Questo video fornirà protocolli dettagliati per esperimenti di forma in vitro per determinare la struttura secondaria delle sequenze di RNA di interesse in presenza di un RNA destinato a piccole molecole. La forma in vitro è un metodo conveniente per comprendere la dinamica di ogni nucleotide su un elemento RNA di piccole dimensioni che di solito è inferiore a 200 nucleotidi. Dopo aver preparato il modello di RNA come descritto nel manoscritto, i primer di trascrizione inverso dell'etichetta radio aggiungendo un gamma 32P ATP, primer di trascrizione invertito.
Tampone di reazione 10XPNK, polinucleotide chinasi e acqua libera dell'RNA in un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri in un volume totale di 20 microlitri. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Si attivano quindi i campioni per 20 minuti da 65 gradi Celsius e quindi si filtrano i campioni in una colonna di desalinizzazione e una centrifuga a 1000 volte G.Aggiungere 25 microlitri di tampone e mix di campioni di urea 2XTBE.
Abbassare questi prodotti etichettati in un gel di acrilammide al 10% e assicurarsi di evitare di sanguinare la radioattività nei serbatoi inferiori. Eseguire il gel a 20 watt per un'ora. Dopo la corsa, rimuovere le lastre di vetro della cassetta di gel.
Posare il gel sul pezzo di involucro di plastica. Piegare la plastica sulla parte superiore del gel per fare un panino ermetoso. Posizionare il sandwich di gel su uno schermo al fosforo calcio-tungstato ed esporre con uno strumento immaginante.
Immagine del gel di nuovo con luce regolare per sapere dove si trovano i bordi del gel. Usa un software di elaborazione delle immagini per sovrapporre le due immagini e sovrapporre le immagini chiare e scure. Quindi rendere l'immagine superiore leggermente opaca per vedere entrambe le immagini contemporaneamente.
Assicurarsi che l'immagine stampata abbia le stesse dimensioni del gel effettivo. Quindi allineare il gel sull'immagine stampata. Infine, utilizzare una lama di rasoio sterilizzata per tagliare le curve desiderate dal gel e posizionare ogni pezzo di gel in un tubo di microcentrifugo separato da 1,7 millilitri.
Per recuperare il DNA dalla fetta di gel per eluizione passiva, aggiungere 0,3 millilitri di miscela di precipitazioni di eluizione a ciascun tubo da 1,7 millilitri. Incubare i tubi in un contenitore radioattivo sicuro su un rotatore a quattro gradi Celsius per 16 ore. Dopo l'incubazione, trasferire il liquido in un nuovo tubo da 1,7 millilitri.
Aggiungere 2,5 volte l'etanolo a prova di ghiaccio 200 e invertire i tubi sei volte per mescolare il liquido. Incubare i tubi a meno 80 gradi Celsius per un minimo di un'ora. Dopo aver centrifugato a 10.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti, rimuovere attentamente il supernatante pipettando.
Aggiungere un millilitro di 80%etanolo per lavare il pellet. Vortice per 15 secondi e centrifuga di nuovo nelle stesse condizioni. Dopo aver rimosso il supernatante con pipettazione, asciugare all'aria il pellet di DNA per cinque minuti.
Aggiungere 50 microlitri di acqua libera dell'RNA e mescolare pipettando su e giù 10 volte. Normalizzare la concentrazione di DNA a circa 100.000 conteggi al minuto per microlitro in un contatore di scintillazione. Per preparare quattro campioni per la modificazione chimica, aggiungere otto picomoli di RNA in 32 microlitri di tampone 0,5 XTE a un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri.
Riscaldare a 80 gradi Celsius per due minuti e schioccare fresco sul ghiaccio per almeno un minuto. Quindi aggiungere otto microlitri di miscela pieghevole 5x, mescolare un allocare nove microlitri di questa miscela di RNA in ciascuno dei quattro tubi PCR, etichettati da uno a quattro. Aggiungere un microlitro del 10%DMSO nel tubo contrassegnato come uno, un microlitro di soluzione concentrata di piccole molecole nel tubo due, un microlitro di soluzione diluita di piccole molecole nel tubo tre e un microlitro di acqua nel tubo quattro.
Incubare tutti i tubi PCR a 37 gradi Celsius in un ciclore termico per 30 minuti. Direttamente prima della reazione di modifica oh primaria, diluire un microlitro di due soluzioni di stock NAI molare in tre microlitri di acqua trattata con DEPC per produrre una soluzione di lavoro molare 0,5. Aggiungere immediatamente un microlitro di questa soluzione nei tubi uno, due e tre.
Aggiungere un microlitro del 25%DMSO nel tubo quattro e incubare in un ciclore termico a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Preparare quattro tubi di microcentrifugo freschi da 1,7 millilitri e aggiungere 100 microlitri di miscela di precipitazioni di eluizione e due microlitri di glicogeno a ciascun tubo. Quindi in ciascuno di questi tubi trasferire tutto il liquido dai corrispondenti tubi PCR.
Aggiungere 0,34 millilitri di etanolo ghiacciato a 200 prove in ogni tubo e mescolare vortice per cinque secondi. Posizionare i tubi in un congelatore meno 80 gradi Celsius per almeno un'ora. Quindi centrifugare i tubi per 15 minuti a 14.000 volte G a quattro gradi Celsius.
Senza disturbare il pellet di RNA, rimuovere il supernatante da ogni tubo. Aggiungere 0,5 millilitri di 80%etanolo per tubo per lavare il pellet di RNA e il vortice per 15 secondi. Dopo aver centrifugato di nuovo nelle stesse condizioni, rimuovere il supernatante e asciugare all'aria il pellet di RNA per cinque minuti.
Aggiungere nove microlitri di acqua e tubo liberi dell'RNA che su e giù 10 volte per mescolare. Trasferire l'RNA modificato in quattro nuovi tubi PCR ed etichettarli uno a quattro come nella fase precedente. Aggiungere due picomoli di RNA in sette microlitri di acqua trattata con DEPC a ciascuno dei quattro tubi PCR aggiuntivi ed etichettarli con numeri da cinque a otto.
Aggiungere due microlitri del primer radioetichettato recuperato a ciascuno degli otto tubi PCR contrassegnati da uno a otto. Dopo aver riscaldato a 65 gradi Celsius per cinque minuti, raffreddare immediatamente fino a quattro gradi Celsius nel ciclore termico. Aggiungere quattro microlitri di tampone RT 5x, un microlitro di 0,1 DTT molare e un microliter di miscela DNTP a ciascuno dei tubi.
Quindi aggiungere due microlitri di acqua trattata con DEPC ai tubi da uno a quattro. Aggiungere quattro microlitri di cinque ddATP millimolare al tubo cinque, quattro microlitri di cinque ddTTP millimolare al tubo sei e quattro microlitri di cinque ddCTP millimolare al tubo sette e un microlitro di cinque ddGTP millimolare e tre microlitri di acqua trattata con DEPC per tubo otto e pipetta quattro volte da mescolare. Dopo aver riscaldato tutti i tubi PCR a 52 gradi Celsius per un minuto in un ciclore termico, aggiungere un microlitro di trascrittasi inversa a ciascun tubo e tubazione su e giù quattro volte per mescolare.
Incubare le reazioni a 52 gradi Celsius per 20 minuti nel ciclore termico. Per idrolizzare l'RNA, aggiungere un microlitro di cinque idrossido di sodio molare in ciascuno dei tubi e scaldarli a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere cinque microlitri di un acido cloridrico molare per neutralizzare la reazione e ripetere la precipitazione dell'etanolo come descritto in precedenza.
Dopo aver asciugato all'aria il pellet di DNA per cinque minuti, aggiungere 10 microlitri di acqua e 10 microlitri di tampone di carico del campione di urea 2xTBE in tubi da 1,7 millilitri e condirlo su e giù 10 volte per riissolvere. Riscaldare i campioni a 70 gradi Celsius per cinque minuti, quindi posizionare i tubi sul ghiaccio, prima di caricarsi sul gel. Caricare 10 microlitri del campione che è stato posizionato sul ghiaccio sul gel di sequenziamento della poliacrilammide all'8%.
Eseguire il gel a 65 watt per due ore o fino a quando il colorante inferiore raggiunge i 3/4 del gel. Rimuovere il distanziale e inserire delicatamente una spatola per rimuovere la piastra di vetro siliconizzata superiore. Coprire il gel con un pezzo di carta da filtro di grandi dimensioni e premere delicatamente per consentire al gel di aderire alla carta filtrante.
Partendo dall'estremità inferiore, sollevare la carta filtrante e rimuovere il gel dalla lastra di vetro insieme alla carta. Dopo aver trasferito il gel su una carta da imballaggio come fatto in precedenza, asciugarlo a 70 gradi Celsius per un'ora con un vuoto, assicurandosi di utilizzare diverse carte filtranti tra il gel e l'essiccatore. Trasferire il sandwich di gel su una cassetta dello schermo di stoccaggio del fosforo foto-sbiancato ed esporre la radioattività del gel allo schermo per quattro o 16 ore.
Infine, posizionare lo schermo di archiviazione del fosforo su un dispositivo di imaging e scansionare con risoluzione media per circa 30 minuti. Dopo aver esposto il gel di sequenziamento in poliacrilammide allo schermo di stoccaggio del fosforo, un esperimento di forma di successo ha mostrato una curva singola e più intensa nella parte superiore del gel e si piega in tutto il gel con una risoluzione nucleotidica singola senza striscio. Il gel ha anche mostrato che l'intensità di alcune curve è cambiata in presenza di piccole molecole, indicando cambiamenti della forza di accoppiamento di base.
Un problema comune nell'analisi della pagina è che una regione di striscio nota come fronte di sale può apparire al centro del gel, probabilmente a causa dell'alta concentrazione di sale, DMSO o altra sostanza indesiderata nel campione di carico. Questo può essere evitato rimuovendo la sostanza indesiderata mediante precipitazione di etanolo. Un modello di RNA omogeneo è preferibile per la forma in vitro.
Usiamo ribosomi sia a cinque estremità prime che a tre estremità prime per ottenere un tale RNA. La forma in cella può anche essere eseguita per ottenere la struttura secondaria dell'RNA nel contesto cellulare. Ricorda, la forma in vitro potrebbe non ricapitolare interazioni proteiche in vivo con RNA.
La forma in vitro è un metodo potente per rilevare i cambiamenti nella struttura dell'RNA dovuti alla presenza di una piccola molecola. Questo viene fatto quantificando i cambiamenti nella forza di patterning delle interruzioni della transcriptasi inversa. Sii cauto sul fatto che tutti gli esperimenti descritti in questo video siano eseguiti in un luogo di lavoro radioattivo autorizzato con un'adeguata protezione personale e schermatura in plexiglass.
