Abbiamo sviluppato un metodo semplice per la misurazione della lipofilia di composti frenetici utilizzando nmr al fluoro che è abbastanza acre da riprodursi misuriamo piccole differenze nella lipofilia. Questo metodo può essere utilizzato per studiare sistematicamente l'impatto della formazione di composti organici sui cambiamenti risolti della lipofilia, che è di interesse per la chimica medicinale generale. I vantaggi di questo metodo includono che i composti non devono essere reattivi e non devono essere completamente puri.
Non è necessario misurare la massa o i volumi esatti e non è necessario stabilire curve di calibrazione. Deve essere scelto un composto di riferimento appropriato e deve essere evitata la contaminazione incrociata dell'aliquota durante la fase di campionamento. In questo video dimostreremo adeguate abilità pratiche per il campionamento, la sigillatura dei tubi NMR e l'uso corretto del software NMR per l'elaborazione dei dati.
Aggiungere 6,0 milligrammi di composto X e 3,0 milligrammi del composto di riferimento in un pallone a forma di pera da 10 millilitri. Sciogliere i composti in circa due millilitri di n-ottanolo di grado HPLC e aggiungere due millilitri di acqua di grado HPLC. Posizionare i contenitori all'interno di un recipiente a temperatura controllata sopra una piastra di agitazione e collegarsi a un refrigeratore ricircolante.
Mescolare la miscela bifasica a 25 gradi Celsius per due ore, con velocità di agitazione impostata a 600 giri/min. Equilibrare la miscela a 25 gradi Celsius durante la notte per consentire la completa separazione di fase. Fissare il pallone a un supporto per la tordo con un morsetto.
Prendere un'aliquota di circa 0,70-0,85 millilitri da strati di acqua e n-ottanolo utilizzando siringhe di plastica monouso millilitro con aghi lunghi. Per prendere l'aliquota dell'acqua, disegnare circa 0,02 millilitri d'aria nella siringa prima di mettere l'ago nella miscela. Mentre si sposta l'ago attraverso lo strato superiore di n-ottanolo nello strato d'acqua, spingere delicatamente fuori l'aria per evitare che la soluzione n-ottanolo entri nell'ago.
Rimuovere l'ago lungo dalla miscela. Scartare una piccola quantità di campione d'acqua, lasciando circa 0,6 millilitri di campione lasciato nella siringa. Pulire con cura l'ago con tessuto secco e iniettare circa 0,5 millilitri del campione d'acqua in un tubo NMR pulito.
Chiudere rapidamente il tubo NMR con un tappo. Per il campione n-ottanolo, rimuovere l'ago lungo dallo strato n-ottanolo. Scartare una piccola quantità di campione di n-ottanolo, lasciando circa 0,6 millilitri di campione lasciato nella siringa.
Dopo aver accuratamente asciugato l'ago con tessuto secco, iniettare circa 0,5 millilitri del campione di n-ottanolo in un tubo NMR pulito. Chiudere rapidamente il tubo NMR con un tappo. Ispezionare visivamente campioni di n-ottanolo e acqua per eventuali contaminazioni dall'altra fase.
Ad ogni tubo NMR, aggiungere 0,1 millilitri di un solvente NMR deuterato che è miscible sia con n-ottanolo che con acqua, per consentire il blocco del segnale durante l'acquisizione di NMR. Per i composti con bassi punti di ebollizione, sigillare i tubi NMR utilizzando una fiamma ossidrica e, dopo il raffreddamento, invertire il tubo per verificare la presenza di eventuali perdite. Invertire con cura i tubi NMR sigillati o non sigillati 20 volte per ottenere una soluzione omogenea per gli esperimenti NMR F19.
Esegui esperimenti nmr al fluoro disaccoppiato protonico per identificare gli spostamenti chimici del composto X e del composto di riferimento sia nei campioni di N-Ottanolo che di NMR dell'acqua. Utilizzare le impostazioni standard dei parametri NMR elencate nel protocollo di testo. Misurare il tempo di rilassamento spin-reticolo, o T1, per i nuclei diagnostici del fluoro usando una sequenza di recupero dell'inversione.
Valutare il livello di tempo di ritardo dell'impulso appropriato dai valori T1 ottenuti per un'accurata integrazione quantitativa nmr. Eseguire uno spettro F19 H1 rapido per impostare i parametri iniziali. Misurare la larghezza dell'impulso di 90 gradi, quindi impostare il parametro per l'esperimento di misurazione T1 ed eseguire l'esperimento di misurazione T1 utilizzando una sequenza di recupero dell'inversione.
Eseguire nuovamente esperimenti NMR al fluoro disaccoppiato da protoni con impostazioni dei parametri regolate. Impostare D1 e centrare il punto di offset della frequenza tra i due segnali diagnostici del fluoro in modo che entrambi i nuclei possano essere ugualmente eccitati. Inoltre, impostate la larghezza spettrale su 300 PPM e impostate il numero di transitori su 64.
Regolare questi valori se è necessario un rapporto segnale-rumore più elevato. Elaborare i dati ottenuti utilizzando ACD NMR Processor Academic Edition o altri software di elaborazione NMR personalizzati. Aprire il file di dati NMR.
Quindi, aprire la cartella pdata, seguita dalla cartella 1. Eliminare il file 1r. Tornare al file di dati NMR e trascinare il file FID nella finestra Processore NMR ACD.
Fare clic sul pulsante funzione finestra, selezionare esponenziale, impostare il valore di ampliamento della linea come due e fare clic sul pulsante ok. Ora, fai clic sul pulsante di riempimento zero, aumenta il numero di punti a quattro volte il conteggio dei punti originali facendo clic su un piccolo pulsante accanto al numero e fai clic sul pulsante ok. Selezionare il pulsante di trasformazione fourier.
Fare quindi clic sul pulsante fase e quindi sul pulsante di fase del mouse. Fare clic e tenere premuto il pulsante sinistro del mouse e procedere allo spostamento del mouse in avanti o all'indietro fino a quando il picco maggiore dello spettro non viene gradualmente graduale. Ora, fai clic e tieni premuto il pulsante destro del mouse e sposta il mouse in avanti o indietro fino a quando gli altri picchi dello spettro non vengono correttamente phased.
Quindi, deselezionare il pulsante di fasatura del mouse e ingrandire l'area spettrale con i picchi di fluoro. Fare clic su Messa a punto, eseguire la correzione di fase, se necessario, come descritto in precedenza, quindi fare clic sul pulsante tick. Fare clic sul pulsante baseline e quindi sul pulsante opzioni.
Selezionare la media dello spettro per i modelli automatici, regolare il numero di punti per la casella a mezza larghezza, se necessario. Fare clic su OK, automatico e quindi sul pulsante tick. Quindi, fare clic sull'integrazione, integrare i picchi diagnostici del fluoro e fare clic sul pulsante tick.
Infine, ottenere i rapporti di integrazione da campioni di NMR n-ottanolo e acqua e utilizzarli nell'equazione di calcolo logP per ottenere il valore logP di Compound X.Using 2, 2, 2-Trifluoroetanolo come composto di riferimento, è stato ottenuto un valore logP di 0,75 per due fluoroetanolo, ed è stato trovato un valore logP di 1,20 positivo per 3, 3, 3, 2, 2-pentafluoropropanolo. Successivamente, la lipofilia di due fluoroetanolo è stata nuovamente determinata, ma con 3, 3, 3, 2, 2-pentafluoropropanolo come riferimento. Il valore logP misurato era 0,76, che aveva solo una differenza di 0,01 unità logP rispetto al valore misurato utilizzando 2-2-2-trifluoroetanolo come riferimento.
Allo stesso modo, per cis-2, 3-difluro-1, 4-butano-diolo, la differenza nei valori logP misurati usando due fluoroetanolo e il suo transisomero sono molto piccoli. Ciò dimostra una buona riproducibilità e che la selezione del composto di riferimento non ha alcun impatto sulla misurazione logP. Altri esempi selezionati sono mostrati qui.
Tutti questi composti allofatici attivi non UV, dai carboidrati fluorurati, alle fluoroidridi, possono essere facilmente misurati con questo metodo. Altri metodi basati su proto NMR possono essere utilizzati se il composto non contiene fluoro e se il composto contiene cromofor UV, la misurazione logP può essere eseguita utilizzando la quantificazione UV. È stata misurata la lipofilia di una vasta gamma di fluoroidridi attivi non UV e carboidrati deossifluoniati.
La libreria di dati ottenuta è stata utilizzata per stabilire tendenze e regole per l'impatto della fluorinazione alifatica sulla lipofilia. L'ottanolo e l'acqua rappresentano rischi minimi per la sicurezza. Naturalmente, i pericoli misurati e il composto di riferimento dovrebbero sempre essere presi in considerazione.
