Il finanziamento per questo lavoro è fornito dal National Health and Medical Research Council of Australia (sovvenzione di progetto NHMRC 1.011.352 di MEC e MJC, Independent Research Infrastructure Istituti Support Scheme [IRIISS] sovvenzione WEHI) e il Governo del Victoria (Veski Innovazione Fellowship per MEC; Victorian State Government Supporto Operativo Infrastrutture per WEHI). MEC è una Regina Elisabetta II del Fellow Research Council australiano. EFXB riconosce il sostegno del programma di borse di studio Norma Hilda Schuster presso l&#39;Università di Melbourne.

1. Clonazione e Design Construct Clonare le sequenze di interesse nella PMM-peptide vettore (che può essere fornita su richiesta) usando i siti di restrizione HindIII e BamHI (vedi Figura 1). Il doppio filamento di DNA dovrebbe includere, nel seguente ordine: un sito HindIII, un singolo codone metionina per clivaggio CNBr, la E. coli codone ottimizzato peptide sequenza codificante, un codone di stop, un sito BamHI. Tutti gli altri metionine nel peptide dovrebbe essere eliminato e la sequenza dipeptide asp-pro dovrebbe essere evitata in quanto anche essere scisso in condizioni acide. Un residuo di cisteina unico deve essere introdotto in ciascuna sequenza peptidica secondo il posizionamento desiderato del reticolazione disolfuro nel complesso finale, e tutte le altre cisteine ​​dovrebbero essere mutato a serina. Il plasmide porta una cassetta di resistenza alla kanamicina per la selezione. 2. L&#39;espressione di trpLE-Peptide Fusion <ol><li> Make up e filtro sterile mezzo di crescita M9/Kan minimo (0,1 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L di Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L di NaCl, 1 g / L NH 4 Cl, 4 g / L di glucosio, 50 mg / L di kanamicina solfato). Supplemento con Centrum completa dalla A alla zinco per fornire vitamine del gruppo B e di metalli in tracce: sciogliere 1 compressa in 40 ml di H 2 O con miscelazione per 30 minuti, centrifuga per rimuovere il materiale insolubile e filtro sterile il surnatante arancione. Conservare la soluzione di archivio a 4 ° C al buio per un massimo di 2 settimane, e utilizzare 4 ml / L in M9. NOTA: 15 N arricchita di NH 4 Cl, 13 C-arricchito glucosio o altri precursori stabili-isotopo marcato può essere incluso nel mezzo M9 a questo punto, se desiderato. </li><li> Inoculare da 100 ml di coltura starter appena trasformato BL21 (DE3) ceppo E. coli in mezzo M9/Kan. Crescere durante la notte a 37 ° C con agitazione a 200 rpm. </li><li> La mattina dopo, controllare il OD 600 della cultura di avviamento - questo dovrebbe essere nel range di 2 o superiore. Diluire i 100 ml di coltura starter in 1 litri di volume totale di Centrum-integrato medio M9. Suddiviso in due 2 palloni L sconcertati (500 ml cultura in ogni flacone) e crescere a 37 ° C in agitazione a 140 rpm fino a quando il OD 600 raggiunge 0.6. </li><li> Impostare la temperatura shaker a 18 ° C e continuare ad agitare per 1 ora, permettendo culture raffreddare completamente prima dell&#39;induzione. </li><li> Prendere un pre-induzione campione per analisi SDS-PAGE (equivalente di 50 microlitri da una coltura a OD 600 = 1), quindi aggiungere IPTG a concentrazione 0,1 mM finale di indurre l&#39;espressione del trpLE-peptide di fusione. Continuare a crescere a 18 ° C/140 rpm per una notte (16-20 ore) in induzione IPTG. </li></ol> 3. Inclusione di preparazione del corpo e Matrix Legatura Nickel <ol><li> La finale OD 600 di culture di espressione durante la notte in terreno minimo è variabile e should essere compreso tra 2.5 e 5.0. Prelevare un campione per l&#39;analisi SDS-PAGE (equivalente di 50 microlitri da una coltura a OD 600 = 1) e raccogliere le cellule per centrifugazione per 20 min a 5000 x g. </li><li> Risospendere il pellet cellulare da 1 L cultura in 50 ml di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Sospensioni cellulari possono essere congelati per la successiva elaborazione. </li><li> Lisare cellule mediante sonicazione in ghiaccio alla massima potenza per 1 min e riposo su ghiaccio per 5 min. Usiamo un Sonicator Misonix 3000 (max di uscita 600 watt) con un ½ pollice punta ad alta intensità sostituibile. Ripetere sonicazione / raffreddamento per tre cicli. </li><li> Raccogliere insolubile corpi inclusi (IB) materiale per centrifugazione per 15 minuti a 20.000 xg ed eliminare il surnatante. Un sciolto, sottile strato di colore più chiaro detriti cellulari possono essere visibili in cima alla densa IB pellet, questo può essere lavato via con acqua o tampone con agitazione. Passi 3.3 e 3.4 possono essere ripetuti per migliorare la purezza della frazione IB se desirosso. I campioni di pellet e materiale surnatante deve essere dato per analisi SDS-PAGE per confermare trpLE-TM localizzazione fusione corpi di inclusione. </li><li> Sciogliere IB pellets in soluzione di guanidina (6 M guanidina HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), con 25-50 ml per litro di coltura trasformati. Questo passaggio richiede diverse ore con agitazione e occasionali sonicazione mite. </li><li> Azzerare il lisato IB mediante centrifugazione per 1 ora a 75.000-100.000 xg e 20 ° C. Decantare il surnatante e filtrare attraverso una membrana 0,2 micron. </li><li> Combinare il lisato eliminato IB, in una provetta da 50 ml o una nave più grande che può essere chiuso in modo sicuro, con resina nickel affinità che è stato lavato con acqua e soluzione equilibrata per guanidina. Utilizzare resina 3-4 ml costante per litro di coltura trattati per fusioni che esprimono in misura simile a trpLE-DAP12TM mostrato qui (Figura 3, corsia 2). Bind Batch incubando durante la notte a camera t<html> emperatura con miscelazione delicata. </li></ol> 4. In colonna ossidativo reticolazione <ol><li> Caricare il lisato / nichel sospensione resina IB in una colonna vuota a gravità con il supporto letto poroso, aggiungendo continuamente fino a quando l&#39;intero volume attraversa. Raccogliere e mettere da parte l&#39;eluato, che può ancora contenere proteina di fusione non legato. </li><li> Lavare la resina nichel flusso di gravità con 5 volumi di letto di soluzione di urea (8 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) contenente 5 mM β-ME. </li><li> Lavare la resina nichel di nuovo con 5 volumi del letto di soluzione di urea senza β-ME. </li><li> Lavare la resina di nichel per la terza volta con 5 il volume del letto di soluzione di urea che è stato integrato con 20 mM CuSO 4 e 2 mM glutatione ossidato. Dopo tale lavaggio, chiudere l&#39;uscita della colonna e incubare 30 minuti a temperatura ambiente per permettere la massima formazione di legame disolfuro. </li></ol> 5. TFA eluizione e quantificazione contenuto &quot;&gt; ATTENZIONE: l&#39;acido trifluoroacetico (TFA) provoca gravi ustioni a contatto con la pelle ed i vapori sono altamente irritanti concentrato TFA deve essere utilizzato solo in una cappa chimica approvato fumi con protezione per gli occhi e non guanti di lattice Verificare la compatibilità chimica di tutti.. materiali utilizzati, polipropilene è compatibile con tutte le fasi di questo protocollo. <ol><li> Lavare la soluzione di urea ossidante con 10 volumi del letto d&#39;acqua e asciugare il letto colonna applicando una linea di vuoto per l&#39;uscita della colonna. </li><li> Chiudere l&#39;uscita della colonna e aggiungere 1,5 il volume del letto pulito (99-100%) TFA. Mescolare la resina di nichel con una spatola per assicurare un&#39;esposizione ad acido e incubare per 5 min. Aprire l&#39;uscita della colonna e raccogliere l&#39;eluato acido, pressurizzazione delicatamente con una siringa o linea dell&#39;aria compressa se necessario spingere fuori tutto il liquido. </li><li> Ripetere la fase di eluizione acida con un altro 1,5 il volume del letto di TFA ordinata. Lavorare velocemente in questa fase per evitare la completa dissoluzione del Beaded agarosio matrice. Resa di proteine ​​può essere determinato a questo punto, in base al Beer-Lambert equazione e il coefficiente teorico di estinzione molare del trpLE-peptide sequenza. Diluire un campione di eluato TFA (1:20 a 1:50) in trifluoroetanolo (TFE) e misurare l&#39;assorbanza a 280 nm, usando TFA / TFE alla stessa diluizione come bianco. </li></ol> 6. CNBr Digestione ATTENZIONE: il bromuro di cianogeno (CNBr) è estremamente tossico e deve essere maneggiato solo in una cappa chimica approvato fumi. DPI compresi occhiali di sicurezza, camice da laboratorio e non in lattice guanti sono assolutamente necessari. CNBr è reattivo all&#39;umidità e deve essere portato a temperatura ambiente prima dell&#39;apertura. Contatta l&#39;ufficio istituzionale di sicurezza per le istruzioni sulla neutralizzazione / cessione di CNBr contaminate da soluzioni e materiali. <ol><li> Diluire l&#39;eluato acido al 80% di concentrazione finale TFA per aggiunta goccia a goccia di acqua mescolando delicatamente. Se si forma un precipitato, undd indietro un piccolo volume (0,5 a 1 ml) di TFA ordinata finché la soluzione chiarisce, poi ri-corretta al 80% con acqua. Prendete un 5 microlitri di pre-digerire campione per analisi SDS-PAGE, il congelamento in azoto liquido e liofilizzazione il campione immediatamente. </li><li> Aggiungi cristalli CNBr a circa 0,2 g / ml, avendo cura di pesare il prodotto chimico tossico in sicurezza in ambienti chiusi, pre-pesati tubi o utilizzando un equilibrio all&#39;interno della cappa. Mescolare delicatamente fino a completa dissoluzione. Lavare e sigillare il recipiente di reazione sotto gas inerte (azoto o argon flusso) e incubare 3-4 ore a temperatura ambiente, protetto dalla luce. </li><li> Prendete un 5 microlitri post-digest campione per analisi SDS-PAGE e congelare e liofilizzare immediatamente. Trasferire la reazione digest di una cassetta di cellulosa rigenerata dialisi o tubo (acetato di cellulosa si scioglie in acido concentrato) con un taglio di peso molecolare di 3,5 kDa o meno, a seconda delle dimensioni del complesso peptide atteso. Dializza overnight a 4 L di acqua nellacappa per ridurre la concentrazione di TFA e decomporre ogni CNBr che non ha reagito. Lasciare spazio nel cassetto dialisi o tubi per un significativo aumento del volume (fino a due-tre volte) durante la dialisi notturna. </li><li> Rimuovere la soluzione dializzata reazione con precipitato sospeso dalla cassetta dialisi o tubo (la maggior parte della proteina precipitare quando la concentrazione è ridotta TFA) e trasferire la sospensione per 50 ml provette coniche. Congelare e liofilizzare per rimuovere l&#39;acqua e tracce di CNBr / TFA. Questo passaggio può richiedere alcuni giorni. ATTENZIONE: Sia la reazione dializzato digest e l&#39;acqua di dialisi dovrebbe continuare ad essere trattati come tossici e trattati / smaltiti con le dovute precauzioni. </li><li> I campioni di colture di pre-induzione e raccolta fasi, l&#39;inclusione del corpo surnatante e pellet, eluato TFA e CNBr-digerito materiale può essere analizzati mediante SDS-PAGE. Preparare i campioni da riscaldamento a 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS sample buffer. Eluato TFA e digerire campioni devono essere preparati sia in condizioni riducenti e non riducenti per facilitare l&#39;identificazione del prodotto e la valutazione di reticolazione ossidativa. </li><li> Separare i campioni su un 12% NuPAGE bis-tris pre-cast gel di acrilammide con MES-SDS tampone di corsa per la risoluzione ottimale dei più piccoli prodotti digest. </li></ol> 7. A fase inversa Purificazione HPLC di disolfuro-reticolati peptide <ol><li> Sciogliere fino a 100 mg di prodotti liofilizzati digest in 2-3 ml di acido formico pulito e carico su una scala preparativa (21.2 x 150 mm) Agilent ZORBAX SB-300 C3 colonna PrepHT nel solvente A (in genere 10-20% acetonitrile o 5 -10% di isopropanolo in acqua con 0,1% di TFA). </li><li> Eluire i prodotti digest in un gradiente di solvente B (acetonitrile o isopropanolo con 0,1% TFA) per almeno 5 volumi di colonna. Si veda la discussione per suggerimenti sulla selezione di condizioni di gradiente ottimali per sequenze peptidiche diverse. </li><li> Prendere50-100 campioni microlitri da ogni frazione HPLC per analisi SDS-PAGE e congelare e liofilizzare immediatamente. La rimozione di solventi HPLC è rapido e deve essere completa in 1-2 ore. </li><li> Preparare campioni liofilizzati HPLC per SDS-PAGE per riscaldamento a 95 ° C in tampone campione Invitrogen NuPAGE LDS senza agente riducente. Raffreddare e dividere ogni campione equamente in 2 provette da microcentrifuga, l&#39;aggiunta di 100 mM DTT a uno di loro e ri-riscaldamento brevemente. </li><li> Separare i campioni ridotti e non ridotta HPLC su un 12% NuPAGE bis-tris pre-cast gel di acrilammide con MES-SDS buffer di corsa come sopra. Piccoli, peptidi idrofobici spesso non occupano Coomassie macchia bene e non può funzionare a loro peso molecolare atteso. Tuttavia, il confronto di campioni ridotti e non ridotta deve facilitare l&#39;identificazione dei prodotti peptidici reticolati e la valutazione della purezza. </li><li> Analizzare i peptidi contenenti frazioni candidati da matrix-assisted laser ionizzazione desorbimento tempo di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa (vedi la discussione) per identificare le specie di interesse e confermare la sua massa prevista. </li><li> Combina, congelare e liofilizzare frazioni HPLC contenenti il ​​puro, reticolato TM complesso peptidico e prendere un peso a secco del prodotto finale per determinare i consumi. Le frazioni ad alto contenuto di isopropanolo non può rimanere congelato. Se frazioni peptidiche asciugare fino ad un film piuttosto che un prodotto liofilizzato birichino, nuovamente sciogliere completamente la pellicola in un piccolo volume di pura esafluoroisopropanolo (HFIP), congelare e liofilizzare nuovamente. Il HFIP trattato prodotto deve essere un piccolo cono bianco che può essere facilmente ribaltato e pesato. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Espressione di trpLE-TM fusioni. Nella nostra esperienza, trpLE-TM fusioni sono scarsamente espresse in mezzo di coltura ricca a 37 ° C, e le condizioni di coltura qui descritti sono dimostrate efficaci per molte differenti sequenze contenenti 1-4 domini TM con rese variabili 50-150 mg / L di puro, fusione intatta. Codifica Fusions tre o quattro frammenti TM GPCR (umano CCR5 TM1-TM3 e TM4-TM7, rispettivamente) o un frammento di nucleo catalitico umana peptidasi peptide di segnale (quattro domini TM; vedi rif <...

Questo protocollo dettagli una procedura che abbiamo sviluppato per la produzione di complessi disolfuro-stabilizzate di transmembrana (TM) peptidi per studi strutturali mediante NMR soluzione. La procedura si avvale dell&#39;espressione robusta offerta dal sistema ΔtrpLE1413 fusione (vedi sotto) e permette complessi peptide TM di composizione definita da generare utilizzando sofisticate tecniche di isotopi stabili-etichettatura per i moderni multi-dimensionali esperimenti NMR. Abbiamo utilizzato queste tecniche per determinare le strutture NMR più importanti che hanno rivelato nuove informazioni su come linfociti-attivazione immunoreceptors sono assemblati da più subunità delle proteine ​​di membrana attraverso interazioni tra i loro domini TM (recentemente rivisto in 1). Queste tecniche sono applicabili a sistemi a membrana molte altre proteine ​​così come una vasta gamma di metodi analitici valle oltre a NMR soluzione. Mentre l&#39;esempio qui utilizza residui di cisteina nativiper creare un complesso che imita la naturale disolfuro-legato proteina, il design è adatto sia per la creazione di legami disolfuro ingegnerizzati per stabilizzare complessi che sono normalmente tenuti insieme da deboli, interazioni non covalenti quali omo-e etero-TM complessi dimerici di recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR)-familiari proteine ​​2-4 o eterodimeri αβ complessi integrine 5,6. Sequenze peptidiche estremamente idrofobi come quelli derivati ​​dal doppio strato lipidico-spanning porzioni di proteine ​​TM sono soggetti estremamente difficile per studi biochimici e biofisici. Oltre ad essere molto difficile da manipolare utilizzando proteina standard e tecniche di chimica dei peptidi, sono spesso molto tossici per le cellule e sono quindi difficili da produrre ricombinante. Noi e gli altri 7,8 9-11 hanno avuto un significativo successo esprimere tali sequenze peptidiche difficili nei batteri come in-frame carbossi-terminalefusioni di una versione modificata della sequenza ΔtrpLE1413 derivata dalla E. coli operone trp 12. Il ~ 13 kDa polipeptide codificato da trpLE questa sequenza possono essere prodotti a livelli elevati sotto un promotore T7 ed è interamente localizzato corpi di inclusione in cui sono elusione problemi di tossicità e / o instabilità. Modifica della sequenza mediante aggiunta di un amino-terminale 9-istidina 13 e eliminazione dei residui interni metionina e cisteina dalla sequenza trpLE 14 ammessi trpLE-peptide fusioni essere purificati da ioni metallo cromatografia di affinità e digerito con bromuro di cianogeno (CNBr ) per rilasciare la sequenza peptidica desiderata. Abbiamo utilizzato con successo questo sistema per esprimere più di una dozzina di sequenze differenti come fusioni trpLE che rappresentano frammenti di proteine ​​di membrana che contengono fino a quattro domini TM (7,8 e risultati non pubblicati, vedere anche la sezione DISCUSSIONE). Ilinnovazione chiave in questo protocollo è l&#39;identificazione delle condizioni in cui i non strutturati e molto poco solubile trpLE-TM fusioni possono essere efficacemente disolfuro reticolato nel contesto di un flusso di lavoro ottimizzato. Diversi aspetti di alto rendimento di espressione, la manipolazione e la purificazione dei prodotti peptidici sono stati accuratamente ottimizzati, e le raccomandazioni qui presentate sono ugualmente rilevanti per la produzione di non-disolfuro-reticolati (monomerico) TM prodotti peptidici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromuro di cianogeno </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> SOSTANZA PERICOLOSA. MERCI PERICOLOSE. Molto tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. A contatto con acidi libera gas molto tossico. Altamente tossico per gli organismi acquatici, può causare effetti negativi a lungo termine per l&#39;ambiente acquatico. </td></tr><tr><td> Acido trifluoroacetico </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> CAP e-1000984387, Numero CAS 76-05-1 </td><td> SOSTANZA PERICOLOSA. MERCI PERICOLOSE., Provoca gravi ustioni. Nocivo per inalazione. Nocivo per gli organismi acquatici, può causare effetti negativi a lungo termine per l&#39;ambiente acquatico. </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, numero CAS 60-24-2 </td><td> SOSTANZA PERICOLOSA. MERCI PERICOLOSE. Tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. Irritante per la pelle. Rischio di gravi lesioni oculari. Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Altamente tossico per gli organismi acquatici, può causare effetti negativi a lungo termine per l&#39;ambiente acquatico. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanolo </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Codice prodotto 52512, CAS. 920-66-1 </td><td> SOSTANZA PERICOLOSA. MERCI PERICOLOSE. Nocivo per inalazione e ingestione. Provoca ustioni. </td></tr><tr><td> Acido formico </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Liquido e vapori infiammabili. Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. </td></tr><tr><td> Urea </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Numero del prodotto, 817, CAS 57-13-6 </td><td> Una volta riscaldato, decomposes di biossido di carbonio e ammoniaca; se bruciato, emette piccole quantità di ossidi di azoto. Può causare arrossamento e irritazione della pelle e degli occhi. </td></tr><tr><td> Guanidina cloridrato </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, Numero CAS: 50-01-1 </td><td> Nocivo per ingestione, Provoca grave irritazione oculare, Provoca irritazione cutanea, Tossicità acuta per via orale, irritante per la pelle, irritante per gli occhi. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Numero del prodotto-T8532 Numero CAS: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 è un detergente non ionico, 100% di principio attivo, che viene spesso utilizzato in applicazioni biochimiche per solubilizzare le proteine. Triton X-100 non ha proprietà antimicrobiche e considerato relativamente mite non denaturante detergente </td></tr><tr><td> Il suo-Select Nichel-gel di affinità </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catalogo Num-P6611 </td><td> IS-Select Gel Affinity Il nichel è un metallo immobilizzato agli ioni di cromatografia di affinità (IMAC) del prodotto. La HIS-Select Nickel Affinity gel è un chelato proprietaria quadridentate su perline di agarosio carica di nichel, che è progettato per legarsi specificamente istidina contenente proteine. </td></tr><tr><td> (-)-Glutatione, ossidato </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catalogo num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicatore </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (fuori produzione) </td><td> Potenza massima 600 watt. 1/2-inch sostituibile-punta della sonda si 1/2-inch ad alta intensità, ad alto volume punte e una gamma di alta intensità, basso volume punte. Più vicine modelli attualmente disponibili da questa azienda sono Q500 e Q700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: doppio passaggio sistema biologico cromatografia, versione software 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Catalogo Num 760-0047, Config No: AU500571, Numero di serie: 484BR3705 </td><td> Peptidi lega a fase inversa colonne HPLC in alta aqueous fase mobile e vengono eluite da RP colonne HPLC ad alta fase organica mobile. In RP HPLC peptidi sono separati in base al loro carattere idrofobo. Peptidi possono essere separati eseguendo un gradiente lineare del solvente organico. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-analitica HPLC Colonna, 21.2 x 150 mm, granulometria 5 micron </td><td> Agilent </td><td> No. del prodotto: 895150-909 </td><td> HPLC in fase inversa Colum </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% Bis-Tris Gel </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Gel del cast Pre per elettroforesi delle proteine </td></tr><tr><td> Slide-A-lizzatore cassette dialisi G2, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> No. del prodotto: 87724 </td><td> Esempio di dialisi </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

Interazioni fisiche tra i lipidi incorporati alfa-elica domini di proteine ​​di membrana svolgono un ruolo cruciale nel ripiegamento e assemblaggio di complessi proteici di membrana e in processi dinamici quali transmembrana (TM) di segnalazione e regolazione della superficie cellulare proteina livelli. Comprendere le caratteristiche strutturali di guida l&#39;associazione di particolari sequenze richiede sofisticate analisi biofisiche e biochimiche dei complessi peptide TM. Tuttavia, l&#39;idrofobicità estrema domini TM rende molto difficile da manipolare utilizzando tecniche standard di chimica dei peptidi, e la produzione di materiale idoneo studio dimostra spesso proibitivo impegnativo. Identificare le condizioni in base alle quali i peptidi possono adottare conformazioni elicoidali stabili e formano complessi spontaneamente aggiunge un ulteriore livello di difficoltà. Presentiamo qui un procedimento per la produzione di omo-o etero-dimeri peptide TM da materiali che sono espressi in E. coli, consentendo incorporazione di etichette isotopi stabili per risonanza magnetica nucleare (NMR) o amminoacidi non naturali per altre applicazioni relativamente a buon mercato. L&#39;innovazione principale di questo metodo è che i complessi TM vengono prodotti e purificato come covalentemente associate disolfuro (reticolato) gruppi che possono formare strutture stabili, e stechiometrica omogenea quando ricostituito in detergente, o altri lipidi di membrana-mimetici materiali. Presentiamo anche scrupolosamente alle procedure ottimizzate per l&#39;espressione e la purificazione che sono ugualmente applicabili se la produzione di singoli domini TM o complessi reticolati e fornire consigli per adeguare tali metodi per nuove sequenze TM.

Il livello di espressione ottenuto per fusioni trpLE è variabile e dipende fortemente dalla sequenza di aminoacidi del peptide allegata. Figura 3 mostra l&#39;analisi SDS-PAGE di pre-induzione (corsia 1) e il tempo di raccolta (corsia 2) campioni provenienti da una cultura che ha prodotto circa 120 mg di pura, intatta trpLE-DAP12TM fusione da 1 litro di coltura e 4 matrice di nichel ml. Tutto il trpLE-DAP12TM fusione era localizzata all&#39;inclusione corpo pellet (corsia 4) rispetto al supernatante (c...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Studi biofisici e biochimici delle interazioni tra membrane incorporate domini proteici affrontare molte sfide tecniche, di cui il primo è ottenere materiale idoneo di studio. Questo articolo descrive un protocollo per produrre e purificare disolfuro stabilizzate peptide transmembrana che sono adatti per l&#39;analisi strutturale mediante risonanza soluzione magnetica nucleare (NMR) e altre applicazioni analitiche.

Produzione di disolfuro-stabilizzati peptide transmembrana per gli studi strutturali

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

14.0K Views.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. Studi biofisici e biochimici delle interazioni tra membrane incorporate domini proteici affrontare molte sfide tecniche, di cui il primo è ottenere materiale idoneo di studio. Questo articolo descrive un protocollo per produrre e purificare disolfuro stabilizzate peptide transmembrana che sono adatti per l'analisi strutturale mediante risonanza soluzione magnetica nucleare (NMR) e altre applicazioni analitiche.

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

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Chimica

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the chromatograms to microbial suspensions (e.g. fungi or bacteria in broth or agar), allowing time for the microbes to grow in a humid environment, and visualizing zones with no microbial growth.&#160;The effectiveness of this screening method, known as bioautography, depends on both the quality of the chromatographic separation and the care taken with microbial culture conditions.&#160;This paper describes standard protocols for TLC and contact bioautography&#160;with a novel application to amino acid-fermenting bacteria. The extract is separated on flexible (aluminum-backed) silica TLC plates, and bands are visualized under ultraviolet (UV) light.&#160;Zones are cut out and incubated face down onto agar inoculated with the test microorganism.&#160;Inhibitory bands are visualized by staining the agar plates with tetrazolium red.&#160;The method is applied to the separation of red clover (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolic compounds and their screening for activity against Clostridium sticklandii, a hyper ammonia-producing bacterium (HAB) that is native to the bovine rumen.&#160;The TLC methods apply to many types of plant extracts&#160;and other bacterial species (aerobic or anaerobic), as well as fungi, can be used as test organisms if culture conditions are modified to fit the growth requirements of the species.

Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Methods are described for thin-layer chromatographic (TLC) separation of plant extracts and contact bioautography to identify antibacterial metabolites. The methods are applied to the screening of red clover phenolic compounds inhibiting hyper&#160;ammonia-producing bacteria (HAB) native to the bovine rumen.

Strato sottile cromatografica (TLC) Separazioni e Bioassays di estratti vegetali per identificare composti antimicrobici

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Elettroforesi capillare per monitorare Peptide innesto su Chitosano film in tempo reale

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, allowing for the synthesis of isotactic poly(&#945;-hydroxy acids) with expected molecular weights (&#62;140 kDa) and narrow molecular weight distributions (Mw/Mn &#60; 1.1). This ring-opening polymerization is mediated by Ni and Zn complexes in the presence of an alcohol initiator and a photoredox Ir catalyst, irradiated by a blue LED (400 - 500 nm). The polymerization is performed at a low temperature (-15 &#176;C) to avoid undesired side reactions. The complete monomer consumption can be achieved within 4 - 8 hours, providing a polymer close to the expected molecular weight with narrow molecular weight distribution. The resulted number-average molecular weight shows a linear correlation with the degree of polymerization up to 1000. The homodecoupling 1H NMR study confirms that the obtained polymer is isotactic without epimerization. This polymerization reported herein offers a strategy for achieving rapid, controlled O-carboxyanhydrides polymerization to prepare stereoregular poly(&#945;-hydroxy acids) and its copolymers bearing various functional side-chain groups.

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

A protocol for the controlled photoredox ring-opening polymerization of O-carboxyanhydrides mediated by Ni/Zn complexes is presented.

Controllata di polimerizzazione per apertura di anello Photoredox di O- Carboxyanhydrides mediata da complessi di Ni/Zn

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

Preparazione di stabile biciclico Aziridinium ioni e loro anello-apertura per la sintesi di Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

Nuove tecniche per l'osservazione dinamica strutturale dei cristalli liquidi fotoresponsivi

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Preparation of SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each possessing two sulfur and one nitrogen donor atom functionalities (SNS) and based on bis-imidazole or bis-triazole compounds) are metallated with CoCl2&#183;6H2O to afford tridentate SNS pincer cobalt(II) complexes. Preparation of the cobalt(II) model complexes for liver alcohol dehydrogenase is facile. Based on a quick color change upon adding the CoCl2&#183;6H2O to acetonitrile solution that contains the ligand precursor, the complex forms rapidly. Formation of the metal complex is complete after allowing the solution to reflux overnight. These cobalt(II) complexes serve as models for the zinc active site in liver alcohol dehydrogenase (LADH). The complexes are characterized using single crystal X-ray diffraction, electrospray mass spectrometry, ultra-violet visible spectroscopy, and elemental analysis. To accurately determine the structure of the complex, its single crystal structure must be determined. Single crystals of the complexes that are suitable for X-ray diffraction are then grown via slow vapor diffusion of diethyl ether into an acetonitrile solution that contains the cobalt(II) complex. For high quality crystals, recrystallization typically takes place over a 1 week period, or longer. The method can be applied to the preparation of other model coordination complexes and can be used in undergraduate teaching laboratories. Finally, it is believed that others may find this recrystallization method to obtain single crystals beneficial to their research.

Preparation of SNS CobaltII Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

The preparation of SNS pincer cobalt(II) model complexes of liver alcohol dehydrogenase is presented here. The complexes can be prepared by reacting the ligand precursor with CoCl2&#183;6H2O and can then be recrystallized by allowing diethyl ether to slowly diffuse into an acetonitrile solution that contains the cobalt complex.

Preparazione dei complessi di modelli di pinze SNS di Disidrogeno del Fegato

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.