Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei cloroplasti, ad esempio la composizione dei macchinari per l'importazione di proteine cloroplaste. È essenziale per l'invernimento e la fotosintesi e quindi per la produzione alimentare sul pianeta. La macchina molecolare è costituita da due complessi separati nel membro esterno ed interno del cloroplasto chiamato TOC e TIC, ma la composizione non è completamente nota.
Il principale vantaggio di questa tecnica è che la purificazione del complesso Arabidopsis TOC/TIC può essere realizzata in un unico metodo di purificazione in un unico passaggio, la purificazione TAP-TOC. Si tratta di un metodo specifico ed efficiente. Generalmente, i ricercatori nuovi a questo metodo possono avere difficoltà perché non hanno familiarità con l'isolamento delle frazioni di membrana cloroplasta, detergente, solubilizzazione o purificazione dell'affinità.
Dopo aver preparato le piante di Arabidopsis, macinare 10 grammi di piantine vecchie di tre settimane in azoto liquido, usando una malta fredda e pestello con sabbia. Aggiungere 20 millilitri di tampone di macinazione a freddo ai tessuti macinati. Mescolare bene e lasciare scongelare la miscela sul ghiaccio.
Quindi, immergere due strati di materiale di filtrazione rapida con tampone di rettifica. Filtrare l'omogeneizzato attraverso i due strati di materiale filtrante in un tubo di centrifuga conico da 50 millilitri. Centrifugare il filtrato a 1.500 volte g in quattro gradi Celsius per 10 minuti e trasferire il supernatante in un tubo di centrifuga conico fresco pre-refrigerato da 50 millilitri.
Ripetere la centrifugazione ancora una volta alle stesse condizioni. Trasferire il supernatante in un tubo ultracentrifugo freddo da 38,50 millilitri e completarlo fino a 35 millilitri con tampone di macinazione a freddo. Utilizzare un ultracentrifugo per centrifugare il campione a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius per un'ora.
Utilizzando un omogeneizzatore in teflon in vetro, rimescolare il pellet verde nel tampone di rettifica. Centrifugare a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius per un'ora e scartare il supernatante. Utilizzare l'omogeneizzatore teflon in vetro per rimescolare il pellet verde in 18,75 millilitri di un tampone di rettifica x.
Quindi aggiungere altri 9.375 millilitri di un buffer di rettifica x. Aggiungere 9,375 millilitri di quattro x soluzione di solubilizzazione per portare il volume finale a 37,5 millilitri e incubare su uno shaker rotante a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, utilizzare un ultracentrifugo per centrifugare il campione a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius per un'ora.
Trasferire il supernatante contenente le membrane solubilizzate in un tubo di centrifuga conico fresco da 50 millilitri. Dopo aver preparato la resina di agarosio IGG, trasferire la resina di agarosio IGG precedentemente lavata nel tubo conico da 50 millilitri contenente i 37,5 millilitri delle membrane solubilizzate. Incubare durante la notte su uno shaker rotante a quattro gradi Celsius.
Il giorno dopo, sedimentare la resina di agarosio IGG a 100 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante. Era la resina di agarosio IGG in 37,5 millilitri di tampone A e incubare su uno shaker rotante a temperatura ambiente per 10 minuti.
Continuare a sedimentare e lavare la resina come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire la resina di agarosio IGG in una colonna di spin da 500 microliter con un filtro da 35 micron. Lavare le perline due volte con 300 microlitri di tampone di eluizione TEV per l'equilibrazione.
Successivamente, aggiungere 300 microlitri di tampone di eluizione TEV contenenti 10 microlitri di proteasi TEV. Incubare la colonna di spin con perline in un Thermomixer a 16 gradi Celsius e 350 giri/min per due ore. Quindi, aprire la colonna di rotazione e posizionarla in un nuovo tubo pulito da 1,5 millilitri.
Ruotare questo tubo a 100 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti per raccogliere l'eluato. In questo studio viene purificato un complesso proteico di involucro di cloroplasto taggato TAP da piante transgeniche di A.thaliana. L'analisi immunoblot conferma che l'isolamento TAP-TOC159 interagisce con TOC75 e TOC33 del complesso TOC.
Anche la membrana esterna cloroplasta chinasi, KOC1, nota per il fosforilato TOC159, è co-isolata. La presenza di TIC110 rivela che il complesso isolato TAP-TOC159 contiene anche i componenti del complesso TIC. L'anticorpo FBN1A non ha riconosciuto il complesso TAP-TOC159, indicando l'assenza di contaminazioni.
Nel controllo negativo, la proteina NTAP immunoprecipitata non si è co-isolata con nessuna delle proteine TOC, TIC e conferma la specificità della purificazione TAP-TOC159. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'importazione di proteine cloroplaste, può potenzialmente essere applicato a qualsiasi altro complesso nel sistema di bottiglie arabidopsis thaliana. Seguendo questa procedura, possono essere applicati altri metodi come l'assorbimento occidentale o la spettrometria di massa per dimostrare la presenza di componenti noti o per identificare nuovi componenti dei complessi TOC e TIC.
Questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo dell'importazione di proteine cloroplaste per esplorare la funzione di nuovi componenti dei complessi TOC e TIC.
