Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave riguardanti i meccanismi e le energetiche del trasporto proteico attraverso le membrane cloroplaste, così come la posizione delle proteine all'interno dei plastidi. Il principale vantaggio di questa tecnica per il targeting delle proteine tilacoidi è che consente il controllo completo dell'ambiente del tilakoide durante il trasporto, tra cui temperatura, pH, condizioni ioniche e concentrazioni precursori. Inizia immergendo circa 55 grammi di piselli in 400 millilitri di acqua distillata per tre ore.

Seminare i piselli imbevuti in un vassoio di plastica nel terreno, coperto da un sottile strato di vermiculite, e crescere per nove o 15 giorni come descritto nel protocollo di testo. Il giorno dell'isolamento del cloroplasto, preparare un gradiente di densità continua centrifugando una miscela di 15 millilitri di Percoll e 15 millilitri di tampone da 2xGB in un tubo di centrifuga ad alta velocità in policarbonato da 15 millilitri a 30,900 g in un rotore ad angolo fisso per 30 minuti a quattro gradi Celsius con il freno spento. Quindi raccogliere circa 25 grammi di germogli di piselli vecchi da nove a 15 giorni.

Aggiungili a 95 millilitri di tampone freddo da 1xGB in un frullatore refrigerato, con lame affilate. E omogeneizzare. Filtrare questa miscela attraverso un minimo di due strati di stoffa di formaggio, posta in un imbuto su un becher refrigerato.

Centrifugare il filtrato utilizzando un tubo di centrifuga in policarbonato da 15 millilitri in un rotore a benna oscillante a 3.000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e utilizzare un pennello per rimescolare delicatamente il pellet in un millilitro di 1xGB. Successivamente utilizzare una pipetta di postura in vetro per sovrapporre con cura le sospensioni dello schermo sopra la sfumatura Percoll.

Centrifugarlo in un rotore a benna oscillante a 8.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius con il freno spento. Utilizzando una pipetta postura trasferire nuovamente accuratamente la fascia verde inferiore contenente cloroplasti intatti in un tubo di policarbonato fresco da 50 millilitri e aggiungere 30 millilitri di tampone 1xIB. Centrifugare il tubo in un rotore a benna oscillante a 1.800 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver scartato il supernatante, rimescolare delicatamente il pellet in un millilitro di 1xIB con un pennello. Lavare in 30 millilitri di 1xIB e centrifugare di nuovo nelle stesse condizioni. Resuspend il pellet dopo la centrifugazione finale in un millilitro di 1xIB.

Per determinare la concentrazione di clorofilla, mescolare 10 microlitri di cloroplasti completamente rimorsi con cinque millilitri di acetone all'80%. Filtrare attraverso una carta filtrante spessa 180 micrometri con dimensioni dei pori di 11 micrometri e quindi determinare la concentrazione di clorofilla mediante spettrofotometro. Diluire la miscela di cloroplasto a un milligrammo per millilitro usando 1xIB freddo.

Per iniziare a isolare i thylakoidi quando l'estratto stromale non è necessario, come il trasporto cpTat, centrifugare cloroplasti intatti in tubi da 1,5 millilitri in un rotore a secchio oscillante a 1.000 g a quattro gradi Celsius per sei minuti. Successivamente, scartare il supernatante e rimescolare il pellet nel tampone di lisi ipotonica per ottenere un milligrammo per millilitro con una micropipetta. Incubare sul ghiaccio al buio con miscelazione occasionale per 10 minuti.

Per recuperare i tireokoidi, centrifugare in un rotore a secchio oscillante a 3.200 g a quattro gradi Celsius per otto minuti. Lavare i tireokoidi due volte rimescolando il pellet con uno o due millilitri di tampone di lisi e quindi centrifugando nelle stesse condizioni. Dopo la centrifugazione finale, resospendare il pellet, in un millilitro di tampone 1xIB e determinare la concentrazione di clorofilla in thylokoidi isolati utilizzando uno spettrofotometro come precedentemente dimostrato.

Per percorsi che richiedono il recupero di estratti stromali come CPSec1 e CPSRP eliquate 600 microlitri di cloroplasti isolati in un rotore a secchio oscillante e centrifuga a 1.000 g per sei minuti a quattro gradi Celsius. Per la lisi cloroplasta, sospendiamo il pellet con 600 microlitri di tampone di lisi ipotonica. Incubare sul ghiaccio al buio per 10 minuti con miscelazione occasionale.

Quindi centrifugare i tubi in un rotore a benna oscillante a 3.200 g per otto minuti a quattro gradi Celsius. Per salvare lo stroma, trasferire il supernatante dal verde chiaro al giallo su un nuovo tubo di micro centrifuga e aggiungere un volume uguale di tampone stromale grezzo 2x. Per lavare i tireokoidi, aggiungere due volumi di tampone dilisi e centrifuga a 3.200 g per otto minuti a quattro gradi Celsius.

Resuspend il pellet in 1xIB per ottenere una concentrazione di clorofilla di un milligrammo per millilitro e messo da parte sul ghiaccio per un uso successivo nei saggi di trasporto. Rimuovere le membrane residue dallo stroma grezzo centrifugando lo stroma grezzo diluito in un rotore ad angolo fisso a 42.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi raccogliere il 95% del volume da ogni tubo assicurandosi di non disturbare il piccolo pellet giallo verde, notando il volume prelevato da ogni tubo.

Per preparare l'estratto stromale concentrato, mettere in comune i supernatanti raccolti. Quindi utilizzare un concentratore cut-off di peso molecolare da quattro millilitri da 30 kilodalton per concentrare l'estratto di cinque volte. Per saggiare il trasporto cpTat in un tubo da 1,5 millilitri su ghiaccio mescolare i tireokoidi isolati ad una concentrazione finale di clorofilla di 0,33 milligrammi per millilitro, cinque ATP millimolare preparato in 1xIB e otto DTT millimolare preparati in 1xIB.

Per avviare il trasporto, introdurre la proteina del substrato nel mix di trasporto. Condurre la reazione illuminando la sospensione con da 80 a 100 microeinstein per metro quadrato al secondo di radiazione fotosinteticamente attiva per 10 minuti a temperatura ambiente. Per interrompere la reazione di trasporto, diluire la sospensione di otto volte con ghiaccio freddo 1xIB.

Centrifuga a 3.200 g in micro centrifuga per cinque minuti a quattro gradi Celsius per recuperare i tireokoidi. Dopo aver scartato il supernatante, resuspend il pellet in 120 microlitri di ghiaccio freddo 1xIB. Per saggiare le vie CPSec1 o PSRP mescolare quanto segue in un tubo da 1,5 millilitri su ghiaccio.

Thylakoids ad una concentrazione finale di clorofilla di 0,33 milligrammi per millilitro, 0,83 milligrammi per millilitro equivalenti di clorofilla di estratto stromale e cinque MILLIMOLARI ATP preparati in 1xIB. Portare la reazione al volume desiderato con ghiaccio freddo 1xIB e incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Per avviare il trasporto introdurre il 10% volume in volume di proteine del substrato in questa miscela di trasporto.

Illuminare con da 80 a 100 microeinsteine per metro quadrato al secondo di radiazione fotosinteticamente attiva per 10 minuti a temperatura ambiente. Per fermare la reazione, diluire la sospensione di otto volte con ghiaccio freddo 1xIB. Centrifuga a 3.200g in micro centrifuga per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver scartato il supernatante, resuspend il pellet in 120 microlitri di ghiaccio freddo 1xIB. Per rimuovere il substrato residuo che non è stato trasportato, digerire proteine esterne aggiungendo sei microlitri di due milligrammi per millilitro termolisina e 10 millimolare cloruro di calcio in 1xIB. Incubare questa reazione di proteasi sul ghiaccio per 40 minuti.

Temprare la proteasi raddoppiando il volume con EDTA da 25 millimolari in 1xIB. Centrifuga a 3.200 g in micro centrifuga per cinque minuti a quattro gradi Celsius per recuperare i tireokoidi. Dopo aver rimosso il supernatante, resuspend recuperò i tireokoidi in 120 microlitri di cinque EDTA milimolari in 1xIB, e si trasferisce in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.

Dopo aver centrifugato di nuovo a 3.200 g in una micro centrifuga per cinque minuti a quattro gradi Celsius, scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un volume appropriato di tampone di campione di laemmli, integrato con EDTA da 10 millimolare. Mettere i campioni in un bagno d'acqua bollente per 10 minuti. Procedere all'analisi degli esempi in base alla pagina SDS.

Il trasporto della proteina iOE17 attraverso la via cpTat ha comportato uno spostamento delle dimensioni da due a tre kilodalton tra il substrato introdotto e la forma lavorata matura. Ciò è dovuto alla scissione del peptide del segnale terminale n che indica un trasporto cpTat riuscito. Il trattamento con termolisina lascia solo la banda matura trasportata con successo e quindi resistente al proteo.

Il trasporto del precursore OE33 attraverso la via CPSec1, ha comportato uno spostamento delle dimensioni nel substrato maturo e la protezione proteus del substrato trasportato. L'inserimento del precursore LHCP nella membrana tireokoide attraverso la via cpSRP, valutato attraverso la digestione della termolisina, ha portato a uno spostamento delle dimensioni da 1,5 a due kilodalton. Ciò ha indicato un inserimento riuscito della membrana, poiché la membrana protegge lo zio del prodotto di degradazione LHCP maturo dalla proteolisi completa.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare i tireokoidi e la trasportivity del test attraverso le vie cpTat, cpSec 1 e cpSRP dipendenti dall'energia. Una volta padroneggiata questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se eseguita correttamente. Sebbene non sia illustrato in questo video, generalmente teniamo spente le luci aeree in laboratorio quando si isolano e si lavora con cloroplasti e thylakoidi fotosinteticamente attivi.

Durante il tentativo di questa procedura è importante mantenere cloroplasti e tilakoidi isolati a quattro gradi Celsius. Ricordati di rimospendare delicatamente i cloroplasti all'inizio. Evitare di disturbare la sfumatura Procoll dopo il primo passaggio di centrifugazione.

Inoltre, la percentuale di campione di ingresso può essere preparata in parallelo con le reazioni di trasporto ed eseguita sullo stesso gel per stimare il trasporto del substrato. Non dimenticare che lavorare con substrati radioattivi richiede una manipolazione coscienziosa e dPI adeguati. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo del targeting proteico per esplorare l'energia, la cinetica e i meccanismi unici che regolano il trasporto proteico attraverso le membrane tilacoidi.