Questo metodo può aiutare a comprendere le domande chiave nel campo dell'interazione da cellula a cellula, ad esempio quali recettori mediano l'adesione o il riconoscimento nei contatti da cellula a cellula e se ligandi specifici innescano le loro interazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di indagare tali interazioni direttamente nelle cellule viventi senza bisogno di fissazione o interruzione cellulare. Sebbene questo metodo sia usato per studiare le interazioni tra cellule coltivate, può anche essere applicato ad altri sistemi vescicole mono-membrana o anche piccoli organismi modello.
Generalmente gli individui nuovi a questo metodo dovrebbero verificare che il loro campione sia abbastanza stabile da consentire l'acquisizione per alcuni minuti ispezionando attentamente il movimento cellulare e le variazioni di segnale lente. In primo luogo, seminare il numero appropriato di cellule in almeno quattro pozzi di una piastra di sei po 'al giorno prima della trasfezione. Coltura delle cellule a 37 gradi Celsius 5% di anidride carbonica nel mezzo DMEM integrato con 10%FBS e 1%L-glutammina.
Per eseguire un esperimento di base trasfetto plasmidi per la proteina di interesse fuso a una proteina fluorescente verde o gialla e una proteina fluorescente rossa in pozzi separati. Dopo quattro ore rimuovere il mezzo di crescita e lavarlo delicatamente con un millilitro di PBS integrato con PBS in caduta di magnesio e calcio sul bordo del pozzo per evitare il distacco delle cellule durante il lavaggio. Quindi rimuovere il PBS.
Aggiungere circa 50 microlitri di soluzione EDTA per rilasciare saggiamente ad ogni pozzo per facilitare il distacco delle cellule. Dopo aver incubato a 37 gradi Celsius per due minuti, agitare lentamente la piastra a sei po 'lateralmente per staccare le cellule. Successivamente, aggiungere 950 microlitri di mezzo di crescita a ciascun pozzo e rimorsi le cellule con pipettando alcune volte su e giù staccando così tutte le cellule dal fondo del pozzo.
Assicurarsi che le celle vengano rimorsi correttamente e scollegate l'una dall'altra verificando visivamente l'assenza di aggregati di celle di grandi dimensioni dopo la sospensione. Trasferire la soluzione cellulare di un pozzo al pozzo corrispondente. Mescolare delicatamente pipettando un paio di volte su e giù.
Quindi seminare le cellule miste su un piatto inferiore di vetro da 35 millimetri e coltura delle cellule sementi a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per un giorno. Nel software di microscopio confocale a scansione laser impostare il percorso ottico. Per evitare il crosstalk spettrale, selezionare due tracce separate per eccitare e rilevare mEGFP o mEYFP e mCherry o mCardinal in sequenza e selezionare Cambia traccia ogni linea.
Per il rilevamento utilizzare filtri appropriati per entrambi i canali. Posizionare il piatto contenente le celle miste sul portacampioni. Dopo aver atteso 10 minuti per garantire l'equilibrio della temperatura e ridurre la deriva di messa a fuoco, concentrati sulle celle utilizzando la luce di trasmissione nel menu Individua.
Cercare una coppia di celle rosse e verdi a contatto tra loro. Selezionare quindi un percorso di analisi perpendicolare al contatto da cella a cella utilizzando il pulsante Ritaglia. Ingrandisci per ottenere una dimensione in pixel da 50 a 200 nanometri e seleziona Linea in modalità scansione.
Impostare le dimensioni del fotogramma su 128 per un pixel. Impostare la velocità di scansione sul valore massimo consentito. Quindi impostare i cicli su 100.000 a 500.000.
In seguito, scegli i poteri laser appropriati. Impostare i rilevatori sulla modalità Conteggio fotoni. Premere Avvia esperimento per avviare l'acquisizione.
Esportare i file di dati non elaborati in un'immagine TIF RGB in formato dati non elaborati. Questo file conterrà un kymograph con i dati del canale verde e rosso nel canale vengono definiti rispettivamente G e R dell'immagine. Successivamente, importare il file TIF con il software di analisi appropriato e procedere all'esecuzione dell'analisi.
Allineare le linee eseguendo una media del tempo per segmenti con blocchi da 500 a 1000 linee. Determinare la posizione della membrana in ogni blocco. Quindi spostare tutti i blocchi nella stessa posizione laterale.
Somma tutte le linee allineate lungo l'asse del tempo e adatta il profilo di intensità media usando una funzione gaussiana. Definire i pixel corrispondenti alla membrana come tutti i pixel all'interno di più o meno 2,5 sigma della posizione della membrana e sommare l'intensità di questi pixel in ogni linea ottenendo un singolo valore del segnale fluorescente per ogni punto di tempo. Se si osserva lo sbiancamento fotografico, applicare una correzione di sbiancamento adattando le serie temporali a fluorescenza della membrana con una doppia funzione esponenziale e applicando la formula di correzione appropriata.
Calcolare le funzioni di correlazione automatica e incrociata in base alle equazioni appropriate. Per migliorare l'affidabilità dell'analisi ed evitare artefatti eseguire i calcoli per 10-20 segmenti uguali della misurazione totale. Ispezionare le serie temporali di fluorescenza e le funzioni di correlazione in ogni segmento e rimuovere segmenti chiaramente distorti.
Infine, media tutti i segmenti non distorti. Durante l'analisi dei dati, ispezionare attentamente le serie temporali di intensità e le funzioni di correlazione di ogni segmento per evitare distorsioni, ad esempio, dovute a vescicole intracellulari nella periferia della membrana. Un'immagine di intensità delle cellule HEK 293T che esprimono myristolyated-palmitoilated-mEYFP o mCardinal è mostrata qui.
È stata osservata una relativa correlazione incrociata vicina allo zero, mentre le funzioni di autocorrelazione mostrano tempi di decadimento caratteristici da 10 a 20 millisecondi per la diffusione di mEYFP miristoliato-palmitoilato e mCardinal nella membrana plasmatica. Le funzioni di correlazione incrociata delle misurazioni sFCCS delle cellule HEK 293T che esprimono cellule eterodimero ancorate a membrana mioripoliato-palmitoilato-mCardinal-mEYFP avevano ampiezze positive e mostravano tempi di decadimento simili a quello della funzione di autocorrelazione. Le misurazioni sFCCS su contatti da cella a cella tra cellule APLP1-mEYFP e APLP1-mCardinal-expressing hanno portato a una correlazione incrociata relativa positiva di 0,45.
Le funzioni di correlazione sFCCS ottenute dalle misurazioni su cluster APLP1 a contatti cellulare-cella hanno mostrato dinamiche fortemente ridotte come evidente da grandi tempi di decadimento nelle oscillazioni in grandi tempi di ritardo. Al momento dell'aggiunta di ioni di zinco, la relativa correlazione incrociata è aumentata ad un valore medio di 0,8. Inoltre la luminosità molecolare aumentò significativamente da piccoli oligomeri a multimeri più grandi costituiti da 10 a 50 monomeri su ogni cellula.
Le instabilità transitorie possono comportare una funzione di correlazione incrociata con valori negativi o un'alta correlazione incrociata falso positivo. Le corrispondenti funzioni di correlazione in genere si discostano fortemente da quelle della maggior parte dei segmenti. Come approccio complementare al numero di correlazione incrociata sFCCS e alla luminosità può essere utilizzato per rilevare interazioni proteina-proteina.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che la miscelazione di cellule trasfette è un passaggio critico. Mescolare delicatamente le cellule e ottimizzare le efficienze di trasfezione per aumentare la possibilità di trovare cellule rosse e verdi a contatto. Dopo il suo sviluppo questa tecnica è stata utilizzata dai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare le interazioni delle molecole di segnalazione nelle sinapsi immunologiche.
