L'RT-PCR annidato è stato sviluppato per rilevare tutti i lyssavirus, inclusi tutti i 16 TICV approvati e due nuove specie di Lyssavirus. La convalida di questo metodo è stata dimostrata utilizzando oltre 9000 campioni di cervello animale in 10 anni di diagnosi clinica della rabbia e sorveglianza in Cina. L'RT-PCR annidato non solo può produrre risultati credibili su campioni di tessuto cerebrale fresco, ma anche su campioni degradati.
L'inondazione questo metodo può essere utilizzato per saggiare campioni di liquidi biologici come liquido cerebrospinale, saliva e urina, quindi questo metodo può essere applicato nelle diagnosi di ultimatum. Al fine di ridurre al minimo la contaminazione da riporto PCR, è importante preparare controlli negativi e positivi È davvero importante adottare misure. Ad esempio, per ogni estrazione dell'RNA è necessaria la preparazione, l'configurazione della PCR e l'elettroforesi del gel devono essere azionate in aree fisicamente separate.
Si consiglia inoltre di utilizzare nastri a spirale nell'estrazione dell'RNA e nella trascrizione inversa al fine di prevenire la contaminazione da rabbia alla catena peptidica. Una corretta manipolazione come preparare i tuoi agenti sul ghiaccio, cambiare regolarmente i guanti e l'uso di materiali senza ribonucleasi impedirà l'introduzione di ribonucleasi ed eliminerà la degradazione dell'RNA. Per iniziare questa procedura, estrarre l'RNA dal tessuto sospetto della rabbia, dalle biopsie cutanee, dalla saliva, dal liquido cerebrospinale o dalla coltura cellulare infetta rabv come delineato nel protocollo di testo.
Quando è pronto per procedere, rimuovere i reagenti necessari dal congelatore e tenerli sul ghiaccio. Assicurarsi di scongelare e vortice ogni reagente prima dell'uso. Per la trascrizione inversa dell'RNA virale al cDNA preparare 12 micro litri di miscela di reazione per ogni campione su ghiaccio e un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri come descritto nella tabella 1 del protocollo di testo in una camera bianca.
Per tenere conto delle variazioni di pipettazione, preparare un volume di miscela principale di almeno una dimensione di reazione superiore al necessario, quindi dividere la miscela di reazione in tubi PCR da 0,2 millilitri. In una workstation PCR in una stanza dei modelli aggiungere otto microlitri del campione o uno dei controlli alla combinazione di reazioni. Il controllo positivo è l'RNA estratto dalla coltura cellulare infettata dal ceppo DI RABV fisso CVS11, mentre il controllo negativo contiene acqua distillata doppia priva di Rnase.
Mescolare il contenuto di ogni tubo prima vortexing e poi centrifugando brevemente. Successivamente, caricare i tubi di reazione in un termociclo. Impostare ed eseguire il programma di sintesi cDNA come descritto nel protocollo di testo.
In primo luogo, recuperare i reagenti necessari e tenerli sul ghiaccio in una camera bianca fino a quando non sono pronti per l'uso. Quando è pronto, scongelare e vortice i reagenti. Successivamente, preparare 48 microlitri del primo mix PCR rotondo per ciascun campione in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri, come indicato nella tabella 2 del protocollo di testo, e dividere la miscela di reazione in tubi PCR da 0,2 millilitri.
In una workstation PCR in una stanza dei modelli aggiungere un campione di due microliter del cDNA nel mix PCR del primo round. Includere due microlitri di CVS11 cDNA come controllo positivo e due microlitri di acqua distillata doppia come controllo negativo. Quindi, trasferire i tubi sigillati in un termociclometro PCR e ciclo utilizzando i parametri elencati nella tabella 3 del protocollo di testo.
Per iniziare, preparare 48 microlitri della miscela PCR del secondo ciclo per ciascun campione in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri, come indicato nella tabella 4 del protocollo di testo, e dividere la miscela di reazione in tubi PCR da 0,2 millilitri. Aggiungere due microlitri del prodotto PCR del primo round nel mix PCR del secondo round. Includere l'acqua distillata doppia come controllo negativo per questo ciclo di PCR.
Quindi, eseguire il termociclismo PCR utilizzando i parametri elencati nella tabella 3 del protocollo di testo. In primo luogo, aggiungere 1,5 grammi di agarosio a 100 millilitri di EDTA tris-acetato e scaldarlo in un forno a microonde per scioglierlo completamente. Quindi, aggiungere il bromuro di etidio a una concentrazione finale dello 0,01%Versare il gel nello stampo e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.
Preparare i campioni di carico mescolando cinque microlitri di ciascun prodotto PCR con un microlitro di tampone di carico 6x. Caricare separatamente i campioni e l'adatto marcatore di DNA nei pozzi ed eseguire il gel per circa 30-45 minuti a 120 volt fino a quando la linea di tintura è approssimativamente dal 75 all'80% lungo il gel. Al termine della corsa, spegnere l'alimentazione e scollegare gli elettrodi dalla fonte di alimentazione.
Quindi, rimuovere con cura il gel dalla scatola di gel. Utilizzare un dispositivo di documentazione in gel UV per visualizzare e fotografare i frammenti di DNA. Caratterizzare la PCR nidificata a trascrizione inversa come delineato nel protocollo di testo.
I risultati di un RT-PCR annidato rappresentativo per rilevare 18 specie di Lyssavirus sono mostrati qui. I controlli positivi PCR mostrano la banda prevista a 845 coppie di basi nella prima amplificazione rotonda e a 371 coppie di basi per il secondo. Non viene vista alcuna banda per i controlli negativi.
Tutti i 18 Lyssavirus sono visti produrre le stesse due bande del controllo positivo, indicando che l'RT-PCR annidato ha rilevato tutti i 18 Lyssavirus. Mentre 16 dei plasmidi hanno un'amplificazione efficiente in due cicli di PCR, due di essi, il virus Aravan e il virus Ikoma, sono amplificati solo nel primo o nel secondo round, rispettivamente. La sensibilità del metodo varia nel rilevamento di diversi plasmidi del Lyssavirus, da valori che vanno da 2,24 a 2.240 molecole per microlitro.
Queste differenze possono essere attribuite ai disallineamenti tra i primer e i modelli a causa della diversità della sequenza virale. Un confronto di 9.624 tessuti cerebrali provenienti da campioni clinici testati da PCR nidificati rispetto a quelli testati con FAT mostra che rt-PCR annidato come sensibilità del 100% e una specificità del 99,97%La conformità tra i due metodi è del 99,07%Altri dieci laboratori di rabbia sono stati invitati a condurre il test per convalidare ulteriormente l'RT-PCR annidato. Tutti e dieci i laboratori hanno ottenuto risultati RT-PCR annidati che sono al 100% in conformità con il FAT, senza falsi negativi o falsi positivi, indicando che l'RT-PCR annidato ha un'elevata specificità e riproducibilità.
RT-PCR è ora raccomandato da OIE per l'utilizzo di tecnologie di rabbia. E il nostro RT-PCR annidato è stato dimostrato come lo standard nazionale delle tecnologie della rabbia in Cina nel 2018.
