Ringraziamo Christina Pyrgaki, Tao Tong e Alison North da centro di risorse di Bioimmagini presso la Rockefeller University per assistenza e supporto. Ringraziamo anche Xiphias Ge Zhu per l'editing di film. Questo lavoro è stato supportato da Human Frontier Science programma organizzazione (PC).

Sperimentazione e cura degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dal comitato di utilizzo presso la Rockefeller University e istituti di cura degli animali.
1. tessuto preparazione
<ol><li>Eseguire standard perfusione intracardiaca con ~ 20 mL di 1x tamponato fosfato salino (PBS) a 4 ° C fino a quando il sangue viene completamente rimosso dal tessuto.</li>
	<li>Passare il perfusato ~ 20 mL di soluzione fissante (4% paraformaldeide (PFA) in PBS 1X) a 4 ° C fino a quando il collo e la coda sono notevolmente irrigidito. Attenzione: PFA è tossico. Evitare il contatto con pelle, occhi e mucose. Soluzioni dovrebbero essere fatto all'interno di una cappa aspirante.</li>
	<li>Sezionare i rilievi grassi di interesse attentamente per rimuovere il cuscinetto di grasso intero senza danneggiarlo. Utilizzare forcipe smussato-conclusa per evitare di pizzicare o comprimendo il tessuto. Evitare di contaminare il tessuto dissecato con qualsiasi pelliccia.</li>
	<li>Post-fissare il tessuto in 4% PFA in PBS 1X durante la notte a 4 ° C. Per ogni rilievo grasso, post-fissare con ~ 10 mL di soluzione di fissazione in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Lavare il tessuto 3 volte (1 h ciascuna) con 1x PBS a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Conservare il tessuto per a breve termine (fino a 2 settimane) in PBS 1X a 4 ° C e al riparo dalla luce. Per l'archiviazione a lungo termine (ad es., 1-2 anni), passare il buffer 1X PBS sodio azide 0.05% (come conservante). Attenzione: La sodio azide è altamente tossica se ingerito per via orale o assorbito attraverso la pelle. Concentrato di soluzioni (almeno 5% o superiore) devono essere gestite sotto una cappa di sodio azide.</li>
</ol>2. delipidizzazione e permeabilizzazione
Timing: 1-2 giorni
<ol><li>Preparare il 20%, 40%, 60% e 80% di pendenza metanolo con B1n buffer (tabella 1) (v/v), ad esempio, per il 20% metanolo/B1n buffer, mescolare 20 mL di metanolo e 80 mL di tampone B1n. Memorizzare tutti i buffer a 4 ° C. Cristalli di glicina precipiterà dal buffer di metanolo/B1n 60% e 80% a causa della saturazione. Evitare di rimuovere i cristalli; utilizzare la soluzione liquida per i seguenti lavaggi. Attenzione: Il metanolo è volatile, irritante ed infiammabile. Evitare il contatto di occhio e pelle.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente i capelli dal campione sotto un microscopio di dissezione. Tutti i capelli, pelucchi o detriti attaccato al campione causerà ombre durante la formazione immagine. Trasferire il campione pulito in una nuova provetta.</li>
	<li>Eseguire tutti i passaggi seguenti in ghiaccio o a 4 ° C se non diversamente indicato. Per i piccoli campioni (ad es., posteriore cuscinetti adiposi sottocutanei/perigonadal da giovani topi magri), è possibile utilizzare provette microcentrifuga da 2 mL con 1,6 mL della soluzione. Per campioni di grandi dimensioni o campioni con un contenuto lipidico elevato (ad es., cuscinetti adiposi da topi obesi), è possibile utilizzare provette da 5 mL con 4 mL di soluzione.<ol>
<li>Disporre le provette contenenti i campioni orizzontalmente su agitatore orbitale a ~ 100 giri/min. Assicurarsi che i campioni possono muoversi liberamente all'interno del tubo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disidratare il campione in una serie graduata di 20%, 40%, 60%, 80% e 100% metanolo/B1n tampone per il tempo indicato (tabella 2). Ridurre al minimo la soluzione di riporto.</li>
	<li>Delipidate il campione con 100% diclorometano (DCM) (3 volte), ciascuno con il tempo di incubazione indicato nella tabella 2. Il campione dovrebbe affondare sul fondo del tubo all'estremità dei lavaggi DCM secondo e terzi. Se non, estendere il tempo di incubazione per garantire delipidizzazione completo (ad esempio, si estendono da 30 min a 1-2 h). Attenzione: DCM dovrebbe essere gestito all'interno di una cappa aspirante. Utilizzare contenitori di vetro per deposito e microcentrifuga tubi che sono realizzati in polipropilene per le incubazioni. La microcentrifuga non dovrebbe essere utilizzato per l'archiviazione a lungo termine di DCM. Capsule di Petri e pipette sierologiche che sono realizzati in polistirene non sono compatibili con DCM. DCM è altamente volatile. Trasferire il campione nella soluzione fresca rapidamente per evitare la disidratazione.</li>
	<li>Lavare due volte con 100% di metanolo per il tempo indicato (tabella 2).</li>
	<li>Opzionale: Se il campione non è ben irrorato, il colore dell'emoglobina dai globuli rossi restanti potrebbe causare forte autofluorescenza. Candeggiare con 5% H2O2 in metanolo (1 volume di 30% H2O2 fino a 5 volumi di metanolo) durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Reidratare il campione in una serie di buffer di metanolo/B1n invertita: 80%, 60%, 40%, 20% metanolo/B1n e 100% B1n tampone (2 volte) per il tempo indicato (tabella 2).</li>
	<li>Lavare il campione con un tampone di PTxwH (tabella 1) per 2 h a TA.</li>
	<li>Conservare il campione di delipidated nel buffer di PTxwH a 4° C (fino a 1 anno) o procedere immediatamente con il passaggio di immunostaining.</li>
</ol>3. l'intero Monte Immunostaining
Timing: 8-10 giorni
Nota: Tutti i passaggi seguenti dovrebbero essere eseguiti presso RT se non diversamente indicato, con agitazione e protezione dalla luce. Per i piccoli campioni, utilizzare provette microcentrifuga da 2 mL con 1.6 mL di soluzione. Per campioni di grandi dimensioni, è possibile utilizzare provette da 5 mL con 4 mL di soluzione. Si consiglia di convalidare prima gli anticorpi su piccoli pezzi di tessuti o sezioni di tessuto metanolo-trattati.
<ol><li>Diluire l'anticorpo primario nel buffer di PTxwH per la concentrazione consigliata. Centrifugare la soluzione di anticorpo diluito a ~ 20.000 x g per 10 min impedire l'introduzione dell'anticorpo precipitati o aggregazioni.</li>
	<li>Incubare il campione di delipidated con la soluzione di anticorpo primario per il tempo indicato (tabella 2).</li>
	<li>Lavare il campione con il tampone di PTxwH in una serie di fasi di incubazione: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2h, 4h e pernottamento.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo secondario nel buffer di PTxwH per la concentrazione consigliata. Centrifugare la soluzione di anticorpo diluito a ~ 20.000 x g per 10 min impedire l'introduzione dell'anticorpo precipitati o aggregazioni. Nota: Per evitare l'alta priorità bassa causata da tessuto autofluorescenza, anticorpi secondari coniugati con fluorofori che emettono luce nelle regioni rosse e da' raccomanda. A seconda del numero di linee laser disponibili su un microscopio, fino a 3-4 marcatori possa essere imaged simultaneamente in un campione.</li>
	<li>Incubare il campione con la soluzione di anticorpo secondario per il tempo indicato (tabella 2).</li>
	<li>Esempio di lavare con buffer di PTxwH in una serie di fasi di incubazione: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2h, 4h e pernottamento.</li>
	<li>Facoltativo: Per i tipi di tessuto che sono fragili, fissare il tessuto macchiato con 4% PFA in 1X PBS durante la notte a 4 ° C per aiutare a preservare la morfologia del tessuto. Nota: Questo passaggio può aumentare la formazione immagine di sfondo. Non è necessario eseguire questo passaggio per il tessuto adiposo.</li>
	<li>Lavare il campione con PBS 1X in una serie di fasi di incubazione: 5 min, 10 min e 30 min.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente il panno dal campione sotto un microscopio di dissezione.</li>
</ol>4. tessuto schiarimento
Timing: 1-2 giorni
<ol><li>Opzionale: Incorporare il campione in agarosio per facilitare il montaggio del campione per microscopia luce-foglio. Nota: Questo passaggio è fortemente consigliato per il tessuto adiposo stabilizzare la sua forma durante la formazione immagine.<ol>
<li>Preparare la soluzione di incasso con 1% di agarosio in 1X PBS (w/v). Raffreddare la soluzione incorporamento a ~ 40 ° C per evitare di esporre il campione ad un calore eccessivo.</li>
		<li>Posizionare il campione pulito in uno stampo (per esempio, capsula di Petri o barca di pesatura) e disporlo nella posizione desiderata. Evitare qualsiasi residuo liquido. Delicatamente e versare la soluzione incorporamento sopra il campione. Evitare eventuali bolle d'aria.</li>
		<li>Lasciate che l'agarosio solidificare completamente alla RT. Cut un blocco contenente il campione. Nota: Tutti i passaggi seguenti, tra cui le incubazioni overnight dovrebbe essere eseguiti alla RT, con agitazione e protezione dalla luce. Per i piccoli campioni, utilizzare provette microcentrifuga da 2 mL con 1.6 mL di soluzione. Per campioni di grandi dimensioni, è possibile utilizzare provette da 5 mL con 4 mL di soluzione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disidratare il campione sfumatura di metanolo con H2o: 25%, 50%, 75% e 100% (3 volte) per il tempo indicato (tabella 2). Nota: Il campione può essere lasciato durante la notte presso il passo di 100% di metanolo.</li>
	<li>Incubare il campione in DCM 100% per 1 h con agitazione (3 volte). Campione dovrebbe affondare sul fondo del tubo alla fine di ogni lavaggio DCM. In caso contrario, estendere il tempo di incubazione per assicurare la completa rimozione del metanolo. Campione può essere lasciato durante la notte presso il passo di DCM 100%.</li>
	<li>Incubare il campione in dibenzyl etere (DBE) durante la notte con lieve agitazione per ottenere l'indice di rifrazione di corrispondenza. Nota: Esempio finirà per diventare trasparente alla luce visibile. Attenzione: DBE è pericoloso. Evitare il contatto con la pelle. Essere gestito all'interno di una cappa aspirante con guanti a doppio strato. Scartare i guanti, non appena fosse stato contaminato da DBE. Utilizzare contenitori di vetro per tubi deposito e microcentrifuga (polipropilene) per le incubazioni. La microcentrifuga non dovrebbe essere utilizzato per l'archiviazione a lungo termine di DBE. Capsule di Petri e pipette sierologiche che sono realizzati in polistirene non sono compatibili con DBE. Pulire qualsiasi fuoriuscita con etanolo al 100%.</li>
	<li>Incubare il campione con DBE fresco con lieve agitazione per 2 h. Store il campione a temperatura ambiente al buio o procedere direttamente all'imaging. Nota: I campioni sono raccomandati per essere imaged entro un mese. Anche se alcuni fluorofori sono più stabili rispetto ad altri, stoccaggio a lungo termine dei campioni in questa fase non è raccomandato.</li>
</ol>5. microscopia
<ol><li>Imaging con un microscopio di luce-foglio che è compatibile con DBE. Nota: Solo gli obiettivi che sono approvati per l'imaging di solvente organico e abbinati con l'indice di rifrazione di DBE utilizzabile come immersione obiettivi nell'imaging DBE-immerso.<ol>
<li>Montare il campione dell'agarosi-incastonato su un supporto che possa impedire il movimento durante la formazione immagine. Immergere il campione in una camera piena di DBE.</li>
		<li>Raccogliere uno z-stack che copre la totalità del campione (ad es., ingrandimenti di 1-2) per ottenere tutto-tessuto distribuzione/struttura del marcatore di interesse.</li>
		<li>Passare a un obiettivo con ingrandimento maggiore (ad es., ingrandimento X 4-12) per ingrandire le regioni di interesse all'immagine dettagliata strutture. Nota: Il collagene è un contributore importante alla matrice extracellulare del tessuto adiposo, che circonda tutte le cellule di grasso13. Il collagene ha un tipico spettro di emissione che vanno circa 400 nm a 550 nm14. Il campione con la linea di 488 laser (verde) di imaging e raccogliendo la luce emessa ad una gamma di lunghezza d'onda che si trova all'interno dello spettro di emissione del collagene (ad es., 525-550 nm) fornirà il segnale di autofluorescenza del tessuto, che precedentemente è stato indicato per delineare il contorno delle cellule grasse e complessivo tessuto architettura12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging con un invertito confocale o un microscopio a due fotoni.<ol>
<li>Inserire l'esempio dell'agarosi-incorporato in una diapositiva di camera con un fondo di vetro senza toccare le parti in plastica (o altra camera imaging DBE-compatibile che può sigillare). Assicurarsi di che DBE non fuoriuscire.</li>
		<li>Scegliere gli obiettivi con distanze di lavoro più a lungo per ottenere una penetrazione più profonda. Nota: La formazione immagine dovrebbe essere fatto con un microscopio invertito confocale o due fotoni attraverso il fondo di vetro della diapositiva da camera. Evitare il contatto diretto tra il campione e obiettivi che non sono suggeriti per acquisizione di immagini basata su DBE di immersione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Adipo-Clear è un metodo semplice e robusto per l'eliminazione del tessuto adiposo, che può essere facilmente eseguito in una configurazione di laboratorio regolari. In confronto ad altri metodi di schiarimento solvente come iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear è particolarmente ottimizzata per la rimozione del tessuto adiposo e altri tessuti con alto contenuto di grassi. Il passo di delipidizzazione rimuove completamente i ...

Fino a poco tempo, il tessuto adiposo fu concepito come un insieme amorfo di cellule adipose. Negli ultimi decenni, la nostra comprensione è cresciuta più sofisticato, con grasso ora riconosciuta per essere un organo complesso contenente diversi tipi di adipociti, così come precursori degli adipociti, cellule immunitarie, fibroblasti, il sistema vascolare e proiezioni del nervo. Interazioni tra queste cellule adiposo residenti hanno pronunciato effetti sul tessuto adiposo e organismal fisiologia e patofisiologia1. Anche se gli studi emergenti hanno dipanato importanti meccanismi molecolari alla base di determinate interazioni, una comprensione più completa richiede affidabile analisi strutturale del tessuto intero in tre dimensioni (3D).
Nostra attuale conoscenza della morfologia del tessuto adiposo è in gran parte basata sull'analisi istologica di sezioni sottili (5 μm) con formazione immagine relativamente ad alto ingrandimento (più di 10 volte)2,3. Tuttavia, questo approccio presenta diverse limitazioni significative. Prime, intricate strutture filamentose quali nervi simpatici e il sistema vascolare, che sono conosciuti per svolgere un ruolo importante nella funzione adiposa4,5,6,7, sono difficili da valutare attraverso sezioni sottili. In secondo luogo, grazie alla sua forma apparentemente amorfo e la mancanza di unità strutturali rappresentativi di concentrarsi su, è difficile apprezzare il tessuto adiposo strutture basate solo sulla sezione macchiatura. In terzo luogo, il tessuto adiposo ha un contenuto di lipidi molto alta, la creazione di sfide nell'ottenere sezioni di serie coerente che sono adatte per 3D ricostruzione anatomica, un metodo convenzionale utilizzato per studiare il cervello intero morfologia8. Considerati questi fattori, c'è un grande bisogno di un approccio di intero-monta che può fornire una visualizzazione 3D di un intero deposito adiposo ottenendo ancora cellulare ad alta risoluzione.
Imaging 3D volumetrico di un intero organo è impegnativo a causa degli effetti di oscuramento della dispersione della luce. Delle principali fonti di dispersione della luce nei tessuti biologici proviene da interfacce del lipido-acquosa. Anche se gli sforzi per eliminare dispersione rimuovendo i lipidi sono in corso da oltre un secolo, ci sono stati un gran numero di recenti innovazioni9. Un tale metodo di recente sviluppato del tessuto-schiarimento è abilitato immunolabeling imaging 3D degli organi solvente-deselezionata (iDISCO / iDISCO +)10,11. Tuttavia, il tessuto adiposo presenta una sfida particolare, data il suo alto livello di lipidi e di conseguenza, ulteriori modifiche per il iDISCO / iDISCO + protocollo sono necessaria per estrarre completamente i lipidi, proteggendo il tessuto dal collasso. Il protocollo modificato che abbiamo sviluppato, ora chiamato Adipo-Clear, impiega basate su metanolo/diclorometano delipidizzazione del tessuto adiposo per ottenere trasparenza ottima per imaging volumetrico ad alta risoluzione12. Perché la delipidizzazione passo in gran parte placa in modo endogeno espresse proteine fluorescenti come GFP e RFP, visualizzazione di tali proteine dovrà essere raggiunti da immunolabeling. Nel complesso, questo protocollo semplice e robusto può essere applicato per studiare organizzazione di livello del tessuto delle cellule adiposo-residente, l'analisi di lignaggio di cellule progenitrici degli adipociti e adiposa morfogenesi durante lo sviluppo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>325-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl ether</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71289-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3628</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1957</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Ultramicroscope II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Imspector software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy visualization software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

Tessuto adiposo gioca un ruolo centrale nell'omeostasi energetica e termoregolazione. Esso è composto da diversi tipi di adipociti, così come precursori degli adipociti, cellule immunitarie, fibroblasti, vasi sanguigni e le proiezioni del nervo. Sebbene il controllo molecolare di specifica del tipo di cellula e come interagiscono queste cellule sono state sempre più delineate, una comprensione più completa di queste cellule adiposo-residente si può visualizzare la loro distribuzione e architettura durante l'intero tessuto. Approcci attuali di immunoistochimica e immunofluorescenza per analizzare l'istologia adiposa si basano su sezioni sottili di paraffina. Tuttavia, sezioni sottili catturano solo una piccola porzione di tessuto; di conseguenza, le conclusioni possono essere prevenute da quale parte del tessuto è analizzato. Abbiamo quindi sviluppato un tessuto adiposo compensazione tecnica, Adipo-Clear, per consentire la completa visualizzazione tridimensionale di modelli cellulari e molecolari in tessuti adiposi interi. Adipo-Clear è stato adattato da iDISCO / iDISCO +, con specifiche modifiche apportate a rimuovere completamente il lipido immagazzinato nel tessuto, preservando la morfologia del tessuto nativo. In combinazione con microscopia di fluorescenza di luce-foglio, dimostriamo qui l'uso del metodo Adipo-Clear per ottenere immagini ad alta risoluzione volumetriche di un intero del tessuto adiposo.

Adipo-Clear preparato intero grasso pastiglie possono essere imaged in 3D per analizzare come interazioni cellulari e morfologia del tessuto sono interessate negli stati magri ed obesi. Questo metodo può essere applicato facilmente per analizzare la struttura adiposa generale raccogliendo il segnale di autofluorescenza del tessuto nel canale verde. Precedentemente abbiamo indicato che l'autofluorescenza segnale in overlay adiposo favorevolmente con perilipina macchiatura, un indicatore c...

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Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

A causa del contenuto elevato del lipido, tessuto adiposo è stato impegnativo per visualizzare usando i metodi istologici tradizionali. Adipo-Clear è un tessuto tecnica che permette di etichettatura robusto e imaging fluorescente volumetrica ad alta risoluzione del tessuto adiposo di compensazione. Qui, descriviamo i metodi per la preparazione del campione, pretrattamento, colorazione, compensazione e montaggio per l'imaging.

Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

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Research

JoVE Journal

Biology

26.9K Views.  The Rockefeller University. A causa del contenuto elevato del lipido, tessuto adiposo è stato impegnativo per visualizzare usando i metodi istologici tradizionali. Adipo-Clear è un tessuto tecnica che permette di etichettatura robusto e imaging fluorescente volumetrica ad alta risoluzione del tessuto adiposo di compensazione. Qui, descriviamo i metodi per la preparazione del campione, pretrattamento, colorazione, compensazione e montaggio per l'imaging.

Video: Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Ricerca

Biologia

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un sistema per la coltura cellule epiteliali del pigmento Iris a studio Rigenerazione Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging in idrogel tridimensionali

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-PRESTO: Biological Clearing tessuti e Metodi immunomarcatura per Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualizzazione della struttura del tessuto adiposo bianco 3D usando la macchiatura del intero-supporto

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

Tessuto Adiposo Umano Microframmentazione per la Fenotipizzazione Cellulare e la Caratterizzazione del Secretome

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

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Actina Co-sedimentazione di analisi, per l'Analisi del Binding Protein a F-Actina

Hi-C: un metodo per studiare l'architettura tridimensionale dei genomi.