Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio di Ricerca delle Scienze Naturali e Ingegneria del Canada.

1. Ottenere Geni di Interesse <ol><li> Generi sintetici di progettazione. <ol><li> Ottimizzare una sequenza genica per l&#39;espressione di E. coli . </li><li> Rimuovere tutti i siti di restrizione problematica dalla sequenza (AvrII, NdeI, EcoRI e XbaI). </li><li> Incorporare siti di restrizione per la clonazione; Si raccomanda un sito 5&#39;-NdeI e un sito 3&#39;-EcoRI. Altri siti possono essere usati, se necessario; Si riferisce alla regione multicloning del plasmide selezionato ( Figura S1- S4 ). Se si desidera, includere un tag di codifica 5 &#39;o 3&#39; per la rilevazione Western blot. </li><li> Ordina commercialmente il gene progettato. </li><li> O il clone blunt il gene in un vortice vettore utilizzando un kit di clonazione blunt, come per le istruzioni del produttore; Primer di progettazione per amplificare il gene (quindi procedere al punto 1.2.2); O aggiungere altri 5 &#39;e 3&#39; estremità per la clonazione diretta in un plasmide pMGX e procedere al punto 2. Qui,I risultati rappresentativi sono dalla clonazione sbilanciata dei geni di interesse. </li></ol></li><li> Amplificare il gene desiderato (da un gene sintetico progettato e ottimizzato o da un template DNA contenente il gene desiderato) 15 . <ol><li> Primer di progettazione con siti di restrizione per la clonazione; Si raccomanda un sito 5&#39;-NdeI e un sito 3&#39;-EcoRI. Altri siti possono essere usati, se necessario; Si riferisce alla regione multicloning del plasmide selezionato ( Figura S1- S4 ). Se si desidera, includere un tag di codifica 5 &#39;o 3&#39; per il rilevamento Western blot. </li><li> PCR amplifica il gene desiderato 15 . </li><li> Analizzare la PCR mediante elettroforesi 16 agarosica. </li><li> Se esiste un&#39;amplificazione non specificata, ripulire il gene amplificato mediante l&#39;estrazione del gel. In caso contrario, utilizzare un kit di pulizia enzimatico. </li><li> Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro controllando l&#39;assorbimentoE a 260 nm; Vuoto con buffer di eluizione 17 . </li></ol></li></ol> 2. Clonazione dei geni di interesse in un vettore del sistema di espressione multigene, pMGX 18 <ol><li> La restrizione digerisce il gene di interesse ottenuto e il vettore desiderato, pMGX, con NdeI e EcoRI. NOTA: Se si ottiene una grande quantità di plasmidi ricircolati, lasciare che la reazione NdeI proceda per 1 ora prima di aggiungere EcoRI. <ol><li> Utilizzare una reazione digestata da 40 μL contenente 0,5-1,5 μg di DNA e 1 μl di ciascun enzima con 4 μl del appropriato tampone 10x. </li><li> Per un digerimento di NdeI e EcoRI, utilizzare il tampone EcoRI e aggiungere in primo luogo l&#39;endonucleasi di NdeI. Digestare per 1 h a 37 ° C. Quindi aggiungere l&#39;endonucleasi EcoRI e consentire al digest di procedere per un&#39;ora aggiuntiva. NdeI è sensibile alle fenditure vicine alla fine del DNA, per cui la digestione iniziale da parte di EcoRI può impedire una digestione efficace da NdeI. </li></ol></li><li> elettrOforesi la digestione di restrizione sul gel agarosico (per un gene da 1 kb, utilizzare un agarosio di 0,7% a 110 V per 55 minuti; per selezionare il percentuale di gel agarosio per diverse dimensioni del gene, fare riferimento al riferimento 16 . </li><li> Inserto per accise e bande vettoriali usando uno scalpello pulito o una lama di rasoio e posizionare il segmento gel gelato in un tubo da 1,5 ml. </li><li> Estrarre il DNA dal gel agarosico usando un kit di estrazione del gel secondo il protocollo del produttore. </li><li> Ligare il gene di interesse nel vettore pMGX utilizzando un rapporto 3: 1 inserto-vettore; Impostare una legatura negativa di pMGX digerito senza l&#39;inserto. <ol><li> Impostare una reazione di ligando di 20 μL contenente 1 μL di ligasi del DNA di T4, 0,15-0,5 μg di DNA vettoriale (~ 5 μL) e una quantità appropriata di inserto basata su un rapporto tra inserto-vettore 3: 1 e dimensione di Il gene che viene inserito; Le spine pMGX sono tra i 5.312 ei 5.504 bp di dimensioni. Includere una reazione di controllo negativo che contiene tutto buIl gene che viene inserito. Assicurarsi che la quantità di DNA vettoriale sia equivalente nella legatura del controllo negativo e nel vettore più le reazioni di legatura dell&#39;inserto. </li></ol></li><li> Trasformare le reazioni di legame in cellule E. coli chimicamente competenti XL1-Blue e plasmidi ligati pMGX- yfg1 (contenenti gene di interesse 1), pMGX- yfg2 (contenente gene di interesse 2) ... pMGX- yfgn (contenente gene di interesse n). Utilizzare la tecnica asettica (all&#39;interno di un armadio di biosicurezza o sotto una fiamma). <ol><li> Mescolare 100 microlitri aliquote di E. coli XL1-Blue E. coli chimicamente competenti per ghiaccio per 5 min e quindi aggiungere 5 μL delle reazioni di legatura. Incubare per 30 minuti in ghiaccio. </li><li> Scuotere le cellule per 45 s in un bagno d&#39;acqua tenuto a 42 ° C e quindi aggiungere 200 μL di LB freddo. Incubarli in ghiaccio per 2 min. </li><li> Agitare le cellule a 37 ° C a 220 giri / min per 1 h e quindi distribuire la piastra 100 μL su una piastra LB-agar contenente un approfondimentoMarcatore selettivo selezionabile (sia ampicillina che kanamicina). </li></ol></li><li> Schermate i cloni per i trasformanti positivi. <ol><li> Confronti i conti delle colonie sulle piastre di controllo e legatura negative. È desiderato un rapporto di colonia maggiore di 1: 2. Se sul piatto di controllo negativo vi è un gran numero di colonie, tornare al punto 2.1 e rivedere la nota. </li><li> Selezionare 4-8 singole colonie (a seconda del controllo negativo: rapporto di legatura) da ciascuna reazione di legatura dei diversi geni inseriti per la screening (1 n) e inoculare 4 ml di LB e la coltura di overnight / colonia individuale adeguata antibiotica. Coltivare le culture durante la notte con agitazione a 37 ° C e 220 giri / min. </li><li> Isolare il plasmide DNA usando un kit di isolamento del DNA plasmidico secondo il protocollo del produttore. </li><li> Impostare una reazione di 20 μl di digestione NdeI + EcoRI contenente 150-500 ng di DNA e 1 μl di ciascun enzima con 2 μl del appropriato tampone 10x. In thÈ il caso, aggiungere NdeI e EcoRI allo stesso tempo in cui il gene di interesse sarà tra i siti di restrizione. Si consiglia un controllo negativo con il vettore vuoto pMGX. Digestare per 2 ore a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li></ol></li></ol> 3. Inserimento del gene 2 nel vettore pMGX contenente il gene 1, pMGX- yfg1 <ol><li> La restrizione digerisce pMGX- yfg1 con AvrII e tratta con fosfatasi intestinale del vitello (CIP). <ol><li> Utilizzare una reazione di digest di 40 μl contenente 0,5-1,5 μg di DNA vettoriale (~ 5-10 μL di DNA isolato) e 1 μL di AvrII con 4 μl del opportuno tampone da 10x. Digest per 1,5 h a 37 ° C e quindi aggiungere 1,5 μL di CIP. Lasciare a 37 ° C per altri 30 minuti. </li></ol></li><li> La restrizione digerisce pMGX- yfg2 con AvrII e XbaI per liberare il gene di interesse. <ol><li> Utilizzare una reazione digestata da 40 μL contenente 0,5-1,5 μg di DNA e 1 μ; L di ciascun enzima con 4 μl del buffer appropriato10x. Digestare per 2 ore a 37 ° C. </li></ol></li><li> Le restrizioni elettroforesi digeriscono su un opportuno gel percentuale (0,7%) di agarosio e esentano le bande di inserti e vettori usando una lama bruciata / rasoio pulita (vedere Punti 2.2-2.3). </li><li> Estrarre il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel secondo il protocollo del produttore e quantificare il DNA 17 . </li><li> Ligate il gene 2 in pMGX- yfg1 utilizzando un rapporto 3: 1 inserto-vettore. Impostare una legatura negativa di pMGX- yfg1 digerito senza l&#39;ulteriore inserto. Impostare come sopra nella fase 2.5. </li><li> Trasformare 5 μL delle reazioni di legame in cellule E. coli chimicamente competenti XL1-Blue, plasmidi ligati pMGX- yfg1,2 (contenenti gene di interesse 1 e 2) e controllo negativo pMGX- yfg1 , come si vede nel passaggio 2.6. </li><li> Paragonare il conteggio coloniale sulle piastre di controllo e di legatura negative. Un rapporto di colonia count gSi desidera un reater di 1: 2. Se ci sono un numero elevato di colonie sulla piastra di controllo negativa, tornare al punto 3.1 e rivedere il trattamento CIP. </li><li> Selezionare 4-8 singole colonie (a seconda del controllo negativo: rapporto di legamento) dalla reazione di legatura e inoculare 4 mL di LB e l&#39;antibiotico appropriato per singola colonia e crescere per una notte a 37 ° C e 220 rpm. </li><li> Isolare il plasmide DNA usando un kit di isolamento del DNA plasmidico secondo il protocollo del produttore e quantificare il DNA 17 . </li><li> Schermate l&#39;efficace inserzione del secondo gene eseguendo una digestione di restrizione di pMGX- yfg1,2 con EcoRI. <ol><li> Utilizzare una reazione digestata da 20 μL contenente 150-500 ng di DNA e 1 μl di enzima EcoRI con 2 μl di EcoRI 10x buffer. Digestare per 2 ore a 37 ° C. </li></ol></li><li> Elettroforesi digerire la restrizione su un opportuno gel percentuale di agarosio; Cercare una banda che corrispondaS alla dimensione del gene 2 (vedere il punto 2.2). Un gene può inserire nel vettore nell&#39;orientamento indesiderato e indesiderato. </li></ol> 4. Aggiunta di un terzo gene nel vettore pMGX contenente i geni 1 e 2, pMGX- yfg1,2 <ol><li> La restrizione digerisce pMGX- yfg1,2 con AvrII e trattare con CIP, come si vede al punto 3.1. </li><li> La restrizione digerisce pMGX- yfg3 con AvrII e XbaI, come si vede al punto 3.2. </li><li> Gli elettroforesi digestano la restrizione su un opportuno gel percentuale di agarosio e nell&#39;inserto di accisa e nelle bande vettoriali utilizzando una lama bruciata / rasoio pulita; Fare riferimento a Fasi 2.2-2.3. </li><li> Estrarre il DNA dal gel agarosico usando un kit di estrazione del gel e quantificare il DNA 17 . </li><li> Lignare il gene 3 in pMGX- yfg1,2 utilizzando un rapporto 3: 1 di inserto-vettore e impostare una legatura negativa di pMGX- yfg1,2 digerito senza un ulteriore inserto, come si vede al punto 3.5. </li><li> Trasformare 5 μL delle reazioni di legame in XL1 cellule E. coli chimicamente competenti, plasmide ligati pMGX- yfg1,2,3 (contenenti geni di interesse 1, 2 e 3) e controllo negativo pMGX- yfg1,2 , come si vede al punto 2.6. </li><li> Paragonare il conteggio coloniale sulle piastre di controllo e di legatura negative. Se sul piatto di controllo negativo vi è un gran numero di colonie, tornare al punto 4.1 e rivedere il trattamento CIP. </li><li> Selezionare 4-8 singole colonie (a seconda del controllo negativo: rapporto di legatura) dalla reazione di ligation e inoculare 4 mL di LB e l&#39;appropriato antibiotico per singola colonia; Crescono la notte a 37 ° C e 220 giri / min. </li><li> Isolare il DNA del plasmide usando un kit di isolamento del DNA plasmidico secondo il protocollo del produttore. </li><li> Schermate l&#39;inserimento effettivo del terzo gene eseguendo una digestione di restrizione di pMGX- yfg1,2,3 con EcoRI, come si vede nel passaggio 3.10. </li><li> Elettroforesi digerire la restrizione su un opportuno gel percentuale di agarosio; GuardaPer le bande che corrispondono alle dimensioni del gene 2 e del gene 3 (vedi punto 2.2). Nota: il gene 3 può inserire nel vettore nell&#39;orientamento indesiderato e indesiderato. Se i geni 2 e 3 sono le stesse dimensioni, è necessario selezionare un altro sito di digestione appropriato per la screening. NOTA: ripetere come necessario per ogni nuovo gene. </li></ol> 5. Produzione di proteine ​​di interesse utilizzando un sistema di espressione multigene e valutazione della produzione da Western Blotting <ol><li> Trasformare il clone positivo contenente tutti i geni di interesse in E. coli , chimicamente competenti, produttrici di proteine, come BL21- (λDE3). <ol><li> Mescolare 100 μL aliquote di E. coli chimicamente competenti BL21- (λDE3) in ghiaccio per 5 min e quindi aggiungere 1 μL del DNA plasmidico positivo clonato; Incubare per 30 minuti in ghiaccio. </li><li> Scongelamento caldo le cellule per 45 s in un bagno d&#39;acqua tenuto a 42 ° C e poi aggiungere 200 μL di LB freddo. Incubare in ghiaccio per 2 min. </li><li>Agitare le cellule a 37 ° C e 220 giri / min per 1 h e quindi distribuire la piastra 100 μL su una piastra LB-agar contenente il marcatore selettivo adatto (ampicillina o kanamicina). </li></ol></li><li> Esprimere la proteina mediante l&#39;induzione di isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG). <ol><li> Selezionare una colonia isolata dalla piastra di trasformazione B21- (λDE3) e inoculare 4 ml di LB e l&#39;antibiotico appropriato; Crescono durante la notte, scuotendo a 37 ° C e 220 giri / min. </li><li> Inoculare 100 ml di LB e la coltura antibiotica appropriata usando 1 ml di coltura overnight. </li><li> Crescere a 37 ° C con agitazione a 220 giri / min ad un OD 600 di 0,6. </li><li> Indurre la cultura con 100 μM IPTG e crescere per 15 h a 25 ° C e 220 giri / min. </li><li> Rimuovere 1 ml della coltura e centrifugare a 13.000 xg per 1 min; Scartare il surnatante. </li></ol></li><li> Lyse le cellule utilizzando la soluzione di lisi secondo le istruzioni del produttoreE preformare una macchia Western della lisi cellulare solubile per determinare se tutte le proteine ​​sono state prodotte con successo 19 . </li></ol>

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	<li>Purnick, P. E. M., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+wave+of+synthetic+biology:+from+modules+to+systems.">The second wave of synthetic biology: from modules to systems.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).</li><li>Bieniossek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Jochimsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+phosphonate+operon+gene+products+as+components+of+a+multi-subunit+complex+of+the+carbon-phosphorus+lyase+pathway.">Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).</li><li>Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+mevalonate+pathway+in+Escherichia+coli+for+production+of+terpenoids.">Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.</a> Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).</li><li>Ajikumar, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoprenoid+pathway+optimization+for+Taxol+precursor+overproduction+in+Escherichia+coli.">Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.</a> Science. 330 (6000), 70-74 (2010).</li><li>Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor-directed+biosynthesis+of+epothilone+in+Escherichia+coli.">Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).</li><li>Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialic+acid+and+N-acyl+sialic+acid+analog+production+by+fermentation+of+metabolically+and+genetically+engineered+Escherichia+coli.">Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli.</a> Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).</li><li>Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylneuraminic+Acid+Production+in+Escherichia+coli+Lacking+N-Acetylglucosamine+Catabolic+Machinery.">N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery.</a> Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).</li><li>Romier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+protein+complexes+in+prokaryotic+and+eukaryotic+hosts:+experimental+procedures,+database+tracking+and+case+studies.">Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies.</a> Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).</li><li>Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+protein+coexpression+in+Escherichia+coli.">Strategies for protein coexpression in Escherichia coli.</a> Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).</li><li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli.">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li><li>Kim, K. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-promoter+vector+is+highly+efficient+for+overproduction+of+protein+complexes.">Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes.</a> Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).</li><li>Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pST44+polycistronic+expression+system+for+producing+protein+complexes+in+Escherichia+coli.">The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).</li><li>Chen, X., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEV+protease-facilitated+stoichiometric+delivery+of+multiple+genes+using+a+single+expression+vector.">TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector.</a> Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li><li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer.">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning">https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning</a> (2016)</li><li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot</a> (2016)</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La coespressione di geni multipli è sempre più essenziale, in particolare per caratterizzare e ricostituire complessi percorsi metabolici multigene 3 , 4 , 5 . Il sistema pMGX rende coespressione multigene in routine E. coli 6 , 7 , 8 e accessibile a diversi ricercatori. In questo studio sono state dimostrate che cinque prot...

La coespressione di molteplici proteine ​​è sempre più essenziale, in particolare nelle applicazioni di biologia sintetica, in cui devono essere espressi più moduli funzionali 1 ; Nello studio dei complessi proteico-proteici, in cui espressione e funzione richiedono spesso co-espressione 2 , 3 ; E nel caratterizzare e sfruttare percorsi biosintetici, in cui ogni gene nel percorso deve essere espresso 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Sono stati sviluppati diversi sistemi per la coespressione, in particolare nell&#39;organismo ospitante Escherichia coli , il cavallo da lavoro per l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti di laboratorio 9 . Ad esempio, plasmidi multipli con differenti marcatori selectable possono essere utilizzati per esprimere singole proteine ​​usando una ricchezza di diversi es<html> Vettori di pressione 10 , 11 . I singoli sistemi plasmidi per l&#39;espressione multipla di proteine ​​hanno utilizzato sia promotori multipli per controllare l&#39;espressione di ciascun gene 10 , 12 ; Operoni sintetici, in cui i geni multipli sono codificati su una singola trascrizione 2 , 13 ; O, in alcuni casi, un singolo gene che codifica un polipeptide che viene ultimamente elaborato in modo proteolitico, fornendo le proteine ​​desiderate di interesse 14 . <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> Figura 1: flusso di lavoro pMGX che mostra la costruzione di un vettore policistronico. Il sistema pMGX fornisce una strategia flessibile e facile da usare per la costruzione di operoni sintetici sotto il controllo di un promotore T7 induttivo.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. In questo manoscritto è descritto l&#39;uso di un sistema altamente efficace per la costruzione di operoni sintetici multigene sotto il controllo di una polimerasi RNA T7 indottabile ( figura 1 ). Questo sistema permette che molti geni siano espressi simultaneamente da un plasmide. È basato su un sistema plasmidico, originariamente chiamato pKH22, che è stato utilizzato con successo per una serie di applicazioni diverse 6 , 7 , 8 . Qui, questo set di plasmidi viene ampliato per includere quattro vettori correlati: pMGX-A, un vettore di espressione privo di qualsiasi etichetta C- o N-terminale e con il marker di resistenza dell&#39;ampicillina; PMGX-hisA, un vettore di espressione che codifica un tag di esahistidina N-terminale e con il marker di resistenza dell&#39;ampicillina; PMGX-K, un vettore di espressione lAcking qualsiasi etichetta C- o N-terminale e con il marker di resistenza alla kanamycina; E pMGX-hisK, un vettore di espressione che codifica un tag di hexahistidine N-terminale e con il marker di resistenza alla kanamycina. In questo studio è stato dimostrato il metodo per la generazione di un vettore polistronicico contenente cinque geni usando il sistema pMGX, in particolare pMGX-A, insieme alla produzione di ogni singola proteina in Escherichia coli .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Enzymes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) chemically comeptent cells</td><td></td><td></td><td>Comeptent cell prepared in house</td></tr><tr><td>B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Supplied with polymerase</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized instant skim milk powder</td><td>Local grocery store</td><td></td><td>No-name grocery store milk is adequate</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td><td>10600007</td><td>Membrane PT 0.45 &amp;micro;m 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Isolation Kit</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy Lab</td><td></td><td>Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Intergrated DNA Technologies</td><td></td><td>Design primers as needed for desired gene</td></tr><tr><td>Synthetic Gene</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Design and optimize as needed</td></tr><tr><td>Thick Blot Filter Paper</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue chemically competent cells</td><td></td><td></td><td>Comeptent cell prepared in house</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>Gel box - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td></tr><tr><td>Gel Imager</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager EC</td></tr><tr><td>Incubator-oven</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Incubator-shaker</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td>MaxQ 6000</td></tr><tr><td>Personna Razors</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>VWR International</td><td>M-10E,6W</td><td></td></tr><tr><td>Thermocylcer</td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Personal, supplied by Sigma</td></tr><tr><td>UV Face-Shield</td><td></td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot Cell</td></tr></tbody></table>

inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx

La coespressione di molteplici proteine ​​è sempre più essenziale per la biologia sintetica, studiando complessi proteico-proteici e caratterizzando e sfruttando percorsi biosintetici. In questo manoscritto è descritto l&#39;uso di un sistema altamente efficace per la costruzione di operoni sintetici multigene sotto il controllo di una polimerasi RNA T7 indottabile. Questo sistema permette che molti geni siano espressi simultaneamente da un plasmide. In questo caso, un insieme di quattro vettori correlati, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K e pMGX-hisK, con il marker selettivo di resistenza a ampicillina o kanamycina (A e K) e posseggono o mancano di una esahistidina N-terminale (Il suo) sono divulgati. Sono forniti protocolli dettagliati per la costruzione di operoni sintetici che utilizzano questo sistema vettoriale, insieme ai dati corrispondenti, che dimostrano che un sistema basato su pMGX contenente cinque geni può essere facilmente costruito e utilizzato per produrre tutte e cinque le proteine ​​codificate in Escherichia coli . Questo sistemaEm e il protocollo consentono ai ricercatori di esprimere in modo frequente moduli multipli complessi e percorsi in E. coli .

In questo studio, l&#39;obiettivo era quello di co-esprimere cinque proteine ​​da un unico plasmide. I frammenti di gene sintetici ottimizzati a cinque codoni che codificano i tag di esahistidine di N- o C-terminali sono stati acquistati in commercio. I geni sintetici sono stati amplificati mediante PCR e clonati individualmente in un vettore PCR-blunt e sequenziati. Per generare il plasmide policistronico, i cinque geni di interesse sono stati prima clonati in un idoneo plasmide pMG...

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Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Questo studio descrive metodi per la coespressione mediata da T7 di geni multipli da un singolo plasmide in Escherichia coli usando il sistema plasmid pMGX.

Inducibile T7 RNA Polymerase-mediato sistema di espressione multigene, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K Views.  University of Ottawa.  Questo studio descrive metodi per la coespressione mediata da T7 di geni multipli da un singolo plasmide in Escherichia coli usando il sistema plasmid pMGX. 

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Ricerca

Ambiente

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

Controllabile Espressione Ion Canale attraverso inducibile trasfezione transiente

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Genetica

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly useful. Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based constructs is an efficient method for genetic manipulation of hepatocytes in adult mice. In addition to constitutive transgene expression, this system can be used for more advanced applications, such as shRNA-mediated gene knock-down, implication of the CRISPR/Cas9 system to induce gene mutations, or inducible systems. Here, the combination of constitutive CreER expression together with inducible expression of a transgene or miR-shRNA of choice is presented as an example of this technique. We cover the multi-step procedure starting from the preparation of sleeping beauty-transposon constructs, to the injection and treatment of mice, and the preparation of liver tissue for analysis by immunostaining. The system presented is a reliable and efficient approach to achieve complex genetic manipulations in hepatocytes. It is specifically useful in combination with Cre/loxP-based mouse strains and can be applied to a variety of models in the research of liver disease.

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based integration vectors enables stable transfection of murine hepatocytes in vivo. Here, we present a practical protocol for transfection systems that enables the long-term constitutive expression of a single transgene or combined constitutive and doxycycline-inducible expression of a transgene or miR-shRNA in the liver.

Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene switches requires the transfer of two therapeutic expression units concurrently into a single cell, the practical application of the system for gene therapy is limited. To simplify the transgene expression system, we generated a gene switch designated as pEUI(+) encompassing a complete set of transgene expression modules in a single vector. Comprising of the GAL4 DNA-binding domain and modified EcR (GvEcR), a minimal VP16 activation domain fused with a GAL4 DNA-binding domain, as well as a modified Drosophila ecdysone receptor (EcR), the newly developed singular gene switch is highly responsive to the administration of a chemical inducer in a time- and dosage-dependent manner. The pEUI(+) vector is a potentially powerful tool for improving the control of transgene expression in both biological research and pre-clinical studies. Here, we present a detailed protocol for modulation of a transient and stable transgene expression using pEUI(+) vector by the treatment of tebufenozide (Teb). Additionally, we share important guidelines for the use of Teb as a chemical inducer.

Here, we present a protocol for the modulation of transgene expression using pEUI(+) singular gene switch by tebufenozide treatment.

Un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare Gene per deliberata espressione del Transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Viscoelastica, espressione di tipo specifico delle cellule in Arabidopsis thaliana attraverso LhGR-mediata Trans-attivazione

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Produzione su larga scala di RNA ricombinante su un'impalcatura circolare utilizzando un sistema derivato Viroid in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Biochimica

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

L&#39;applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Immunologia e infezioni

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

RNA polimerasi legata al DNA per la trascrizione in vitro programmabile e il calcolo molecolare

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Bioingegneria

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Biologia

Inducible Tet-On Regulatable System-Based Gene Expression In Vivo: A Tetracycline-Induced Gene Expression System for Target Gene Transcription Activation in Mouse Model

Source: Hubner, E. K. et al.&#160; <a href="https://www.jove.com/v/56613">Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the tetracycline, or Tet-On, gene expression system in a mouse model. In the presence of doxycycline, a tetracycline derivative, the Tet-On system consisting of reverse tetracycline-controlled transactivator protein becomes activated and expresses the gene of interest.

Espressione genica basata su un sistema regolabile inducibile Tet-On in vivo: un sistema di espressione genica indotta da tetraciclina per l'attivazione della trascrizione genica bersaglio in un modello murino

Source: Hubner, E. K. et al.&#160; Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein ...

Inducibile T7 RNA Polymerase-mediato sistema di espressione multigene, pMGX

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Transient espressione genica in tabacco con all'Assemblea Gibson e Gene Gun