peptoids sono stati sviluppati in una varietà di composti biologicamente attivi, quali materiali anti-incrostazione e anticorpo-mimetici, agenti antimicrobici e degli enzimi inibitori7,8,9. Con una natura altamente ordinata e sintonizzabile, peptoids hanno anche stato pensato come un tipo di informazioni molecolari deposito10. La scoperta di queste chiamate di diverse applicazioni per lo sviluppo di efficienti metodi analitici per caratterizzare la sequenza e la struttura di peptoids. Tecniche basate sulla spettrometria di massa tandem hanno indicato la promessa come il metodo di scelta per analizzare le proprietà di sequenza di sequenza controllata polimeri, tra cui peptoids11,12,13, 14,15. Tuttavia, gli studi sistematici correlando i pattern di frammentazione di ioni peptoid derivanti da studi di spettrometria di massa e le informazioni strutturali di peptoids sono molto limitati.
Peptoids possono essere facilmente sintetizzati utilizzando un metodo di fase solida. Il metodo ben sviluppato coinvolge un'iterazione di un ciclo di16,di due fasi monomero aggiunta17. In ogni ciclo di aggiunta, un'ammina associato a resina è acetilata da un acido di aloacetici (in genere acido bromoacetico, BMA), e questa è seguita da una reazione di spostamento con un'ammina primaria. Anche se i protocolli di sintesi automatizzata sono stati applicati ordinariamente per la sintesi di peptoid, peptoids possono essere sintetizzati manualmente con ottimi rendimenti in un standard chimica laboratorio16,18,19, 20.
Il nostro laboratorio ha adottato il metodo della sintesi di peptoid manuale e semplificato la strumentazione utilizzata per i metodi esistenti. In precedenza abbiamo studiato i modelli di frammentazione di una serie di peptoids utilizzando tecniche di MS/MS21,22,23. I nostri risultati indicano che peptoids producono caratteristici frammentazioni quando essi sono sottoposti alla dissociazione indotta da collisione (CID)21,23 o cattura elettronica esperimenti22 dissociazione (ECD). In questo articolo, dimostriamo come oligo-peptoids può essere sintetizzato in un laboratorio di chimica standard, come eseguire gli esperimenti di CID utilizzando uno spettrometro di massa triplo quadrupolo e come analizzare i dati spettrali. Il peptoid essere sintetizzato e caratterizzato è un nonamer con acetilazione del N-terminale e C-terminale amidazione, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. La struttura del peptoid è illustrata nella Figura 1.

<table><tbody><tr><td>ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td>The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.</td></tr><tr><td>Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software</td><td>Varian Inc.</td><td></td><td>The software is a part of the Varian 320L package</td></tr><tr><td>Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD</td><td>Fisher Scientific International Inc.</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>Hermle Centrifuge, Model Z 206 A</td><td>Hermle Labortechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solid phase reaction vessel, 10 mL</td><td>Torviq</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pressure caps for reaction vessels</td><td>Torviq</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.45 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0</td><td>CambridgeSoft Corporation</td><td></td><td>CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.</td></tr><tr><td>Styrofoam cup, 12 Oz</td><td>Common Supermarket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rink amide resin</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>02351</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>N, N&amp;rsquo;-diisopropylcarbodiimide</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00110</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Bromoacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>26843</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>2-Phenylethylamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyoxyethylamine</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-ethylenediamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimethylformamide</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1117-4LG</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>N, N-diisopropylethylamine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00289</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System</td><td>Millipore Corporation</td><td>ZMQP60001</td><td>For generating HPLC grade water</td></tr><tr><td>HPLC-grade Water</td><td></td><td></td><td>Produced from Millipore MILLI-Q&amp;reg; Academic Water Purification System</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339USP/NF</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific International, Inc.</td><td>A998-4</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1121-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1113-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Nitrogen gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>NIT 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr><tr><td>Argon gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>ARG 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr></tbody></table>

synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids

Peptoids sono sequenza controllata oligomeri che imita il peptide che consiste in unità di glicina N-alchilati. Tra le molte applicazioni potenziali, peptoids sono stato pensato come un tipo di archiviazione di informazioni molecolari. Analisi di spettrometria di massa sono stato considerato il metodo di scelta per peptoids di sequenziamento. Peptoids possono essere sintetizzati tramite chimica in fase solida utilizzando un ciclo di reazione ripetuta in due fasi. Qui presentiamo un metodo per sintetizzare manualmente oligo-peptoids e per analizzare la sequenza della peptoids utilizzando tecniche di spettrometria di massa (MS/MS) tandem. L'esempio peptoid è un nonamer composto alternando glicina di N (2-methyloxyethyl) (Nme) e glicina di N (2-phenylethyl) (Npe), come pure una N-(2-amminoetil) glicina (Nae) al N-terminale. La formula di sequenza del peptoid è Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, dove Ac è il gruppo acetile. La sintesi avviene in un recipiente di reazione di fase solida disponibile in commercio. La resina di ammide pista è utilizzato come supporto solido per produrre il peptoid con un gruppo di ammide al C-terminale. Il prodotto peptoid risultante è sottoposto ad analisi di sequenza utilizzando uno spettrometro di massa quadrupole triplice accoppiato ad una sorgente di ionizzazione electrospray. La misurazione di MS/MS produce uno spettro di ioni frammento derivanti dalla dissociazione della carica peptoid. Gli ioni frammento vengono ordinati in base ai valori del loro rapporto massa / carica (m/z). I valori m/z degli ioni frammento vengono confrontati con le masse nominali degli ioni frammento teoricamente prevista, secondo lo schema di peptoid frammentazione. L'analisi genera un pattern di frammentazione della carica peptoid. Il modello di frammentazione è correlato alla sequenza di monomero della peptoid neutro. A questo proposito, analisi MS legge le informazioni di sequenza della peptoids.

La struttura di un peptoid 9-mer con acetilazione del N-terminale, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, è mostrata nella Figura 1. Il peptoid è stato sintetizzato manualmente in un recipiente di reazione in polipropilene sinterizzato tramite approccio in fase solida. Pista di pattinaggio ammide resina (0,047 mmol, 84 mg con caricamento 0,56 mmol/g) è usata come supporto solido per produrre il peptoid con un poi amidato C-terminus. La catena peptoid...

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Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids

Un protocollo è descritto per la sintesi manuale di oligo-peptoids seguita da analisi di sequenza mediante spettrometria di massa.

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K Views.  University of the Pacific. Un protocollo è descritto per la sintesi manuale di oligo-peptoids seguita da analisi di sequenza mediante spettrometria di massa.

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Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Mass spettrometrica Approcci alla struttura studio e interazioni proteina in liofilizzati Polveri

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Ricerca

Chimica

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Biochimica

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Sintesi e determinazione della struttura di µ-conotossina PIIIA isomeri con bisolfuro diverse connettività

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.

Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

Sintesi dei Peptoidi a informazione e del loro autoassemblaggio covalente dinamico diretto in sequenza

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the peptide biomarkers of disease or environmental stress, identifying neuropeptides, hormones, and bioactive intracellular peptides, discovering antimicrobial and nutraceutical peptides from protein hydrolysates, and can be used in studies to understand the proteolytic processes. The recent advance in sample preparation, separation methods, mass spectrometry techniques, and computational tools related to protein sequencing has contributed to the increase of the identified peptides number and peptidomes characterized. Peptidomic studies frequently analyze peptides that are naturally generated in cells. Here, a sample preparation protocol based on heat-inactivation is described, which eliminates protease activity, and extraction with mild conditions, so there is no peptide bonds cleavage. In addition, the relative quantitation of peptides using stable isotope labeling by reductive methylation of amines is also shown. This labeling method has some advantages as the reagents are commercially available, inexpensive compared to others, chemically stable, and allows the analysis of up to five samples in a single LC-MS run.

This article describes a sample preparation method based on heat-inactivation to preserve endogenous peptides avoiding degradation post-mortem, followed by relative quantitation using isotopic labeling plus LC-MS.

Preparazione del campione e quantificazione relativa mediante metilazione riduttiva delle ammine per studi peptidomici

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Tracciamento delle particelle sensibili alla massa per caratterizzare la dinamica delle macromolecole associate alla membrana

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Profiling di massa (OLIMP) di polisaccaridi extracellulari

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Biologia

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Mass spettrometrica Approcci alla struttura studio e interazioni proteina in liofilizzati Polveri

Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Sintesi e determinazione della struttura di µ-conotossina PIIIA isomeri con bisolfuro diverse connettività

Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica

Sintesi dei Peptoidi a informazione e del loro autoassemblaggio covalente dinamico diretto in sequenza

Preparazione del campione e quantificazione relativa mediante metilazione riduttiva delle ammine per studi peptidomici

Tracciamento delle particelle sensibili alla massa per caratterizzare la dinamica delle macromolecole associate alla membrana

Oligo Profiling di massa (OLIMP) di polisaccaridi extracellulari

Quantificazione delle proteine Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

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Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

Quantificazione delle proteine Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa