Il nostro protocollo è progettato per sondare i meccanismi biofisici che regolano il trasporto del carico da parte di squadre di proteine motorie citoscheletriche identiche o dirette in senso opposto. Utilizzando gli origami di DNA per la costruzione molecolare, questo metodo può scegliere per il tipo, il numero e la posizione dei motori su forme di carico definite con precisione. Mentre questo protocollo si concentra sui motori a base di microtubuli dynein e kinesin, è adattabile alla miosina motoria a base di actina, così come ad altri sistemi proteici che funzionano in modo cooperativo.
Un aspetto impegnativo di questo protocollo è mantenere l'integrità e l'attività delle proteine motorie durante tutto il processo di purificazione, in quanto sono sensibili al calore e alla forza meccanica. Per indurre la crescita e l'espressione delle proteine motorie tramite il promotore del galattosio, utilizzare una bacchetta sterile per striare il ceppo di lievito congelato di interesse su un piatto di coltura di lievito-peptone-destrosio per un'incubazione da tre a quattro giorni a 30 gradi Celsius. Il quarto giorno di coltura, quando la densità ottica a 600 nanometri è compresa tra 1,5 e due, raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione e rimospendare il pellet in acqua per lavarle e consolidare le cellule in un'unica bottiglia.
Ruotare di nuovo le cellule per la raccolta e rimondere il pellet in circa due millilitri di acqua doppia distillata. Quindi utilizzare una pipetta da 10 millilitri per erogare lentamente il liquame cellulare in azoto liquido una goccia alla volta per produrre pellet di cellule di lievito congelate. Per la purificazione delle proteine motorie, utilizzare un macinino da caffè di tipo lama pre-refrigerato con azoto liquido per macinare i pellet di lievito congelati in una polvere fine e trasferire la polvere di lievito in un bicchiere di vetro pre-refrigerato da 100 millilitri sul ghiaccio.
Aggiungere un piccolo volume di tampone di lisi 4X appena preparato con integratori alla polvere in modo che la concentrazione finale del tampone non superi 1X e posizionare il becher in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius con agitazione continua con una spatola per scongelare rapidamente la polvere. Aggiungere ulteriore tampone 4X con integratori per portare la concentrazione finale del buffer a 1X nel lisato. Il volume finale è spesso compreso tra 25 e 30 millilitri.
Quindi raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione e trasferire la proteina solubile contenente supernatante in un nuovo tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio. Per la purificazione dell'affinità IgG, aggiungere 200 microliter di sospensione di perline di affinità lavate all'estratto proteico e incubare la miscela a quattro gradi Celsius per un'ora con una rotazione delicata. Al termine dell'incubazione, filtrare la miscela attraverso la stessa colonna cromatografica utilizzata per preparare le perline a quattro gradi Celsius, seguita da due lavaggi con cinque millilitri di tampone di lavaggio per lavaggio sul ghiaccio.
Dopo il secondo lavaggio, sciacquare le perline sul ghiaccio con cinque millilitri di tampone TEV, consentendo al tampone di drenare completamente dalla colonna. Per l'etichettatura dell'oligonucleotide del DNA, limitare la colonna cromatografica e incubare le perline motorie con 100 microlitri di tampone TEV integrati con da 10 a 20 micromolari dell'oligo di benzilguanina purificato a temperatura ambiente per 10-15 minuti, rimescolando delicatamente le perline una volta al minuto. Al termine dell'incubazione, lavare le perline quattro volte con tampone TEV fresco per lavaggio come appena dimostrato, prima di ricappare il fondo del tubo per consentire la sospensione delle perline motorie in non più di 200 microlitri di tampone TEV fresco.
Per la scissione TEV, trasferire la sospensione del tallone del motore su un tubo a due millilitri, fondo rotondo, microcentrifugo e incubare le perline del motore con circa 0,3 unità di proteasi TEV per microlitro di miscela di perline motorie a 16 gradi Celsius per un'ora con rotazione delicata. Alla fine dell'incubazione, centrifugare le perline motorie e raccogliere la miscela nella parte inferiore del tubo. Quindi, utilizzare una punta di pipetta P1000 tagliata per trasferire la miscela su una colonna di spin e centrifugare la miscela come appena dimostrato.
Raccogliere il filtrato contenente i motori tev-cleaved, purificati e aliquotare il filtrato in volumi da 50 microliter per la purificazione dell'affinità dei microtubuli. Quindi congelare le aliquote nell'azoto liquido per meno 80 gradi Celsius. Per la purificazione del telaio, nel tardo pomeriggio della giornata precedente la purificazione, strato delicato 80 microlitri ciascuno di concentrazione di glicerolo in tampone pieghevole di origami in un tubo di centrifuga.
I limiti tra i livelli devono essere leggermente visibili. Dopo un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius, strato 10%glicerolo in tampone pieghevole origami in soluzione di telaio piegato sopra lo strato superiore del gradiente, e centrifugare la pendenza con il telaio. Al termine della centrifugazione, raccogliere frazioni di 50 microlitri del gradiente in una direzione dall'alto verso il basso e caricare cinque microlitri di ogni frazione in singoli pozzi di un gel di agarosio al 2%.
Dopo 90-120 minuti a 70 volt, immagini il gel utilizzando condizioni adatte alla macchia di gel di DNA utilizzata. Le concentrazioni quantificate delle frazioni di interesse selezionate possono essere determinate utilizzando i metodi spettroscopici standard appropriati. L'analisi SDS-PAGE può essere utilizzata per confermare il successo dell'estrazione della dynein dal lievito, poiché il filtrato finale mostra una banda chiara e affilata a circa 350 kilodaltoni.
La proteasi TEV è presente anche nel filtrato finale e forma una banda chiara a circa 50 kilodalton. Dopo la purificazione dell'affinità dei microtubuli, la dyneina appare come una banda chiara e singola a 350 kilodalton, mentre la chiessina può essere osservata come leggermente spalmata, più bande a circa 120 kilodalton. Oltre alla proteasi TEV, una notevole quantità di tubulina può essere osservata anche nel supernatante finale.
La piegatura delle strutture degli origami del DNA può essere saggiata dall'elettroforesi del gel di agarosio, con uno spostamento della mobilità tra il filamento di impalcatura puro aperto e la reazione pieghevole che indica la piegatura degli origami. Inoltre, la reazione pieghevole indica la presenza di alcune multimerizzazione delle strutture del telaio. La motilità degli insiemi di telai a motore è facilmente rilevabile e misurabile sui cimografi generati dai film TIRF, poiché i kymografi di telai flessibili coniugati a sette proteine di dynein dimostrano corse altamente processive a velocità relativamente coerenti.
È fondamentale controllare attentamente la temperatura delle proteine motorie in ogni fase della procedura. Seguendo la purificazione delle proteine motorie e del telaio degli origami di DNA, i due componenti possono essere coniugati per saggi di motilità degli insiemi al microscopio TIRF. Questo metodo consente di decifrare i meccanismi biofisici e biochimici che regolano la motilità emergente degli insiemi motori.
