Questo lavoro è sostenuto dal progetto KAIST finanziato K-Valley RED &amp; B per il 2014 e il programma di ricerca di scienza di base attraverso la Fondazione di Ricerca Nazionale di Corea (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).

Attenzione: Far riferimento alla scheda di dati di sicurezza (MSDS) prima dell&#39;uso di acetone e cloroformio cancerogene. 1. Preparazione di Phospholipid monostrato in un acqua-Air Interface piatto <ol><li> Formazione di un monostrato fosfolipide <ol><li> Preparazione di una soluzione di fosfolipidi <ol><li> Pulire un flaconcino da 4 ml con una politetrafluoroetilene rivestita berretto con acetone, etanolo e acqua deionizzata per almeno tre volte, e soffiare accuratamente azoto gassoso nel flaconcino per sbarazzarsi di acqua. </li><li> Sciogliere 1 mg di fosfolipidi (ad esempio, dioleoilfosfatidilcolina, DOPC) a 1 ml di cloroformio nel flacone di ottenere 1 mg / ml di concentrazione. Eseguire questa procedura in una cappa aspirante per la sicurezza. Utilizzare concentrazioni più basse o più alte di soluzione di fosfolipidi, se necessario. </li><li> Aggiungere dye etichettato fosfolipidi (ad esempio, Rodamina dipalmitoylphosphatidylethanolamine, Rodamina PDPE) con meno di 1 mole% della solu fosfolipidezione, per visualizzare il monostrato fosfolipide con un microscopio a fluorescenza. Eseguire questa procedura in una cappa aspirante per la sicurezza. </li><li> Avvolgere la fiala con un nastro politetrafluoroetilene per evitare l&#39;evaporazione del solvente, e memorizzare il campione in un congelatore a -20 ° C. </li></ol></li><li> Deposizione di fosfolipidi sull&#39;interfaccia aria-acqua <ol><li> Pulire un piatto Petri (55 mm di diametro e 12 mm di altezza) con etanolo, e acqua deionizzata per almeno tre volte. </li><li> Riempire la piastra di Petri con 10 ml di acqua deionizzata per creare un&#39;interfaccia aria-acqua. </li><li> Distribuire pochi microlitri della soluzione di fosfolipidi con un micro-siringa sulla un&#39;interfaccia pulita per ottenere una pressione superficie desiderata e attendere almeno 30 minuti per evaporare il solvente completamente, prima di fare l&#39;esperimento. Nota: Una depressione Langmuir può essere usato al posto di una capsula di Petri, se è necessario un controllo preciso della pressione superficiale. </li></ol></li></ol></li><li> Sumisurazione della pressione rfaccia <ol><li> Misurare la pressione superficiale del monostrato fosfolipide con un piatto tensiometro Wilhelmy. Attendere almeno 30 minuti per ottenere la carta da filtro inumidita sufficiente se la carta da filtro viene utilizzato come una piastra di Wilhelmy. Il protocollo dettagliato è disponibile in Kuhn et al. 20. </li><li> Regolare la quantità depositata dello fosfolipide per controllare con precisione la pressione superficiale. Aggiungere 4 ml di soluzione DOPC (1 mg / ml) sulla 30.25 cm 2 -Area dell&#39;interfaccia se ~ 5 mN / m della pressione superficiale è richiesto. Nota: Se la carta da filtro non è completamente bagnata, pressione superficiale cambia drasticamente durante i primi 30 minuti dell&#39;esperimento a causa della variazione di peso della carta da filtro. </li></ol></li><li> Minimizzazione del flusso convettivo del monostrato <ol><li> Utilizzare un apparecchio a forma di cono che contiene un serbatoio 3 mm con due canali sottili, collegato ad una grande sezione del piatto Petri, per sopprimere il flusso convettivo diil monostrato, che può turbare la morfologia delle immagini e la misurazione della pressione superficiale. </li><li> Assicurarsi di abbinare il livello dell&#39;acqua tra l&#39;interno e l&#39;esterno dell&#39;apparecchiatura cono-figura per assicurare che i fosfolipidi muovono liberamente sull&#39;intera regione prima di depositare fosfolipidi sull&#39;interfaccia aria-acqua. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di fosfolipidi monostrato alla superficie curva di una gocciolina <ol><li> Processo si assottiglia di un capillare di vetro con micropipetta estrattore <ol><li> Collocare un capillare di vetro (od 1 mm, 0,78 mm id, lunghezza 100 mm) su un supporto capillare di un estrattore micropipetta. </li><li> Progettare un programma per tirare i capillari con valori dei parametri appropriati (Calore: Rampa, Pull: 60, Vel: 70, Delay: 70 e Pressione 200) e tirare i capillari con il programma progettato secondo il protocollo del produttore. Nota: end Un capillare con pochi micrometri di diametro è necessario formare una gocciolina 100 micron-by applying una pressione con ~ 10 kPa. Se l&#39;estremità di punta del capillare è troppo piccola, la pressione molto più elevata,&gt; 600 kPa, è necessario per ottenere la goccia, mentre è difficile controllare la dimensione delle gocce con una troppo grande estremità di punta capillare. </li></ol></li><li> Assorbimento di fosfolipidi sulla superficie droplet Nota: Per formare un monostrato fosfolipide all&#39;interfaccia curvo di una goccia, una soluzione di fosfolipidi senza colorante fosfolipidi etichettato viene utilizzato per ottenere un contrasto intensità, contro il monostrato piatta, preparata mediante procedura 1. Inoltre, entrambe le procedure 2.2.1 e 2.2 .2 sono consentiti qui. Se è necessario un controllo preciso della pressione superficiale sulla superficie gocciolina, procedura 2.2.2 è altamente raccomandato. Tuttavia, se non, procedimento 2.2.1, che è un modo molto più facile che procedura 2.2.2, è utile. <ol><li> Processo di fosfolipidi Rivestimento in una estremità di punta <ol><li> Pulire un vetrino con acetone, etanolo e acqua deionizzata per almeno tre volte. </li><li> Place il capillare conico su un vetrino pulito, e inclinare il capillare per agevolare toccare il vetrino con una estremità di punta. </li><li> Cadere qualche gocce di soluzione di fosfolipidi (1 mg / ml) sull&#39;estremità punta di un capillare che viene fatto aderire al vetrino usando una siringa di vetro, e attendere almeno 30 minuti per evaporare il solvente completamente. Nota: Si consiglia vivamente di aderire alla fine punta del capillare al vetrino durante la procedura 2.2.1.3 perché il perimetro della fine punta è troppo piccolo per contenere la goccia dei fosfolipidi alla fine punta solo con la forza capillare. </li></ol></li><li> Preparazione di una soluzione vescicole <ol><li> Pulire una fiala, e rimuovere l&#39;acqua dal flaconcino, come introdotto nel procedimento 1.1.1.1. </li><li> Essiccare un volume di soluzione di 2 ml di fosfolipidi (1 mg / ml) applicando azoto delicatamente ed essiccare la fiala per 1 ora a RT per eliminare qualsiasi solvente rimanente. Eseguire questa procedura in una cappa aspirante per la sicurezza. </li><li> Aggiungere 2ml di acqua deionizzata nel flaconcino contenente lipidi essiccato, e incubare la vial in stufa a 60 ° C per 1 ora. </li><li> Agitare il flacone diverse volte, e sonicare (HF-frequenza: fino a 40 kHz, Potenza: 370 W) per 30 minuti per ottenere vescicole. </li><li> Eseguire processi di estrusione e gelo-disgelo per ottenere vescicole unilamellari monodisperse. Il protocollo dettagliato per vescicole preparazione è descritta in Mayer et al. 21. Nota: la pressione superficiale dell&#39;interfaccia goccia viene controllata in modo preciso regolando il tempo di attesa dopo la formazione della goccia che contiene vescicole unilamellari monodisperse. Utilizzando un metodo pendente goccia 22, è necessario misurare la variazione di pressione superficiale secondo tempo, prima di fare l&#39;esperimento. </li></ol></li></ol></li><li> Formazione di una gocciolina che contiene un monostrato fosfolipide alla superficie curva <ol><li> Compila il capillare conico con 10 ml di acqua deionizzata da immissioe 2.2.1. In alternativa, utilizzare 10 ml di soluzione di vescicole da procedura 2.2.2. </li><li> Collegare il capillare di un micro-iniettore automatizzato per fornire la pressione per formare la goccia. </li><li> Montare il capillare che è collegato ad un micro-iniettore ad un micromanipolatore per controllare la posizione del capillare con precisione. </li><li> Preparare un microscopio in campo chiaro (Microscopio 1, obiettivo obiettivo: 10X NA 0,3) per l&#39;imaging la vista laterale del capillare con una telecamera CCD. Microscopio 1 permette quindi di osservare la posizione precisa della goccia lungo l&#39;asse z e stimare la dimensione della goccia. </li><li> Spostare la relativa estremità ad una posizione dove la vista laterale della estremità di punta è ben visualizzato mediante microscopio 1 utilizzando un micromanipolatore, e applicare una pressione variabile (~ 100 hPa) con la relativa estremità del capillare, fino dimensioni adeguate (~ 100 micron di diametro) della gocciolina è formato. Nota: Si raccomanda automatizzata micro-iniettore e micromanipolatore essere usod, se è necessario un controllo preciso della dimensione delle gocce e la posizione della goccia. È anche possibile utilizzare quelli manuali. </li></ol></li></ol> 3. Imaging di fluorescenza di recupero dopo la fusione Droplet Nota: I principi fondamentali di questo protocollo sono identiche a quelle della tecnica FRAP, tranne per il processo di coalescenza goccia. Le modalità di protocollo e relative teorie FRAP sono disponibili in A. Lopez et al. 15 e D. Axelrod et al. 16. <ol><li> Il monitoraggio e il controllo della posizione della goccia <ol><li> Preparare un microscopio invertito set (Microscopio 2, obiettivo obiettivo: 10X NA 0.3, lente del tubo: lunghezza focale 17 cm) che permette sia un microscopio a fluorescenza con un set di filtri appropriato per Rodamina-DPPEs (eccitazione a 560 nm, emissione a 583 nm) e un microscopio in campo chiaro. Usare una camera CCD qui per visualizzare le migliori viste della goccia con un microscopio a fluorescenza mode e una modalità microscopio a campo chiaro. </li><li> Spostare la goccia rivestita con un fosfolipide a un&#39;interfaccia aria-acqua piatta lungo l&#39;asse z, ma non unire la gocciolina ancora, utilizzando il micromanipolatore. Utilizzare Microscopio 1 per visualizzare la vista laterale della goccia. </li><li> Individuare la goccia al centro della vista dall&#39;alto del monostrato piatta, utilizzando micromanipolatore. Utilizzare la modalità microscopio a campo chiaro di microscopio 2 di visualizzare vista dall&#39;alto monostrato piatta. </li></ol></li><li> Unire la goccia sull&#39;interfaccia aria-acqua piatta <ol><li> Spostare la goccia ulteriormente verso l&#39;interfaccia piatta fino a quando la goccia si fonde sull&#39;interfaccia, utilizzando il micromanipolatore. Se il processo di fusione è fatto con successo, una regione scura di forma circolare che è circondato da uno sfondo bianco, si osserva utilizzando la modalità di microscopio a fluorescenza 2. </li><li> Registrare la serie di immagini fluorescenti in base all&#39;anticipo dopo la fusione la goccia, utilizzando la modalità di fluorescenza di Microspiviale 2. Utilizzare un frame rate più veloce che la scala temporale diffusione del monostrato qui. In DOPC monostrato, ci vogliono pochi minuti per diffondere nella zona 200 micron-scuro completamente. </li></ol></li></ol> 4. Determinazione del coefficiente di diffusione da Image Analysis Nota: Per determinare il coefficiente di diffusione di una serie di immagini, programma personalizzato per l&#39;analisi delle immagini è costruito come descritto di seguito. Un codice sorgente dettagliata di questo programma è disponibile nel sito web Giove. <ol><li> Rilevamento di una regione circolare di interesse <ol><li> Rilevazione del centro della regione di interesse <ol><li> Ottenere una serie di immagini fluorescenti che sono stati registrati durante un processo di ripristino che contiene una zona scura circolare e uno sfondo bianco, e impostare la prima immagine della serie come immagine di riferimento. Qui, R D è il raggio della zona scura in un&#39;immagine di riferimento. </li><li> Convolute l&#39;immagine di riferimento con un cerchio bianco cheintensità se è uniforme su un&#39;intera regione. Utilizzare funzione incorporata denominata &#39;CONV2&#39; per convoluzione, come mostrato nel codice sorgente della linea programma personalizzato 124. Qui, il raggio del cerchio bianco è leggermente inferiore rispetto R D. </li><li> Trova una posizione che indica un valore minimo nel calcolo convoluzione, e impostare la posizione come il centro della regione di interesse nell&#39;immagine di riferimento. </li></ol></li><li> Determinare un raggio della regione di interesse <ol><li> Convolute l&#39;immagine di riferimento con un cerchio bianco che contiene una posizione centrale, determinata da una procedura 4.1 e intensità uniforme su un&#39;intera regione. Qui, R S è il raggio del cerchio bianco. Utilizzare iterazione come &#39;per&#39; o &#39;mentre&#39; con l&#39;equazione di un cerchio per fare il cerchio bianco come mostrato nel codice sorgente della linea programma personalizzato 102 a 109. </li><li> Convolute l&#39;immagine di riferimento con un altro cerchio bianco che ha un po &#39;raggio maggiore (5% -10%), R L, a R S. Utilizzare stesso metodo con procedura 4.1.2.1 per rendere il cerchio come mostrato nel codice sorgente della linea programma personalizzato 113 a 120. </li><li> Ottenere la differenza di valore tra i due calcoli convoluzione di 4.1.2.1 e 4.1.2.2. </li><li> Ripetere le procedure sopra da R S = R D / 2 a R S = 2R D, aumentando sia la R S ed R L con un livello di pixel. Effettuare una iterazione che contiene i codici sorgente interi da procedura 4.1.2.1 a 4.1.2.3 ripetere. </li><li> Trovare il raggio di R S che indica la massima differenza di valore tra i due calcoli convoluzione. Utilizzare la funzione incorporata di nome &#39;max&#39; per trovare il raggio indica la massima differenza di valore, come mostrato nel codice sorgente della linea programma personalizzato 148 a 149. Questo R S indica quindi il raggio della zona scura nell&#39;immagine di riferimento. </li></ol></li&gt; </ol></li><li> Calcolo di un intensità frazionale <ol><li> Impostare un cerchio che contiene una posizione centrale e un raggio, determinata mediante procedura 4.1 come una regione di interesse. </li><li> Calcolare le intensità media della regione di interesse in una serie di immagini di fluorescenza secondo tempo. Convolute ogni fotogramma con la regione di interesse e dividerlo per area della regione di interesse per calcolare l&#39;intensità media. I dettagli sono disponibili nel codice sorgente del programma personalizzato che è disponibile nel sito web Giove. </li><li> Calcolo intensità frazionaria, definita come la seguente equazione, dove F (t) è l&#39;intensità media del cerchio che è una regione di interesse secondo tempo, F i è l&#39;intensità iniziale nel cerchio, e F o è l&#39;intensità di uno sfondo bianco. f (t) = (F (t) - F i) / (F o - F i) (Equazione 1). </li></ol></li><li> Montaggio del fintensità ractional alla teoria FRAP <ol><li> Montare l&#39;intensità frazionale con la seguente equazione, dove τ è un tempo di diffusione caratteristico e io 0, I 1 vengono modificate funzioni di Bessel, utilizzando un programma di montaggio, e di ottenere τ <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> (Equazione 2). </li><li> Ottenere un coefficiente di diffusione in base al rapporto, τ = a 2/4 D, dove D è il coefficiente di diffusione e A è il raggio della zona scura. Nota: Durante il processo di adattamento, è possibile spostare il profilo di intensità frazionaria lungo un asse temporale quando il processo di recupero è già iniziato, prima di registrare le immagini. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no competing financial interest.

FRAM condivide molte principi fondamentali con FRAP, soprattutto per misurare recupero di fluorescenza dopo candeggio una determinata area, ma FRAM utilizza un processo di unione di una gocciolina sull&#39;interfaccia piatta per formare un&#39;area sbiancato, invece di applicare una luce intensa. Il processo di fusione è quindi più importante passo in FRAM, e in particolare, la forma della macchia scura al monostrato piana dopo la fusione una gocciolina determina la precisione della misurazione diffusività. In particolare, sulla base di un metodo attuale, abbiamo impostato solo il cerchio con un raggio R come una regione di interesse per calcolare l&#39;intensità media della macchia scura, mostrata nella procedura 4, e se c&#39;è una deviazione troppo dalla forma circolare, ciò compromette la misurazione precisa di un coefficiente di diffusione. Pertanto, è necessario ottenere una regione scura di forma circolare, ma, forma non circolare si formano occasionalmente per diversi motivi. Innanzitutto, se esiste un flusso convettivo in Petpiatto ri, la forma dell&#39;area scura viene allungata lungo la direzione del flusso. Come menzionato in Procedura 1.3, un apparato cono-figura aiuta a sopprimere il flusso convettivo, e questo allungamento sarebbe ridotto al minimo. In secondo luogo, se l&#39;estremità di punta del capillare tocca l&#39;interfaccia piatta durante un processo di fusione, l&#39;area scura è formata con una varietà di forme, dalla fine capillare interrompe il processo di fusione. Ottenendo una goccia che pende solo dalla fine del capillare, questa interruzione può essere prevenuto. In particolare, un trattamento idrofobico del capillare aiuta la gocciolina di sedersi alla fine del capillare. Pertanto, sparatorie problemi di cui sopra e le modifiche ci permettono di misurare le proprietà di diffusione più preciso. Questo processo ben analisi guasti permette quindi FRAM di avere più vantaggi significativi rispetto FRAP. In primo luogo, FRAM richiede attrezzature più semplice rispetto a FRAP. Per FRAM, è sufficiente utilizzare un semplice micro fluorescenzaaffrontare, invece di un microscopio confocale costoso con un laser di potenza elevata cui lunghezza d&#39;onda deve coincidere con lo spettro di assorbimento del colorante. Inoltre, è necessario utilizzare apparati supplementari per regolare la dimensione all&#39;area sbiancato nella FRAP, mentre la FRAM controlla la dimensione dell&#39;area facilmente regolando la dimensione della goccia, o la pressione superficiale sulla superficie gocciolina. In secondo luogo, è possibile utilizzare varie specie di coloranti in FRAM. FRAP utilizza solo molecole di colorante il cui processo di candeggio è molto più veloce il processo di diffusione. Se la diffusione dei coloranti si verifica durante il processo di sbiancamento, è difficile stimare con precisione la proprietà di diffusione. La FRAM, tuttavia, non richiede un processo di sbiancamento coloranti e ciò consente così l&#39;uso di diversi tipi di coloranti in fluorescenza. Inoltre, il FRAP richiede ulteriori laser ad alta potenza e filtro imposta cambiare specie colorante, mentre è solo necessario sostituire i set di filtri nel FRAM. Finalmente, Poiché i monostrati sulla superficie delle gocce e l&#39;interfaccia piatta può essere formato in modo indipendente, consentendo così lo studio di inter-diffusione o miscelazione tra due differenti monostrati lipidici fondendo Un tipo monostrato a B-tipo monostrato, mentre il FRAP misura solo la auto-diffusione di un monostrato. Nonostante questi vantaggi, il processo di fusione una goccia su un&#39;interfaccia aria-acqua piatta può potenzialmente limitare questa tecnica a causa di diversi problemi che potrebbero essere di interesse, quali un disadattamento pressione superficiale tra le due monostrati, la scala temporale del processo di fusione , e un aumento della pressione superficiale del monostrato piana dopo la fusione goccioline. Questi problemi, tuttavia, non influenzano la misura diffusione significativa per i seguenti motivi. In primo luogo, anche se le pressioni di superficie ai due monostrati diverse sono molto diverse, un processo di equilibrio viene completato in una fase molto precoce durante il processo di recupero. Ad esempio, se tegli superficie pressione del monostrato sulla superficie delle goccioline è superiore a quella del monostrato all&#39;interfaccia aria-acqua piatta, l&#39;area scura espande finché la pressione superficiale equilibra. Poiché questo processo viene completato entro 10 msec, la pressione superficiale sarà equilibrata prima che influisce sul processo di diffusione in modo significativo. In secondo luogo, se la scala temporale del processo di fusione è abbastanza veloce, non limita la misura diffusione affatto. Fortunatamente, un tipico processo di fusione è anche completata entro 10 msec. Infine, anche la fusione multipla delle goccioline sull&#39;interfaccia piatta non aumentare la pressione superficiale in quanto la superficie della vasca è molto più grande della superficie della goccia. Secondo le dimensioni del canale e le goccioline, descritto nel protocollo, la zona per molecola aumenta inferiore a 0,015% fondendo una gocciolina. Di conseguenza, l&#39;aumento della pressione della superficie per effetto della variazione di superficie per molecola è inferiore allo 0,1%, che è negligible perché è molto più piccolo del tipico errore di pressione superficiale, misurata mediante tensiometro Wilhelmy piatto. In sintesi, abbiamo introdotto un nuovo metodo per misurare la diffusione laterale di proprietà di un monostrato fosfolipide fondendo un monostrato di gocce sull&#39;interfaccia piatta. Questa tecnica richiede attrezzature relativamente semplice e permette anche l&#39;utilizzo di vari tipi di specie di tintura. La FRAM è quindi potenzialmente applicabile per la misurazione diffusione degli agenti tensioattivi, tra fosfolipidi, copolimeri a blocchi, proteine ​​e anche nanoparticelle a un&#39;interfaccia fluido fluido. Inoltre, ci aspettiamo che la FRAM offre un nuovo modo di studiare la inter-diffusione o miscelazione tra due diversi agenti tensioattivi.

<html> I fosfolipidi sono componenti principali delle membrane cellulari e le membrane di organelli, e la fluidità di questi strati di membrana influisce spesso funzioni cellulari alterando l&#39;attività delle proteine ​​di membrana 1 - 3. Ad esempio, membrane &#160; omeostasi lipidica si ottiene regolando la fluidità di membrana, che viene rilevato da proteine ​​di membrana, e un livello anormale di fluidità provoca malattie gravi, come steatosi epatica e colestasi 4. Inoltre, la fluidità di un monostrato fosfolipide all&#39;interfaccia liquido-aria alveoli ha implicazioni importanti nelle sue funzioni. Alta fluidità del surfattante polmonare fosfolipide monostrato facilita la diffusione dello strato durante l&#39;inalazione, mentre una bassa fluidità permette lo strato di rimanere entro alveoli durante l&#39;espirazione 5,6. È quindi importante valutare la fluidità degli strati di fosfolipidi di comprendere i loro ruoli. _content &quot;&gt; una misura diretta della fluidità è la viscosità e la viscosità di strati di fosfolipidi è stato misurato usando colloidi micron dimensioni 7, aghi magnetici 8,9 e magnetici micro-tasti 6,10,11. Tuttavia, queste tecniche sono limitati ai film relativamente rigidi, e non può misurare film meno viscosi. Per tali casi, diffusività sarebbe un&#39;alternativa quantificare fluidità strati di fosfolipidi. Per molti decenni, una varietà di tecniche per misurare le proprietà di diffusione di strati di fosfolipidi sono stati sviluppati, come la fluorescenza metodo di spegnimento 12, campo pulsato gradiente NMR 13, e spettroscopia di fluorescenza di correlazione (FCS) 14. Uno dei metodi più rappresentativi è recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) 15,16. Grazie alla semplicità della procedura di misurazione e relativo teorie, diversi studi sulle proprietà di diffusione dei livelli di fosfolipidi sono stati effettuati utilizzando FRAP <sup&gt; 17 - 19. Tuttavia, FRAP di solito richiede un setup costoso microscopio confocale con un laser ad alta potenza. Qui vi presentiamo una nuova tecnica per misurare la diffusione laterale di monostrati di fosfolipidi, definito come il recupero di fluorescenza dopo l&#39;unione (FRAM). La differenza fondamentale tra FRAP e FRAM è che il passo photobleaching è sostituito dal coalescenza goccia. Unire una gocciolina coperto da non-fluorescenza monostrato su un monostrato piatta fluorescente lascia una macchia scura circolare su un monostrato luminoso appartamento, dando così lo stesso stato iniziale con il passo photobleaching. Abbiamo poi osserviamo il recupero di fluorescenza nella macchia scura con il tempo di misurare la diffusività laterale. Questa nuova &quot;bleaching&quot; step by goccia coalescenza offre vantaggi significativi rispetto FRAP: FRAM richiede solo un microscopio a fluorescenza anziché un microscopio confocale costoso con un laser ad alta potenza che è necessario per FRAP. ion Inoltre, FRAM offre una vasta selezione di coloranti fluorescenti in quanto non comporta il processo di photobleaching. Infine, i due monostrati differenti, un monostrato goccia e un monostrato piatta, possono essere preparati in modo indipendente, consentendo così interdiffusione da misurare, mentre FRAP misura solo l&#39;auto-diffusione di monostrati. FRAM offre una vasta gamma di misure di diffusione di materiali altamente viscosi a materiali quasi non viscosi. In linea di principio, FRAM può misurare la diffusività massimo di 10 6 micron 2 / sec, che è paragonabile a tecniche esistenti, quando si verifica la diffusione attraverso l&#39;area 100 micron da 100 micron durante il tempo per il processo di caduta coalescenza (~ 10 msec). Inoltre, il processo di lenta diffusione può essere facilmente misurato a meno che monostrati sono solidi. FRAM può essere utilizzato per qualsiasi tipo di materiali tensioattivi purché opportune molecole fluorescente contrassegnate sono disponibili.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1288">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:269px;">OCI corporation</td>
			<td style="width:251px;">Acetone 3.8L Extra Pure</td>
			<td style="width:552px;">Purity: &#8805; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethanol</td>
			<td>OCI corporation</td>
			<td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td>
			<td>Purity: &#8805; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Deionized water/Water purify system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q liocel</td>
			<td>&#62;18.2 M&#937;&#903;cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Chloroform</td>
			<td>LiChrosolv</td>
			<td>Chloroform ultrapure (A3633)</td>
			<td>Purity: &#8805; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine DPPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C, 810158P</td>
			<td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wilhelmy plate tensiometer</td>
			<td>R&#38;K ultrathin organic film technology</td>
			<td>Wilhelmy tensiometer</td>
			<td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Micromanipulator 5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 1</td>
			<td>Objective lens: Olympus</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 2</td>
			<td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 1</td>
			<td>Jai</td>
			<td>CV 950 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 2</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter set</td>
			<td>Chroma technology</td>
			<td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td>
			<td>Prepare suitable for dye molecules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>Wiseclean WUC-D06H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

Una serie di immagini di fluorescenza sono stati ottenuti con il tempo durante il processo di recupero dopo la fusione una gocciolina rivestito con un monostrato DOPC su un DOPC monostrato piatta, come indicato in Figura 1. Il monostrato DOPC all&#39;interfaccia aria-acqua piatta stato drogato con basse quantità di Rodamina-DPPE, e questo modo ha permesso di visualizzare uno sfondo con un colore brillante e una regione scura appena aggiunto all&#39;interfaccia piatta. C&#39;è un processo di recupero è stata osservata a 23 mN / m di pressione superficie fissa. Una misura di equazione 1 alla variazione dell&#39;intensità frazionata secondo tempo è mostrato in Figura 2. Il valore R 2 di questa forma è 0.999, e questa forma funziona ancora bene anche a pressioni superficiali inferiori o superiori. Il coefficiente di diffusione del monostrato DOPC ottenuto da questa misura era 27.54 2 micron / sec a 23 mN / m della pressione superficiale. Per un&#39;ulteriore conferma della FRAM, coefficienti di diffusione della DOPC e dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) monostrati sono stati misurati in base alla pressione superficiale. Come mostrato in figura 3, FRAM cattura la rapida diminuzione del coefficiente di diffusione del monostrato DPPC a ~ 9 mN / m della pressione superficiale, dove un LC (liquido condensato) - LE (liquido espansa) transizione di fase si verifica 10, ed i valori di coefficienti di diffusione sono anche d&#39;accordo bene con il già misure di Peters et al. 19. Inoltre, un decadimento esponenziale del coefficiente di diffusione con la pressione superficiale è stata osservata nel monostrato DOPC, e questa tendenza è quasi identica a quella misurata da Caruso et al. 12. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> Figura 1. (A) Rappresentazione schematica della FRAM (recupero di fluorescenza dopo la fusione) tecnica. Come labbrogocciolina rivestito id monostrato viene unita all&#39;interfaccia aria-acqua piatta, il monostrato lipidico senza fluorescenza tagged lipidico è inserito nel piano di lipidi monostrato fluorescente. Immagini (B) microscopio a fluorescenza con il tempo durante il processo di recupero di un monostrato DOPC a 23 mN / m di pressione superficiale (scala bar = 100 micron). La regione scura del monostrato DOPC è pienamente recuperato dal processo di diffusione in pochi minuti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> Figura 2. frazionale intensità in funzione del tempo. Cerchi neri e la linea tratteggiata grigia indicano i valori di intensità frazionari ottenuti da analisi di immagine (procedure 4.1 e 4.2) e l&#39;adattamento dell&#39;equazione 1 alle intensità frazionari con il tempo,mostrato nella procedura di 4.3, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> Figura 3. coefficienti di diffusione di DOPC (triangolo) e DPPC (quadrato vuoto) monostrati in funzione della pressione superficiale. Le linee con il colore grigio brillante e con il colore grigio scuro indicano i valori del coefficiente di diffusione precedentemente riportata da Peters et al. e Caruso et al., rispettivamente. Questa cifra è stata modificata da Jeong et al. 23. Ristampato con il permesso di Jeong et al. Langmuir. 30 (48), 14369-14374. Copyright 2014 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate suo</a>e per vedere una versione più grande di questa figura.

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Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Recupero della fluorescenza dopo Fusione di una Droplet misurare la diffusione bidimensionale di un fosfolipide monostrato

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

fluorescence-recovery-after-merging-droplet-to-measure-two

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Video: Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ricerca

Bioingegneria

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Sintesi, assemblaggio e caratterizzazione di film monostrato Protetta delle nanoparticelle d&#39;oro per Elettrochimica proteine ​​monostrato

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Unire Ion Concentrazione polarizzazione tra giustapposti Ion membrane a scambio di bloccare la propagazione della Zona Polarizzazione

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...