Il nostro protocollo può essere utilizzato per visualizzare la complessità strutturale degli organoidi, consentendo la mappatura dell'identità, del solfato e della distribuzione in queste strutture 3D con la risoluzione a cella singola. Il nostro rapido protocollo di tre giorni è completamente ottimizzato per organoidi di varia origine e utilizza una semplice preparazione del campione, che include una fase di compensazione ottica non tossica e un metodo di montaggio a base di silicio. Sebbene il nostro protocollo sia semplice, alcuni di essi sono passaggi critici come la gestione organizzata o la preparazione delle diapositive, possono essere spiegati meglio attraverso la dimostrazione visiva che attraverso il testo.
Per recuperare organoidi da 100 a 500 micrometri di diametro coltivati in estratto di membrana basale in 24 piastre di pozzo, lavare ogni saldatura da raccogliere con PBS senza interrompere le matrici 3D e posizionare la piastra sul ghiaccio. Aggiungere un millilitro di soluzione di recupero ghiacciato ad ogni pozzo e posizionare la piastra su uno shaker orizzontale a quattro gradi Celsius per 30-60 minuti. Immergere una pipetta millilitro in una soluzione 1%BSA in soluzione PBS e pipettare su e giù due volte per rivestire ogni punta con BSA.
Successivamente, aggiungere cinque millilitri di 1%PBS BSA a un tubo da 15 millilitri per condizione e invertire il tubo da due a tre volte prima di scartare la soluzione, per rivestire l'interno del tubo. Per raccogliere gli organoidi, utilizzare una punta rivestita per sospendere delicatamente il contenuto del pozzo da cinque a 10 volte e estrarre tutti gli organoidi da ogni condizione in un singolo tubo rivestito da 15 millilitri. Risciacquare ogni bene con un millilitro di ghiaccio freddo 1%PBS BSA per assicurarsi che tutti gli organoidi siano stati raccolti e trasferire i lavaggi nei tubi appropriati.
Portare il volume finale in ogni tubo fino a 10 millilitri con PBS freddo e sedimentare gli organoidi mediante centrifugazione per ottenere una tavolozza stretta senza uno strato visibile di matrice 3D. Per fissare gli organoidi, utilizzare una punta di pipetta rivestita da un millilitro per sospendere attentamente ogni pellet in un millilitro di para formaldeide ghiacciata e fissare a quattro gradi Celsius per 45 minuti. Sospendere delicatamente gli organoidi a metà del tempo di fissazione.
Dopo 45 minuti, aggiungere 10 millilitri di PBS ghiacciato più 20 per ogni tubo e mescolare delicatamente per inversione, prima di posizionare i tubi a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Per bloccare gli organoidi, al termine dell'incubazione, far girare i campioni e sospendere di nuovo i pellet in almeno 200 microlitri di tampone di lavaggio organoide ghiacciato per pozzo da placcare. Quindi trasferire gli organoidi in singoli pozzi di una piastra di sospensione da 24 pozzali per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Per l'immunoetichettatura aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio organoide in un pozzo di riferimento vuoto e lasciare che gli organoidi si sistemino sul fondo della piastra. Una volta sistemati gli organoidi, inclinare la piastra con un angolo di 45 gradi per consentire la rimozione di tutti i microlitri tranne gli ultimi 200 del tampone di lavaggio. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio organoide contenente gli anticorpi primari di interesse e posizionare la piastra durante la notte a quattro gradi Celsius con lieve dondolo e scuotimento a 40 giri al minuto.
La mattina successiva, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio organoide ad ogni pozzo e lasciare che gli organoidi si sistemino sul fondo della piastra per tre minuti. Quando gli organoidi si sono sistemati, rimuovere tutti tranne gli ultimi 200 microlitri da ogni pozzo e lavare gli organoidi con tre lavaggi di due ore con un millilitro di tampone di lavaggio organoide fresco e lieve dondolo e agitazione per lavaggio. Dopo il terzo lavaggio, lasciare depositare gli organoidi nella parte inferiore della piastra per tre minuti prima di rimuovere tutti tranne gli ultimi 200 microlitri di tampone di lavaggio organoide da ogni pozzo.
Aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio organoide contenente gli anticorpi secondari appropriati per ogni pozzo per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius con lievi dondolo e scuotimento. La mattina seguente, lavare gli organoidi con tre lavaggi di due ore in un millilitro di tampone di lavaggio organoide fresco per lavaggio, come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire gli organoidi in un tubo da 1,5 millilitri per pozzo e raccogliere gli organoidi mediante centrifugazione.
Per la pulizia ottica degli organoidi, rimuovere il maggior buffer di lavaggio possibile da ciascun tubo, senza interrompere gli organoidi, e utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri modificata per aggiungere almeno 50 microlitri di FUnGI a ciascun pellet. Dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente gli organoidi possono essere conservati fino a una settimana a quattro gradi Celsius o per un massimo di sei mesi a meno 20 gradi Celsius. Per preparare diapositive per l'imaging organoide mediante microscopia confocale, riempire una siringa da 10 millilitri con un sigillante siliconico e attaccare una punta di pipetta da 200 microlitri modificata alla siringa.
Utilizzare la siringa per disegnare un rettangolo di uno per due centimetri nel mezzo di una diapositiva e utilizzare una seconda punta di pipetta da 200 microliter modificata per posizionare gli organoidi cancellati al centro del rettangolo. Per posizionare un coperchio scivolare sugli organoidi, posizionare prima il lato sinistro del coperchio, prima di abbassare lentamente il coperchio da sinistra a destra fino a quando non c'è aria intrappolata. Quindi applicare delicatamente la pressione su tutti i bordi del coperchio scivolare per attaccarlo saldamente al sigillante in silicone.
Per immaginare gli organoidi, posizionare lo scivolo sullo stadio di un microscopio a scansione laser confocale e selezionare un obiettivo multi immersione 25 X per l'imaging confocale. Impostare il microscopio sulle impostazioni di acquisizione appropriate, selezionando una bassa potenza laser per ridurre lo sbiancamento delle foto. Utilizzate la modalità Z stack per definire i limiti superiori dell'estremità inferiore e impostate la dimensione del passo Z su ottimale.
Quando si imagingno strutture organoidi di grandi dimensioni o più organoidi insieme, utilizzare la modalità di piastrellatura con una sovrapposizione del 10% e indicare l'area di interesse. Una volta impostati tutti i parametri, ottenere una rappresentazione di rendering 3D dell'imaging nel software di imaging e ottimizzare le proprietà di luminosità, contrasto e rendering 3D. Quindi esportare istantanee RGB dei risultati come file TIFF.
La forza dell'imaging 3D rispetto all'imaging 2D è illustrata da queste immagini di organoidi della ghiandola mammaria del topo che sono stati generati come dimostrato. Lo strato centrale di questi organoidi rappresentativi è costituito da cellule luminali positive K8/K18 di forma colonnare, e lo strato esterno contiene cellule di basilico positive K5 allungate, che ricapitolano la morfologia della ghiandola mammaria in vivo. Questa organizzazione polarizzata è difficile da apprezzare da una sezione ottica 2D dello stesso organoide.
Un altro esempio di struttura complessa che è impossibile da interpretare senza informazioni 3D è la rete di canaliculi positivi MRP2 che facilitano la raccolta del fluido biliare degli organoidi epatici umani. Inoltre, la qualità e la risoluzione ottenute consentono la segmentazione semi-automatizzata e l'analisi delle immagini. Pertanto, il numero totale di cellule e la presenza di marcatori possono essere quantificati in specifici sottotipi cellulari in interi organoidi.
Segmentando i nuclei di un intero organoide contenente 140 cellule, è possibile identificare tre cellule che mostrano un'alta positività per il marcatore del ciclo cellulare Ki67. L'agente di compensazione ottica, FUnGI, supera le prestazioni non chiare e la compensazione fruttosio-glicerolo nella qualità del segnale fluorescente in profondità all'interno di un organoide. Con gli organoidi cancellati FUnGI che dimostrano un'intensità di fluorescenza complessiva migliorata rispetto agli organoidi non chiari.
Si noti che qualsiasi BME avanzi nel campione può comportare una ridotta penetrazione degli anticorpi e può portare a un elevato segnale di fondo. Inoltre, gli organoidi cistica non dovrebbero essere cancellati otticamente se collassano. Con lievi adattamenti al protocollo, i campioni possono essere utilizzati con microscopia confocale, multifocale e foglio luminoso ad alta risoluzione.
