Il campo di ricerca di Shigella attualmente manca di saggi ben definiti per esaminare il ruolo funzionale degli anticorpi generati dall'immunizzazione o dall'infezione. Questo saggio rappresenta un metodo ben definito per qualificare queste risposte immunitarie e misurare l'attività battericida di anticorpi specifici di Shigella. Il vantaggio principale di questo saggio è che consente un'analisi ad alta produttività di più campioni.
Le tecniche utilizzate in questo protocollo riducono notevolmente il tempo pratico e il tempo complessivo di dosaggio per misurare l'uccisione batterica diretta di anticorpi e campioni di siero. Per iniziare, incubare i campioni in un bagno d'acqua calda a 56 gradi Celsius per 30 minuti per riscaldare e attivare i campioni di prova. Ottenere una piastra di dosaggio e 20 microlitri di tampone di dosaggio alle colonne da una a dodici di righe da A a G.Aggiungere 20 microlitri di tampone di dosaggio alle colonne uno e due di fila H.Load 30 microlitri di ciascun campione di prova e duplicare alla riga H della piastra di dosaggio.
Per iniziare a eseguire diluizioni seriali triplicate dei campioni di prova, utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere 10 microlitri dai pozzi da 3H a 12H. Trasferire i campioni nei pozzi corrispondenti di fila G e pipetta su e giù da 8 a 10 volte per mescolare bene il campione. Quindi, rimuovere 10 microlitri da questi pozzi.
Trasferire nei pozzi corrispondenti in fila F e pipetta su e giù da 8 a 10 volte per mescolare. Continuare questo processo di diluizione seriale attraverso la riga A.Dopo aver mescolato i pozzi nella fila A, rimuovere e scartare 10 microlitri dai pozzi da 3A a 12A in modo che il volume finale in tutti i pozzi sia di 20 microlitri. Recuperare una fiala di calcio batterico bersaglio congelato e scongelarla a temperatura ambiente.
Quindi, diluire i batteri in 20 millilitri di tampone di dosaggio. in base al fattore di diluizione ottimale predeterminato. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 10 microlitri di batteri diluiti ad ogni pozzo della piastra di dosaggio.
Recupera una fiala di baby rabbit complimento congelato e una fiala di BRC attivato dal calore congelato. Utilizzare acqua corrente fredda per scongelare le fiale a temperatura ambiente. Quindi, mescolare 100 microlitri di BRC attivato dal calore con 400 microlitri di tampone di dosaggio.
Aggiungere 50 microlitri di questa soluzione BRC attivata termicamente al 20% a tutti i pozzi della prima colonna. Mescolare un millilitro di BRC nativo con quattro millilitri di tampone di dosaggio. Aggiungere 50 microlitri di questa miscela del 20% a tutti i pozzi nelle colonne da due a dodici.
Posizionare la piastra uno uno shaker per 10-15 secondi per mescolare delicatamente la piastra di dosaggio. Incubare la piastra di dosaggio in un'incubatrice microbiologica per due ore. Nel frattempo, rimuovere i coperchi dalle due piastre LB Agar e posizionare le piastre a faccia in su in un armadietto di sicurezza biologico per 40-60 minuti per asciugare.
Al termine dell'incubazione, trasferire la piastra di dosaggio sul ghiaccio umido e incubare per 10-20 minuti per interrompere la reazione. Utilizzando una pipetta a dodici canali, mescolare i pozzi in fila H e individuare 10 microlitri della miscela di reazione sul fondo di una piastra LBA. Inclinare immediatamente la piastra e lasciare correre le macchie per circa 1,5-2 centimetri.
Ripetere questa procedura per le righe G, F ed E, individuandole sopra la riga precedente. Incubare le piastre LBA a temperatura ambiente fino a quando la soluzione non viene assorbita nelle piastre LBA. Quindi, metti i coperchi sulle piastre e trasferiscili a testa in giù in un incubatore microbiologico per incubare durante la notte.
Il giorno successivo, aggiungere 25 millilitri di Agar sovrapposto a 55 gradi celsius, contenenti 100 microgrammi per millilitro TTC e 0,1% di azide di sodio a ogni piastra LBA. Incubare a 37 gradi celsius per due ore per consentire ai batteri sopravvissuti di sviluppare un colore rosso. Quindi, usa una fotocamera digitale per fotografare le lastre.
Trasferisci le immagini su un computer e usa il software di enumerazione delle colonie integrate del NIST per analizzare le immagini come delineato nel protocollo di testo. Le piastre LBA rappresentative dimostrano che lo sviluppo del colore ha avuto luogo dopo l'incubazione notturna e l'aggiunta di sovrapposizione, con tutte le colonie sopravvissute visibili in rosso. L'uccisione batterica è chiaramente visibile per tutti i campioni testati nelle prime tre diluizioni.
Una diminuzione dell'uccisione batterica è vista come campioni vengono diluiti più in alto nella piastra e il siero è meno concentrato. I conteggi dei microcoloni vengono quindi eseguiti utilizzando il software NIST. Viene quindi calcolato il conteggio CFU medio per ogni diluizione di ogni campione, così come il valore di uccisione del 50%.
Questo valore di killing del 50% viene quindi applicato ai CFC medi per ogni diluizione siere per determinare i valori necessari per calcolare il KI SBA. Questo protocollo si basa su una placcatura batterica coerente e uniforme su LB Auger. Una buona tecnica di placcatura e inclinazione dei punti consentirà la crescita di microcoloni discreti e un accurato conteggio delle colonie. Questa tecnica utilizza Shigella virulento vivo e richiede un'appropriata tecnica aseptica e DPI per garantire che i batteri siano maneggiati in modo sicuro secondo le procedure BSL 2.
