Questo metodo fornisce una piattaforma ad alta produttività per lo screening di Salmonella e Shigella. Il vantaggio principale di questa tecnica è la ripetizione, la specificità, la sensibilità e l'elevata produttività. Questa tecnica combina il metodo e la coltura veloci NAAT in cui è stato applicato prima lo screening PCR in tempo reale, e poi quelli positivi sono stati inviati per la coltura e l'identificazione dei batteri.
Sebbene questo metodo si concentri sullo screening di Salmonella e Shigella, può anche essere applicato ad altri agenti patogeni come Vibrios, Staphylococcus, E.Coli ed eccetera. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la selezione della colonia corretta è difficile a causa della flora di fondo nei campioni. Per iniziare, aggiungere tre millilitri di brodo nutriente a ciascun campione.
Quindi, incubare i campioni a 36 gradi Celsius per sei ore. Successivamente, centrifugare la coltura pre-arricchimento a 800 g per due minuti. Quindi, trasferire il supernatante su un nuovo tubo e centrifugarlo di nuovo per cinque minuti a 12.000 g.
Dopo aver scartato il supernatante, aggiungere 100 microlitri della soluzione di estrazione del DNA al pellet. Quindi, vortice il tubo per un minuto. Quindi, riscaldare il campione a 1.000 gradi Celsius nel bagno secco.
Dopo aver ripetuto la centrifugazione, raccogliere il supernatante in un nuovo tubo. Innanzitutto, creare la miscela di reazione e impostare il programma di ciclismo in base al protocollo di testo. Quindi, eseguire PCR in tempo reale su una macchina PCR fluorescente in tempo reale.
In primo luogo, aggiungere 100 microlitri della coltura pre-arricchimento a cinque millilitri di mezzo cristallino di selenite. Quindi, incubare la coltura a 36 gradi Celsius per 18-24 ore. Quindi, raccogli un anello della cultura e diffondilo su un piatto.
Quindi, incubare il piatto a 36 gradi Celsius per 18-24 ore. Dopo l'incubazione, selezionare colonie sospette e trasferirle su un piatto. Incubare la piastra a 36 gradi Celsius per 18-24 ore.
Quindi, identificare la colonia sospetta utilizzando un sistema di identificazione microbica automatizzato. Per iniziare la caratterizzazione dell'O-antigene, aggiungete una goccia dei sieri polivalenti dell'O-antigene a una diapositiva pulita. Trasferire un anello della colonia nello scivolo e macinarlo nella sieri.
Se i batteri sembrano sabbia che scorre, ripetere il trattamento precedente con sieri monovalenti O-antigen fino a quando l'antigene non è caratterizzato. Per iniziare la caratterizzazione dell'antigene H, aggiungere una goccia di sieri polivalenti ad antigene H a una diapositiva pulita. Quindi, raccogli un loopful della colonia e griglialo nella sera.
Utilizzare sieri monovalenti ad antigene H per ripetere il trattamento fino a quando non viene caratterizzato lo specifico antigene H. Per separare la coltura, raccogliere un anello della coltura pre-arricchimento e stenderlo su un piatto. Quindi, incubare il luogo a 36 gradi Celsius per 18-24 ore.
Dopo l'incubazione, raccogli una colonia dall'aspetto sospetto su un piatto. Incubare la piastra a 36 gradi Celsius per 17-24 ore. Quindi, sottosostire la colonia all'identificazione biochimica utilizzando un sistema di identificazione microbica automatizzato.
Quindi, applicare una goccia di sieri polivalenti della specie Shigella su uno scivolo pulito. Quindi, usa un micro-loop per raccogliere alcuni dei batteri e macinarli nei sieri. Infine, se i sieri assomigliano alla sabbia che scorre, utilizzare sieri monovalenti della specie Shigella per caratterizzare ulteriormente i batteri.
Utilizzando questo protocollo, campioni di feci provenienti da pazienti sono stati vengono vengono vengono vengono Utilizzando la PCR in tempo reale, c'è stata un'amplificazione riuscita nel canale HEX, indicando che il campione era positivo per le specie di Salmonella. Un'ulteriore PCR in tempo reale ha indicato che il secondo campione era positivo per la Salmonella ed è stato scelto per la coltura guidata delle specie di Salmonella.
Nella coltura guidata delle specie di Salmonella, le colonie rosa e viola sono state placcate separatamente e sottoposte a identificazione biochimica. I risultati hanno indicato che le colonie del secondo campione erano Salmonella paratyphi B.Utilizzando PCR in tempo reale, c'è stata un'amplificazione riuscita nel canale FAM, indicando che il campione era positivo per le specie di Shigella. Ulteriori PCR in tempo reale indicavano che il campione 10 era positivo per Shigella ed è stato scelto per la cultura guidata.
Nella cultura guidata delle specie shigella, le colonie rosa-rosse e incolori sono state placcate separatamente e sottoposte a identificazione biochimica. I risultati indicavano che il campione 10 conteneva batteri shigella sonnei di fase II. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare la limitazione del metodo dovuta alla variazione della sequenza.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come le impostazioni cultura dirette, al fine di evitare risultati PCR falsi negativi in tempo reale. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo del rilevamento di Salmonella e Shigella, poiché il nuovo protocollo potrebbe aumentare il tasso positivo di due volte e ridurre significativamente il carico di lavoro e il TAT. Non dimenticare che lavorare con Salmonella e Shigella può essere estremamente pericoloso e i dispositivi di protezione individuale, DPI, dovrebbero essere sempre presi durante l'esecuzione di questa procedura.
