Questo metodo consente lo studio dell'attività di trasporto protonico di enzimi della membrana respiratoria come il citocromo BO3 in un ambiente bistrato lipidico naturale. I principali vantaggi di questa singola tecnica enzimatica è la possibilità di iniziare e interrompere le reazioni enzimatiche in qualsiasi momento utilizzando l'elettrochimica. Utilizzando una siringa di vetro trasferire 200 microlitri di stock cloroformio di estratto polare lipidico da Escherichia coli in fiale di vetro per fare cinque milligrammi di aliquote.
Aggiungere 50 microlitri di un milligrammo per millilitro ubichinone 10 ai lipidi per fare il rapporto finale da uno a 100 ubichinone 10 ai lipidi. Alla miscela aggiungere 20 microlitri di un milligrammo per millilitro lunghezza d'onda lunga colorante fluorescente etichettato lipidico abbreviato FDLL. Omogeneizzare la soluzione cloroformio con un breve vortice ed evaporare la maggior parte del cloroformio sotto un delicato flusso di azoto o argon.
Rimuovere completamente le tracce di cloroformio per ulteriore evaporazione sotto vuoto per almeno un'ora. Aggiungere 312,5 microlitri di 40 millimolare MOPS pH 7.4 tampone a un'aliquota di lipidi ubiquinone 10 FDLL miscela secca. Mescolare il vortice fino a quando il film lipidico è completamente sospeso seguito da due minuti di trattamento in un bagno ad ultrasuoni.
Aggiungere quindi 125 microlitri di HPTS da 25 millimolari, un colorante fluorescente sensibile al pH che verrà incapsulato all'interno dei liposomi. Ora aggiungi 137,5 microlitri di tensioattivi OGP da 250 millimolari. Dopo aver mescolato con vortice, sonicare la miscela in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 10 minuti per garantire che tutti i lipidi siano solubilizzati in micelle tensioattivi.
Quindi trasferire la dispersione in un tubo di plastica da 1,5 millilitri. Aggiungere la quantità richiesta di citocromo BO3 e aggiungere acqua ultra pura per fare un volume totale di 50 microlitri. Incubare la miscela di ricostituzione a quattro gradi Celsius per 10 minuti su un miscelatore a rulli.
Successivamente pesare 50 milligrammi di microperline di polistirolo in ciascuno dei due tappi del tubo da 1,5 millilitri. Quindi pesare 100 milligrammi di microperline di polistirolo in altri due tappi per tubi da 1,5 millilitri. Chiudere i tappi con pellicola di paraffina per evitare l'asciugatura.
Aggiungere i primi 50 milligrammi di microperline di polistirolo nella miscela di ricostituzione mettendo il tappo con microperline di polistirolo sul tubo di plastica da 1,5 millilitri con la dispersione preparata. Quindi eseguire un breve giro per un paio di secondi per portare microperline sul fondo del tubo. Incubare la sospensione a quattro gradi Celsius su un miscelatore a rulli per consentire alle microperline in polistirolo di assorbire il tensioattive per 30 minuti.
Ripetere le aggiunte di microperline di polistirolo e incubazioni come segue. Aggiungere 50 milligrammi di microperline per 60 minuti di incubazione. Quindi aggiungere 100 milligrammi di microperline per 60 minuti di incubazione.
E infine, aggiungere 100 milligrammi di microperline per 120 minuti di incubazione. Separare la soluzione proteoliposome dalle microperline di polistirolo utilizzando una micropipetta con una punta sottile. Diluire la dispersione in 90 millilitri di tampone MOPS nel tubo ultracentrifugo TI 45.
Ultracentrifugare la dispersione utilizzando un rotore ti di tipo 45 a 125.000 volte G per un'ora per pellettizzare i proteoliposomes. Dopo l'ultracentrifugazione, scartare il supernatante e risciacquare il pellet con tampone MOPS senza rimescolare il pellet. Dopo aver scartato il tampone di risciacquo, sospendere di nuovo i proteoliposome in 500 microlitri di tampone MOPS tubazionandoli avanti e indietro con una sottile micropipetta ribaltata prima di trasferire la sospensione su un tubo di plastica da 1,5 millilitri.
Dopo la centrifugazione per cinque minuti a 12.000 volte G per rimuovere i detriti, trasferire il supernatante che è il proteoliposomes ricostituito in una nuova fiala. La colla fino a nove coperchi di vetro scivola su una superficie urea evaporata utilizzando epossidici bicomponenti a bassa fluorescenza. Curare la colla a 80 gradi Celsius per quattro ore.
Poco prima della modifica con un monostrato autoassemblato, staccare il coperchio di vetro scivola dai wafer in silicone con una lama. A causa della magrezza dei vetrini del coperchio, fare attenzione quando si stacca il coperchio scivola per non rompere o rompere gli scivoli di vetro. Immergere la copertura rivestita in oro appena staccata scivola in una soluzione a 6 marcaptoesanolo e lasciare a 20-25 gradi celsius durante la notte per formare il monostrato autoassemblato.
Il giorno successivo, rimuovere i coperchi rivestiti in oro dalla soluzione e lavare brevemente con acqua o metanolo e quindi con isopropanolo. Asciugare la copertura rivestita in oro scivola sotto un flusso di gas delicato. Assemblate lo slittamento di copertura rivestito d'oro in una cella spettro-elettrochimica come diagrammi nel protocollo di testo.
Contatto con l'oro con un filo piatto all'esterno di un'area definita da un O-ring in gomma e avvitare saldamente la cella elettrochimica sulla parte superiore di esso. Aggiungere due millilitri della soluzione tampone elettrolita e posizionare gli elettrodi di riferimento e ausiliari nella cella. Procedere a controllare la qualità del monostrato autoassemblato ed eseguire spazi vuoti come descritto nel protocollo di testo.
Aggiungere proteoliposomes alla cella elettrochimica a 0,5 milligrammi per concentrazione finale di lipidi millilitro e mescolare leggermente con una pipetta. Attendere da 30 a 60 minuti a temperatura ambiente fino al termine dell'assorbimento dei proteoliposomes sulla superficie dell'elettrodo. Lavare la cella cambiando la soluzione tampone almeno 10 volte, ma evitare di lasciare la superficie dell'elettrodo completamente asciutta.
Ora, eseguire la spettroscopia di impedenza elettrochimica a potenziale a celle aperte per confermare che il monostrato auto-assemblato sull'elettrodo d'oro rimane invariato. Esegui voltammogrammi ciclici con velocità di scansione di 10 e 100 millivolt al secondo per osservare l'ossidazione catalatica dell'ubichinolo e la riduzione dell'ossigeno da parte del citocromo BO3 ai potenziali di insorgenza della riduzione elettrochimica del chinone. Modificare l'elettrodo d'oro come prima, ma utilizzando cinque microgrammi per proteoliposomes millilitro.
Per i singoli studi enzimatici ridurre il rapporto citocromo BO3-lipidico tra lo 0,1 e lo 0,2%Inserire una goccia di olio ad immersione e quindi la cella elettrochimica sull'obiettivo 60 volte dell'olio di un microscopio a fluorescenza invertito. Utilizzando filtri appropriati per la fluorescenza FDLL, concentrati sulla superficie dell'elettrodo. I singoli liposomi dovrebbero apparire come punti luminosi al limite di diffrazione dell'obiettivo del microscopio.
Scatta un'immagine della florescenza FDLL. Passare a quello dei set di filtri di florescence HPTS sul microscopio per verificare che la florescence HTPS sia chiaramente visibile e distinguibile dallo sfondo. Aumentare l'intensità della luce se non è così.
Programmare il software del microscopio per eseguire un'acquisizione di immagini a tempo alternando due set di filtri HTPS. Per fare ciò, impostare un'esposizione di un secondo, quindi passare alle applicazioni di menu. Quindi definisci/esegui acquisizione ND e seleziona due canali HTPS.
Imposta il ritardo tra le acquisizioni di immagini al minimo. In questo esperimento utilizzare un ritardo di 0,3 secondi e una durata totale di cinque minuti. Regolare le impostazioni del potenziostato per modificare il potenziale durante l'acquisizione dell'immagine come indicato nel protocollo di testo.
Ora, esegui contemporaneamente l'acquisizione di immagini a tempo al microscopio e la potenziale sequenza sul potenziostato avviando manualmente entrambe le misurazioni contemporaneamente. Ecco le immagini a fluorescenza dei liposomi assorbiti sugli elettrodi a tre diverse coperture. Il colorante contenente liposomi è visibile sulle immagini come punti luminosi.
La parte centrale dell'immagine è stata foto-sbiancata per rivelare il livello di florescence di sfondo. Le immagini su due canali HTPS sono super imposabili dove il rapporto tra i due canali corrisponde a un pH di 7,4 utilizzato in questo esperimento. Un maggior numero di liposomi sono visibili con il canale FDLL, il che indica la presenza di liposomi che non hanno HPTS incapsulato.
La differenza tra i canali HPTS e FDLL è più pronunciata a coperture più elevate. Forse perché ad alta copertura liposoma, i liposomi hanno maggiori probabilità di scoppiare o fondersi sulla superficie. Qui, il cambiamento di una florescenza liposoma su due canali HTPS è mostrato come un grafico di superficie 3D dell'area corrispondente durante 300 secondi dell'esperimento.
Il potenziale riduttivo è stato applicato tra 60 secondi e 180 secondi. Viene mostrato il grafico corrispondente del rapporto di intensità metrica del volume di due canali HPTS rispetto al tempo. Ecco le mediane di tutti i cambiamenti di pH vescicolare all'interno di una singola immagine quando il contenuto di CYTOCHROME BO3 è dell'1,3%Un aumento del pH è chiaramente visibile quando viene applicato un potenziale compreso tra 0,1 e 0,3 volt.
Quando il contenuto di cytochrome BO3 è un valore molto più basso dello 0,1%, le curve mediane diventano quasi indistinguibili da quelle dei liposomi vuoti. È importante garantire la completa rimozione del tensioattiva dalle dispensazioni liposomiche poiché i residui possono aumentare la permeabilità dei liposomi ai protoni. Questi metodi ci permettono di porre domande specifiche sul substrato naturale di chinonone lipofilo in contrasto con gli analoghi del chinone solubili in acqua spesso utilizzati.
Inoltre, i singoli esperimenti enzimatici hanno identificato uno stato di perdita precedentemente sconosciuto in cui la proteina agisce come un canale protone in cui i protoni scorrono liberamente all'indietro.
