Name: measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response at JoVE.com

Ringraziamo l'Istituto Lewis-Sigler per Integrative Genomics Sequencing Core Facility all'Università di Princeton per consulenza tecnica e per il sequenziamento e preparazione di RNA biblioteca. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Rowan University e NIH NIGMS R15GM113187 a Boy

1. indurre ipossia
<ol><li>Un giorno o più prima del corso di tempo di ipossia: preparare l'incubatrice, cellula filtraggio sistema, vuoto, serbatoio di gas, boccette, tappi, tubazione di vetro e tubi, come indicato nella Tabella dei materiali.</li>
	<li>Posizionare il serbatoio2 N, incubatrice, sistema di aspirazione e filtraggio nelle immediate vicinanze, per attivare l'elaborazione rapida delle cellule.</li>
	<li>Preparare terreno YPD liquido sterile (1%, Estratto di lievito, 2% di peptone, 2% glucosio) con i componenti in una bottiglia di vetro e la sterilizzazione in autoclave.</li>
	<li>Planimetria di boccette in incubatrice. Nota: Dal serbatoio N2 , il primo pallone sarà una trappola d'acqua, la seconda beuta sarà l'ultimo punto di tempo, il terzo pallone sarà il punto di secondo all'ultimo momento e così via fino al ultimo pallone che è una trappola finale dell'acqua. La figura 1 Mostra l'ordine e le connessioni tra le boccette.</li>
	<li>Il giorno prima del corso di tempo, inoculare una Colonia del lievito in una cultura di 5 mL di liquido YPD all'interno di una provetta sterile. In particolare, di raccogliere una colonia completa da una piastra con un bastoncino sterile. Inserire la chiavetta nel YPD liquido e agitare il bastone fino a quando la maggior parte delle cellule sono in sospensione.</li>
	<li>Ruotare i tubi a 30 ° C durante la notte (~ 16 h). Nota: Dopo le 16h, wildtype cellule raggiungerà saturazione (~ 2 x 108 cellule/mL), indicato da una cultura molto nuvolosa. Altri ceppi potrebbero richiedere più tempo per raggiungere la saturazione e dovrebbero essere testati misurando la concentrazione cellulare con uno spettrofotometro, come indicato nel passaggio 1.9.4.</li>
	<li>Il giorno del corso di tempo, dopo 16 h di incubazione, diluire la cultura saturata 01:50 utilizzando una pipetta da 5 mL per porre 4 mL di pernottamento cultura in 196 mL di YPD liquido all'interno di un pallone da mL 500 sterile. Crescere con agitazione a ~ 200 giri/min per 4 ore a 30 ° C. Nota: Dopo 4 h, una cultura di wildtype raggiungerà una concentrazione di Mid-registro di ~ 1-2 x 107 cellule/mL.</li>
	<li>Durante l'incubazione di 4 h, etichettare le beute (per ipossia e acqua trappole) e i 50 mL provette per il prelievo. Se l'incubatore nel passaggio 1.7 sopra non viene utilizzato per il corso di tempo di ipossia, accendere l'altro incubatore e impostato su 30 ° C.</li>
	<li>
Appena prima di sottoporre le cellule ad ipossia:
	<ol>
<li>Aggiungere ~ 50 mL di acqua a due delle beute sterili 250 mL che serviranno come le trappole di acqua.</li>
		<li>Riempire 1/3 di un ghiaccio secchio con azoto liquido e immergere un rack di polistirolo espanso per contenere provette centrifuga da 50 mL.</li>
		<li>Impostare il sistema di filtro per la raccolta di cellule. Aggiungere un filtro sterile disco sull'unità di fondo del sistema di filtrazione con pinzette sterili, facendo attenzione a toccare solo i bordi del disco filtro. Posizionare l'unità superiore filtro sul gruppo filtro inferiore e fissarlo con le fascette fornite con il sistema. Assicurarsi che l'unità superiore e inferiore siano allineati in modo che vi sia una tenuta ottimale e senza perdite.</li>
		<li>Misurare la concentrazione di cellule con uno spettrofotometro. Diluire le cellule in modo che possono essere misurati in campo lineare dello spettrofotometro – OD600 tra ~0.2 - 0.6, a seconda dello spettrofotometro. Nota: Un'unità di600 OD è ~ 3 x 107 cellule/mL, a seconda della morfologia delle cellule e spettrofotometro. È prevista una concentrazione di ~ 1-2 x 107 cellule/mL, corrispondenti a OD600 di ~0.33 - 0,66.</li>
		<li>
Ottenere rapidamente il campione di tempo 0.
		<ol>
<li>Collegare il sistema di filtro a un vuoto forte (~ 10 mbar) tramite tubo del vuoto e una trappola di boccetta di 1.000 mL. Applicare il vuoto. La cultura (solitamente ~ 20 mL) versare il sopralzo e attendere per liquido di essere tirato attraverso il filtro (~ 10 s, a seconda della forza del vuoto).</li>
			<li>Rimuovere il disco filtro con pinzette pulite delicatamente e posto in una provetta da centrifuga 50 mL. Posizionare immediatamente la provetta nel rack immerso in azoto liquido. D'importanza, non pre-raffreddare i tubi prima di inserire il filtro come i tubi esploderà.</li>
			<li>Dopo > 30 s, posto il tubo in un congelatore-80 ° C per la successiva estrazione del RNA. Dopo ogni filtrazione, pulire e rimontare il sistema filtrante. Sciacquare il sistema tirando acqua attraverso per 10 s senza un disco di filtro. Infine, asciugare il sistema con un tovagliolo di carta.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Diluire la cultura di 4h in boccette differenti per i vari punti di tempo, affinché ciascuna beuta raggiunge metà log concentrazione (~ 1-2 x 107 cellule/mL) presso il punto di tempo indicato di ipossia. Nota: La tabella 1 Mostra le diluizioni che sono state utilizzate per il ceppo aploide di selvaggio-tipo S288C HAP1+ . Si consiglia di testare ogni ceppo in queste condizioni ipossiche cultura e regolare di conseguenza le diluizioni.</li>
		<li>Una volta che le cellule e i media vengono aggiunti a boccette, sostituire il foglio di alluminio che copre il matraccio di apertura con tappo contenente due tubi di vetro inseriti.</li>
		<li>Posizionare le beute nell'incubatore nel layout determinato in precedenza.</li>
		<li>Collegare saldamente il tubo come illustrato nella Figura 1.</li>
		<li>Verificare che tutti i tappi sono strettamente inseriti nelle aperture del pallone.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Al tempo 0, aprire la valvola del regolatore. Quindi impostare il misuratore di portata a 3 L/min. Nota: Bubbling sarà osservato in due flaconi di acqua, che indica il flusso di gas corretto. Se questo non è il caso, verificare che tutti i tappi sono stretti e tubazione sia collegata correttamente.</li>
	<li>Chiudere l'incubatrice e impostare la velocità di agitazione a ~ 200 giri/min. Avviare un timer.</li>
	<li>Prima di ogni punto del tempo, è possibile impostare il sistema di filtro come descritto sopra al punto 1.9.3.</li>
	<li>
Ogni punto di tempo (ad es., 5min, 10min, ecc.), sono due persone di elaborare rapidamente le cellule come segue:
	<ol>
<li>Prima persona: togliere il matraccio appropriato da parte del titolare e togliere il tappo (con tubo di vetro collegato). Nota: Questo non interromperà il flusso di N2 a uno qualsiasi dei restanti matracci di cultura ma interromperà temporaneamente il flusso all'ultima trappola di acqua.</li>
		<li>Seconda persona: dispensare 1 mL di coltura e pipettare in una provetta. Ricollegare il tubo nel matraccio di cultura che è ora alla fine della riga all'ultima trappola di acqua (un tubo e un tappo volontà essere rimossi nel processo.). Quindi, misurare la concentrazione di cellule in provetta, come descritto in precedenza nel passaggio 1.9.4.</li>
		<li>Prima persona: versare il resto della cultura il sistema di filtrazione sotto vuoto e quindi eseguire il filtro e congelamento come descritto in precedenza nel passaggio 1.9.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Al termine tutti i punti di tempo, spegnere il gas2 N. Prima chiudere il regolatore e attendere che la pressione rilasciare e quindi spegnere il misuratore di portata. Infine, smontare il sistema e pulire tutti i materiali con acqua e poi con etanolo al 70%.</li>
</ol>2. estrazione del RNA
<ol><li>Preparare il tampone di RLT per purificazione di RNA colonna, come descritto nella Tabella dei materiali.</li>
	<li>Preparare una soluzione di lavoro di dnasi aggiungendo 10 µ l di soluzione madre dnasi a 70 µ l di tampone RDD per campione (Vedi Materiali tavolo).</li>
	<li>Rimuovere le provette da 50 mL contenente filtri e cellule dal congelatore-80 ° C e metterli su ghiaccio a scongelare (~ 15 min). Procedere come segue con tubi sul ghiaccio.</li>
	<li>Etichetta 2 mL provette con tappo a vite e metterli sul ghiaccio, una provetta per ogni campione. Aggiungere mL ~0.6 di perline lavata con acido in ogni provetta, utilizzando un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL di scoop e misurare le perline.</li>
	<li>Aggiungere 0,6 mL di tampone di RLT refrigerato per le provette da 50 mL.</li>
	<li>Dispensare su e giù per rimuovere le cellule dal filtro e sospendere in soluzione. Evitare di lasciare il filtro rimangono nella soluzione come il filtro sarà assorbire la soluzione. Rimuovere tutte le soluzione assorbita nel filtro utilizzando il puntale per spremere il filtro contro la parete del tubo.</li>
	<li>Trasferire tutto il liquido dal tubo 50 mL nelle provette con tappo a vite contenente microsfere.</li>
	<li>Disporre le provette con tappo a vite in un omogeneizzatore del mulino di perlina e correre per un minuto. Posizionare immediatamente le provette in ghiaccio per tre minuti. Ancora una volta, inserire i tubi l'omogeneizzatore e correre per un minuto.</li>
	<li>Rimuovere i tubi dal omogeneizzatore e posto in ghiaccio per 5 min. Le perline si depositano alla parte inferiore dei tubi.</li>
	<li>Eseguire il resto dei passaggi a temperatura ambiente.</li>
	<li>Con una pipetta, trasferire solo il lisato (~ 350 µ l), evitando le perle, ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Microcentrifuga per 2 min a velocità massima e quindi trasferimento il surnatante in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 1 volume di etanolo al 70% (fatto da 200 etanolo di biologia molecolare-grado della prova). Mescolare bene il pipettaggio.</li>
	<li>Trasferire la soluzione e dell'eventuale precipitato a una colonna di RNA che è stata inserita all'interno di un tubo di raccolta da 2 mL.</li>
	<li>Centrifuga per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare il flusso continuo (il liquido nel tubo).</li>
	<li>Aggiungere 350 µ l di tampone RW1 alla colonna. Centrifuga per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare il flusso continuo.</li>
	<li>Aggiungere 80 µ l dnasi I mix di incubazione per la membrana di colonna (non fare i lati del tubo) e lasciar per riposare per 15 min.</li>
	<li>Aggiungere 350 µ l di tampone RW1 alla colonna. Microcentrifuga per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare il flusso continuo.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di tampone RPE alla colonna. Flusso continuo del microcentrifuge per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di tampone RPE alla colonna. Microcentrifuga per 2 min a ≥ 12, 000 x g.</li>
	<li>Rimuovere la colonna delicatamente e inserire un nuovo tubo di raccolta da 2 mL. Microcentrifuga a tutta velocità per 1 minuto (per asciugare completamente la membrana).</li>
	<li>Gettare la provetta di raccolta e posizionare la colonna in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 30 µ l di acqua RNAsi-libera alla membrana colonna.</li>
	<li>Eluire il RNA dalla colonna di microcentrifuging per 1 min ≥ 12, 000 x g. Quando si caricano le colonne in microcentrifuga, assicurarsi che i coperchi del tubo di raccolta si trovano ad affrontare in direzione centrifuga giri, per evitare che i coperchi di rottura.</li>
	<li>Aggiungere un altro 30 µ l di acqua RNAsi-libera alla membrana colonna, mantenendo la colonna nello stesso tubo del microcentrifuge.</li>
	<li>Microcentrifuga per 1 min ≥ 12, 000 x g, affinché il volume finale eluato è 60 µ l.</li>
	<li>Memorizzare ogni provetta da 1,5 mL contenente 60 µ l di RNA nel congelatore-80 ° C.</li>
</ol>3. determinare la qualità e la concentrazione di RNA
<ol><li>Misurare la concentrazione di RNA e DNA in ogni campione di RNA, utilizzando (a) un fluorimetro, (b) fluorescente a DNA e RNA specifico coloranti e (c) provette, come elencato nella Tabella dei materiali. Seguire le istruzioni del fluorimetro e i coloranti.</li>
	<li>In alternativa, misurare la concentrazione di acido nucleico con uno spettrofotometro di UV a 260 nm. Nota: Una260 una lettura di 1.0 è equivalente a ~ 40 µ g/mL single-stranded RNA.</li>
	<li>Verificare la qualità di RNA eseguendo il RNA su un analizzatore di acido nucleico commerciale (Vedi Materiali tavolo) o su una valore standard di formaldeide / dell'agarosi gel 26.</li>
</ol>4. RNA-seq analisi
<ol><li>Dallo stock di RNA totale, compongono 21 µ l di 100 ng / µ l RNA in acqua RNAsi-libera. Utilizzare 1 µ l di questo 21 µ l per testare la concentrazione di RNA come sopra. Presentare i rimanenti 20 µ l (2 µ g) RNA totale ad un centro di sequenziamento esterno per arricchimento di mRNA, preparazione libreria strand-specifica (con otto o più codici a barre per multiplexing) e sequenziamento (Vedi Materiali tavolo). In alternativa, eseguire localmente mRNA arricchimento e preparazione di libreria e quindi inviare la libreria per il sequenziamento.</li>
	<li>Piscina otto o più campioni di multiplexati e sequenza in una corsia di un sequencer di prossima generazione.</li>
	<li>Scaricare il file FASTQ che contiene tutte le letture di sequenza e l'indice corrispondente legge. Inoltre, scaricare il file di testo contenente i codici a barre multiplex. Nota: Le letture di indice possono essere presenti in un file FASTQ separato. Inserire tutti questi file in una directory.</li>
	<li>Inserire lo script di shell fornito qui, "fastq_pipeline.sh", nella stessa directory. Modificare lo script come appropriato per l'esperimento e le directory del computer. Nota: questo script contiene vaste annotazioni che spiega i passaggi. In breve, la qualità di script taglia le letture, mappe le letture al genoma e genera un file delimitato da tabulazioni contenente il numero di letture al gene per ogni campione.</li>
	<li>Depositare i file FASTQ e crudo conteggio lettura dati in Omnibus di espressione di Gene di NCBI prima pubblicazione 27. Seguire le istruzioni per "Invio dati di sequenza di high-throughput di GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.</li>
	<li>Importare i dati di lettura conteggio nell'ambiente statistico R ed effettuare analisi statistiche, utilizzando lo script di R fornito qui, "time_course_script. R". Modificare lo script come appropriato per l'esperimento e le directory del computer. Nota: Questo script contiene vaste annotazioni che spiega i passaggi. In breve, questo script consente di importare i dati letti, normalizza le letture, individua i geni che cambiano in modo significativo nel corso del tempo, esegue analisi PCA e grafici l'espressione di geni selezionati.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing,+homeostasis,+and+disease.">Oxygen sensing, homeostasis, and disease.</a> New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).</li><li>Butler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+gene+expression+in+eukaryotic+microbes.">Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes.</a> Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).</li><li>Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing+and+hypoxia+signalling+pathways+in+animals:+the+implications+of+physiology+for+cancer.">Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer.</a> J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).</li><li>Rosenfeld, E., Beauvoit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+non-respiratory+pathways+in+the+utilization+of+molecular+oxygen+bySaccharomyces+cerevisiae.">Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).</li><li>Ter Linde, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).</li><li>Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microarray-assisted+screen+for+potential+Hap1+and+Rox1+target+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).</li><li>Kwast, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analyses+of+anaerobically+induced+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae:+functional+roles+of+Rox1+and+other+factors+in+mediating+the+anoxic+response.">Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response.</a> J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).</li><li>Becerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+transcriptome+in+aerobic+and+hypoxic+conditions:+effects+of+hap1,+rox1,+rox3+and+srb10+deletions.">The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions.</a> Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).</li><li>Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+remodeling+of+the+transcriptome+during+short-term+anaerobiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae:+differential+response+and+role+of+Msn2+and/or+Msn4+and+other+factors+in+galactose+and+glucose+media.">Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).</li><li>Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic-State-Dependent+Remodeling+of+the+Transcriptome+in+Response+to+Anoxia+and+Subsequent+Reoxygenation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).</li><li>Hickman, M. J., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+levels+switch+the+function+of+Hap1+of+Saccharomyces+cerevisiae+between+transcriptional+activator+and+transcriptional+repressor.">Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).</li><li>Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase+mediates+a+hypoxic+response+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).</li><li>Bendjilali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Course+Analysis+of+Gene+Expression+During+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hypoxic+Response.">Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response.</a> G3. 7 (1), 221-231 (2017).</li><li>Chellappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+proteins,+Spt23p+and+Mga2p,+play+distinct+roles+in+the+activation+of+Saccharomyces+cerevisiae+OLE1+gene+expression.+Fatty+acid-mediated+regulation+of+Mga2p+activity+is+independent+of+its+proteolytic+processing+into+a+soluble+transcription+activator.">The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator.</a> J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).</li><li>Abramova, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+controlling+expression+of+the+DAN/TIR+mannoprotein+genes+during+anaerobic+remodeling+of+the+cell+wall+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).</li><li>Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SREBP+Pathway+Responds+to+Sterols+and+Functions+as+an+Oxygen+Sensor+in+Fission+Yeast.">SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast.</a> Cell. 120 (6), 831-842 (2005).</li><li>Gaisne, M., B&#233;cam, A. M., Verdi&#232;re, J., Herbert, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;natural&amp;#34;+mutation+in+Saccharomyces+cerevisiae+strains+derived+from+S288c+affects+the+complex+regulatory+gene+HAP1+(CYP1).">A &amp;#34;natural&amp;#34; mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1).</a> Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data.">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--A+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>. R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org">https://www.R-project.org</a> (2015)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Brown, T., Mackey, K., Du, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+Northern+and+Slot+Blot+Hybridization.">Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).</li><li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).</li><li>Cherry, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+Genome+Database:+the+genomics+resource+of+budding+yeast.">Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast.</a> Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).</li><li>Hothorn, T., Everitt, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).</li><li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data.">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).</li><li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns.">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).</li><li>Davies, B. S. J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Role+for+Sterol+Levels+in+Oxygen+Sensing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).</li><li>Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+Recombination+is+Activated+at+Early+Time+Points+Following+Exposure+to+Cobalt+Chloride+Induced+Hypoxic+Conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).</li><li>Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Snf7p+and+Rim101p+in+the+transcriptional+regulation+of+TIR1+and+other+anaerobically+upregulated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).</li><li>Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chromatin+and+Transcriptional+Landscape+of+Native+Saccharomyces+cerevisiae+Telomeres+and+Subtelomeric+Domains.">The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains.</a> Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).</li><li>Collart, M. A., Oliviero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+yeast+RNA.">Preparation of yeast RNA.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).</li><li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+FASTQ+data+with+Galaxy.">Manipulation of FASTQ data with Galaxy.</a> Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).</li><li>Martini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=timeClip:+pathway+analysis+for+time+course+data+without+replicates.">timeClip: pathway analysis for time course data without replicates.</a> BMC Bioinf. 15, (2014).</li><li>Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+series+expression+analyses+using+RNA-seq:+a+statistical+approach.">Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach.</a> BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo studio, i livelli di mRNA per tutti i geni è stata misurata durante l'ipossia nel lievito S. cerevisiae. L'obiettivo era di analizzare i cambiamenti di espressione genica globale a causa della crescita in un ambiente controllato vicino-anossico. Sono state adottate numerose misure per garantire che il metodo qui descritto è stato attentamente controllato e riproducibile. In primo luogo, le cellule sono state esposte ad un ambiente ipossico precisamente definito: 99,999% N2 in contenuti mul...

Molti organismi rispondono all'ipossia, o basso O2, alterando gene expression 1,2,3. Questa risposta aiuta le cellule a fronte della mancanza di un substrato fondamentale per la respirazione aerobica e per parecchie reazioni biosintetiche, ma anche con un cambiamento di stato redox 4. Parecchi studi di microarray eseguiti in S. cerevisiae mostrano che i livelli di mRNA di centinaia di geni cambiano in risposta all'ipossia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recentemente, RNA-seq è stata utilizzata per caratterizzare i cambiamenti di espressione genica nel corso del tempo durante l'ipossia 13. Qui, i dettagli sperimentali sono presentati e discussi.
L'ipossia può essere realizzato in vari modi, ciascuno producendo un diverso livello di O2. Qui, l'ipossia è stato stabilito dal continuo fluire ultra-alto-purezza N2 in boccette, che abbassa [O2] dissolto immediatamente con cinetica riproducibile 10. È possibile che ci sono alcune molecole di2 O presenti che contribuiscono al metabolismo e nell'espressione genica ma questo ambiente è considerato molto vicino anaerobica. In assenza di O2, cellule di lievito non possono biosintetizzare eme, ergosterolo e acidi grassi insaturi 4,12,14. Così, gli studi precedenti hanno incluso questi metaboliti quando crescente lievito senza ossigeno 5,10,15. Tuttavia, molte risposte ipossiche sono mediate da svuotamento di questi metaboliti e così loro reintegro inverte il gene hypoxic espressione risposte 12,16. Al fine di imitare naturale ipossia, questi metaboliti non sono stati aggiunti ai media. Nel breve tempo che le cellule sono state esposte all'ipossia senza la presenza di questi metaboliti essenziali, non c'era nessun notevole aumento della morte cellulare (dati non mostrati) né una risposta di stress prolungato 13.
La risposta dipende anche il ceppo e il suo genotipo. Particolarmente importanti sono gli alleli dei regolatori noti di risposte ipossiche 2. Sullo sfondo di ceppo S288C è altamente desiderato in modo che risultati possono essere confrontati agli altri studi genomici eseguite con questo ceppo. Tuttavia, S288C contiene un allele di perdita-de-funzione parziale del HAP1 gene 17, un regolatore trascrizionale critico per la risposta hypoxic. Questo allele è stato riparato in S288C utilizzando un wildtype copia dal Σ1278b ceppo sfondo 11.
Espressione genica è altamente dipendente l'ambiente cellulare. Così, quando si esegue l'analisi del mRNA di genoma, è importante mantenere un ambiente costante pur variando un altro parametro come tempo, stimolo o genotipo. Per ottenere risultati altamente riproducibili, considera queste tre pratiche per lo studio e tutte le sue repliche biologiche o tecnici. In primo luogo, il experimenter(s) stesso dovrebbe svolgere lo studio, poiché pratiche tecniche possono variare tra gli sperimentatori. In secondo luogo, la stessa serie di ingredienti da utilizzarsi nei media crescita quanto ogni partita ha una composizione leggermente differente che possa influenzare l'espressione genica. In terzo luogo, per ridurre al minimo gli effetti del ciclo cellulare, ogni punto di tempo dovrebbe consistere asincrone cellule nella fase di Mid-registro di crescita (1-2 x 107 cellule/mL).
Quando che caratterizzano una risposta complessa come la risposta di espressione genica all'ipossia, un corso di tempo è vantaggioso per determinare la cinetica di vari eventi. Intervalli di tempo specifici dovrebbero essere scelti che catturerà i principali cambiamenti della risposta. In questo studio, sono stati osservati punti di tempo compreso tra 0 e 4 h, perché ultimi esperimenti ha rivelato i cambiamenti diffusi nell'espressione genica durante questo periodo 13.
Per misurare l'espressione genica globale, RNA-seq è stato usato 18,19. Questo metodo utilizza il sequenziamento di nuova generazione per determinare l'abbondanza relativa di trascrizione di ogni gene. Rispetto all'analisi di microarray del DNA, il RNA-seq esibisce maggiore sensibilità (per rilevare le trascrizioni meno abbondanti), una maggiore gamma dinamica (per misurare le variazioni di piega maggiore) e riproducibilità superiore (a seguire con precisione l'espressione genica nel corso del tempo). In genere, più cellulare del RNA è RNA ribosomiale così molti metodi sono stati sviluppati per arricchire per specifici RNA specie 20. Qui, poli-T sfere sono stati utilizzati per purificare poli-A-contenenti trascrizioni del mRNA, però i vari commercialmente - Kit di svuotamento di rRNA disponibili potrebbe anche essere efficace nel arricchimento di mRNA.
Qui, la risposta di espressione del gene di S. cerevisiae all'ipossia è stata caratterizzata. Le cellule erano esposti ad ipossia e poi provate a otto punti di tempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 e 240 min). Per confermare la riproducibilità e per identificare le trascrizioni statisticamente modificate, sono stati effettuati tre replicati biologici. RNA è stato estratte da rottura meccanica e purificazione di colonna e poi elaborato per l'analisi di RNA-seq. La pipeline di post-sequenziamento è descritta e sono gli script di programmazione che consentono di eseguire la replica esatta delle analisi. In particolare, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, l' ambiente statistico R 24e il DESeq2 pacchetto 25 sono stati utilizzati per elaborare i dati di RNA-seq e per identificare 607 geni che cambiano in modo significativo durante ipossia. Analisi delle componenti principali (PCA) e l'espressione genica dei replicati indicato la riproducibilità della tecnica. Clustering e heatmaps ha rivelato la cinetica di espressione ad ampio raggio, mentre l'analisi del gene ontology (GO) ha mostrato che molti processi cellulari, come respirazione aerobica, sono arricchiti nel set di geni regolati da ossigeno.

<table><tbody><tr><td>Enclosed dry incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4000</td><td>Set at 30 &amp;deg;C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.</td></tr><tr><td>Micro-analysis Filter Holder</td><td>Millipore</td><td>XX1002530</td><td>25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask</td></tr><tr><td>Strong vacuum</td><td>Edwards</td><td>E-LAB 2</td><td>The &amp;ldquo;house&amp;rdquo; vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.</td></tr><tr><td>1,000 mL flask</td><td></td><td></td><td>To act as vacuum trap.</td></tr><tr><td>~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in</td><td>Tygon</td><td>38TT</td><td>Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.</td></tr><tr><td>High-pressure N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td></td><td></td><td>99.999% purity, &gt;1,000 psi, with a regulator and gas flow controller</td></tr><tr><td>Autoclaved 500 mL flask</td><td></td><td></td><td>Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.</td></tr><tr><td>Autoclaved 250 mL flasks</td><td></td><td></td><td>Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.</td></tr><tr><td>Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)</td><td></td><td></td><td>Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.</td></tr><tr><td>Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm</td><td></td><td></td><td>Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.</td></tr><tr><td>~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.</td></tr><tr><td>Sterile filter discs</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>25 mm diameter, 0.45 &amp;micro;m pore size, one for each time point</td></tr><tr><td>Sterile dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (~100 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL cuvettes</td><td></td><td></td><td>For measuring OD600 (i.e., cell concentration)</td></tr><tr><td>50 mL sterile centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td>One for each time point</td></tr><tr><td>Clean and sterile tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>acid-washed beads</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C for lysing cells</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For RNA column purification</td></tr><tr><td>Qiagen RLT buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare by adding 10 &amp;micro;L of &amp;beta;-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>2 mL collection tubes</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RW1</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>DNase I stock and working solutions</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 &amp;micro;L of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 &amp;deg;C) in single-use aliquots (80 &amp;micro;L each). The stock solution should not be thawed and refrozen.</td></tr><tr><td>Buffer RDD</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen DNase Kit</td></tr><tr><td>Ice cold 2 mL screw-cap tubes</td><td></td><td></td><td>For lysing cells during RNA extraction</td></tr><tr><td>bead mill homogenizer</td><td>Biospec Mini-Beadbeater-24</td><td>112011</td><td>Keep in cold room</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>DF0118</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD</td><td>DF0886</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32853</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Quant-iTTM RNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32855</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Commercial electrophoresis system</td><td>Agilent</td><td>Bioanalyzer 2100</td><td>for measuring nucleic acid quality</td></tr><tr><td>Next-generation sequencer</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500</td><td>for sequencing libraries</td></tr><tr><td>automated liquid handling system</td><td>Wafergen</td><td>Apollo 324</td><td>for creating sequencing libraries</td></tr><tr><td>PrepX PolyA mRNA Isolation Kit</td><td>Wafergen</td><td>400047</td><td>for isolating mRNA from total RNA</td></tr><tr><td>PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit</td><td>Wafergen</td><td>400039</td><td>for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA</td></tr><tr><td>Barcode Splitter</td><td></td><td></td><td>https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&amp;amp;changeset_revision=e7b7cdc1834d</td></tr><tr><td>Samtools, which includes the gzip command</td><td></td><td></td><td>http://www.htslib.org/download/</td></tr><tr><td>Trimmomatic</td><td></td><td></td><td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Bowtie2 (installed before TopHat)</td><td></td><td></td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td></tr><tr><td>TopHat</td><td></td><td></td><td>https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml</td></tr><tr><td>HTSeq</td><td></td><td></td><td>http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html</td></tr><tr><td>R (installed before R Studio)</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com</td></tr><tr><td>R Studio (free version)</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr></tbody></table>

measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response

Complessi cambiamenti nell'espressione genica mediano in genere una grande porzione di una risposta cellulare. Ogni gene può cambiare espressione con la cinetica unico come il gene è regolato tramite la sincronizzazione particolare di uno dei molti stimoli, segnalazione vie o effetti secondari. Al fine di catturare l'intero gene espressione risposta all'ipossia nel lievito S. cerevisiae, analisi di RNA-seq è stata usata per monitorare i livelli di mRNA di geni tutti in momenti specifici dopo l'esposizione all'ipossia. L'ipossia è stato stabilito coltivando cellule in ~ 100% N2 gas. Cosa importante, a differenza di altri studi hypoxic, ergosterolo e acidi grassi insaturi non sono stati aggiunti ai media perché questi metaboliti influenzano l'espressione genica. Intervalli di tempo sono stati scelti nella gamma di 0 - 4 h dopo ipossia perché quel periodo acquisisce i principali cambiamenti nell'espressione genica. In ogni punto del tempo, le cellule hypoxic Mid-registro erano rapidamente filtrata e congelati, limitando l'esposizione di O2 e concomitanti cambiamenti nell'espressione genica. RNA totale è stato estratto dalle cellule e utilizzato per arricchire per mRNA, che è stato poi convertito in cDNA. Da questo cDNA, multisala librerie sono state create e otto o più campioni sono stati sequenziati in una corsia di un sequencer di prossima generazione. Una pipeline di post-sequenziamento è descritta, che include guarnizione base di qualità, leggere mapping e determinazione del numero di letture al gene. DESeq2 all'interno dell'ambiente statistico R è stato utilizzato per identificare i geni che cambiano significativamente in uno qualsiasi dei punti tempo ipossica. Analisi di tre replicati biologici ha rivelato alta riproducibilità, geni della cinetica differente e un gran numero di previsto O2-regolato geni. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare come le cellule di vari organismi rispondono all'ipossia nel tempo e adattati per lo studio di espressione genica durante altre risposte cellulari.

Il decorso di ipossia e RNA-seq analisi sono state eseguite in modo indipendente tre volte. Per esaminare la riproducibilità dei tre replicati, dati di espressione genica per tutti i geni è stati analizzati utilizzando Principal Component Analysis (PCA). La figura 2 Mostra come i campioni cambiano sopra i primi due componenti principali, che insieme rappresentano il 58,9% della variabilità. Questa analisi ha indicato che ogni corso tempo esibisce i cambiam...

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Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Qui, presentiamo un protocollo utilizzando RNA-seq per monitorare i livelli di mRNA nel tempo durante la risposta hypoxic delle cellule di S. cerevisiae . Questo metodo può essere adattato per l'analisi di espressione genica durante qualsiasi risposta cellulare.

Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

8.2K Views.  Rowan School of Osteopathic Medicine. Qui, presentiamo un protocollo utilizzando RNA-seq per monitorare i livelli di mRNA nel tempo durante la risposta hypoxic delle cellule di S. cerevisiae . Questo metodo può essere adattato per l'analisi di espressione genica durante qualsiasi risposta cellulare.

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Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Ricerca

Biochimica

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

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Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetica

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A mitochondrial genome of baker&#8217;s yeast encodes eight proteins: three subunits of the cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, and Cox3p), three subunits of the ATP synthase (Atp6p, Atp8p, and Atp9p), a subunit of the ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase enzyme, cytochrome b (Cytb), and mitochondrial ribosomal protein Var1p. The purpose of the method described here is to specifically label these proteins with 35S methionine, separate them by electrophoresis and visualize the signals as discrete bands on the screen. The procedure involves several steps. First, yeast cells are cultured in a galactose-containing medium until they reach the late logarithmic growth stage. Next, cycloheximide treatment blocks cytoplasmic translation and allows 35S methionine incorporation only in mitochondrial translation products. Then, all proteins are extracted from yeast cells and separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Finally, the gel is dried and incubated with the storage phosphor screen. The screen is scanned on a phosphorimager revealing the bands. The method can be applied to compare the biosynthesis rate of a single polypeptide in the mitochondria of a mutant yeast strain versus the wild type, which is useful for studying mitochondrial gene expression defects. This protocol gives valuable information about the translation rate of all yeast mitochondrial mRNAs. However, it requires several controls and additional experiments to make proper conclusions.

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker&#8217;s yeast mitochondrial genome encodes eight polypeptides. The goal of the current protocol is to label all of them and subsequently visualize them as separate bands.

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In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is particularly relevant for survival in fluctuating environments such as those found in beer fermentation. However, sugar transitions are an environmental variable that is challenging to predict and detect, impacting the outcome of beer fermentations. This protocol describes an in vivo system to monitor transcriptional activation associated with the glucose-to-maltose metabolic shift in Saccharomyces eubayanus that applies to different wild Saccharomyces yeast strains. 
The system employs an episomal bioluminescent transcriptional reporter for maltose metabolism, focusing on MAL32, since it provides a good readout for metabolic shifts, as studied in S. cerevisiae. For this, yeast strains were transformed with plasmids containing the MAL32 regulatory region from S. eubayanus, controlling the expression of a gene encoding for a destabilized version of firefly luciferase1, and a hygromycin resistance gene used exclusively during transformation to ensure plasmid acquisition. Following selection, transformed yeast cells can be cultured under non-selective conditions, as the episomal plasmid remains stable in culture conditions for up to 7 days. 
This system was validated under a complex sugar environment in microfermentation assays, confirming the effectiveness of the luciferase reporter in informing metabolic transitions. Samples were collected regularly and analyzed with a luminometer, providing continuous insights into yeast responses. While broadly applicable, this protocol is particularly valuable for assessing yeast performance under fermentation conditions, where metabolic changes pose a significant challenge. Additionally, this methodology can be adapted by selecting alternative promoters to explore a broader range of responses to environmental changes, allowing characterization as well as optimization of wild yeast strains for diverse industrial applications.

This protocol employs a bioluminescent reporter, allowing measurements of transcriptional activity in Saccharomyces eubayanus to monitor the glucose-to-maltose transition, enabling real-time analysis of metabolic adaptations and supporting strain optimization for industrial fermentation under diverse conditions.

In vivo Monitoraggio dell'attività trascrizionale durante la transizione metabolica mediante un reporter bioluminescente nel lievito

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biologia

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

L&#39;acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Misura di mRNA Decay Prezzi in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilizzo<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Ceppi

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae

In vivo Monitoraggio dell'attività trascrizionale durante la transizione metabolica mediante un reporter bioluminescente nel lievito

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae

Visualizzazione e l'analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza

L'acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti

La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

Misura di mRNA Decay Prezzi in

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito