Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo Candida sulla virulenza del ceppo e sui contributi di geni specifici a questi processi. I principali vantaggi di questa tecnica sono che evita preoccupazioni per quanto riguarda l'uso degli animali, è robusto, veloce, economico e fornisce un alto numero di animali per esperimento. In generale, gli individui che sono nuovi a questo metodo probabilmente avranno difficoltà un po 'perché avranno qualche difficoltà a valutare la vitalità del worm prima dell'inizio dell'esperimento o potrebbero avere alcuni problemi con l'iniezione incoerente dei worm.
Ordina larve da grossisti e fornitori che non introducono ormoni, antibiotici o altri trattamenti alle larve e che sono in grado di spedire e consegnare campioni vivi. Quando arrivano le larve, controlla ogni contenitore per confermare la salute e la vitalità delle larve. Le larve sane saranno completamente sommerse sotto la biancheria da letto, muovendosi e possedendo una colorazione gialla e marrone chiaro con poche larve contenenti segni neri o scolorimenti lungo il corpo.
Le larve possono essere conservate nei loro contenitori in uno spazio ventilato a temperatura ambiente per un massimo di due settimane. Per preparare le cellule di lievito per l'infezione da Galleria mellonella, far crescere i ceppi di C.albicans da iniettare durante la notte in tre millilitri di brodo fresco di lievito-peptone-destrosio per ceppo in tubi di coltura standard su un tamburo rotante a media velocità e 30 gradi Celsius. La mattina seguente, raccogliere le cellule per centrifugazione e lavare il lievito tre volte in cinque millilitri di PBS fresco per centrifugazione.
Dopo l'ultimo lavaggio, rimescolare le cellule in un millilitro di PBS fresco e trasferire il lievito in un tubo di microcentrifugo. Diluire serialmente le cellule in PBS aggiuntivo a una-100, uno a 1.000 e una a 100.000 concentrazioni e contare le cellule da una a 100 e una a 1.000 diluizioni. Regolare le cellule a un 2,5 per 10 alla settima parte per millilitro della concentrazione di PBS in un nuovo tubo di microcentrifugo e confermare l'accuratezza della dose infettiva placcando il volume appropriato della diluizione da uno a 100.000 per ottenere 100 unità di formazione di colonie su una piastra di agar lievito-peptone-destrosio per ogni coltura da utilizzare nell'infezione.
Per infettare le larve con le cellule Candida, prima stendere una piccola quantità di lettiera di waxworm in una piastra di Petri sterile vuota da 100 per 15 centimetri per replica biologica e sterilizzare una siringa da 10 microlitri dotata di un ago a 26 calibro tre volte con 10 microlitri di etanolo al 70% e tre volte con 10 microlitri di PBS per lavaggio. Successivamente, vortice la diluizione di inoculazione di C.albicans, e caricare 10 microlitri di cellule nella siringa. Apri un contenitore di larve di G.mellonella e usa un dito per capovolgire attentamente la biancheria da letto per scoprire le larve, selezionando larve gialle e abbronzate di dimensioni simili che sono in buona salute con una mancanza di pigmentazione nera sui corpi, usando le dita centrali e indice e il pollice per raccogliere una larva in un modo simile a afferrare una matita.
Arrotolare la larva sulla schiena in modo che le gambe siano rivolte verso l'alto, tenendo l'intera lunghezza del corpo tra le dita e il pollice in modo che la larva non sia in grado di arricciarsi o allontanarsi dall'iniezione. Con l'altra mano, ruotare la siringa in modo che la smussatura dell'ago sia rivolta verso l'alto e inserire lentamente l'intera lunghezza della smussatura nel corpo alla giunzione con la gamba sinistra più arretrata, assicurando che l'ago penetri nel corpo e non spingi semplicemente il corpo della larva verso l'interno. Il passaggio più critico in questa procedura è l'iniezione del waxworm in modo tale che il danno al corpo larvale sia ridotto al minimo e il bolo pieno sia inoculato.
Quindi iniettare i 10 microlitri completi di Candida inoculo ed estrarre l'ago. Co-ospita fino a 10 larve iniettate dalla stessa coltura di Candida in ogni piastra di Petri di 100 per 15 millimetri dopo l'inoculazione e incuba la larva a 37 gradi Celsius per otto giorni. Controlla i piatti ogni 24 ore per monitorare la morte.
La mortalità può inizialmente essere valutata dalla pigmentazione oscurata, dalla formazione di macchie o corpi neri e dalla mancanza di movimento. Per confermare la mortalità, usa le pinzette per rotolare delicatamente le larve moribonda sulla schiena e colpire leggermente la parte inferiore della larva con le pinzette. Le larve che iniziano a impuparsi nelle tarme possono essere incluse nell'analisi ma dovrebbero essere rimosse se iniziano a muta.
Non esiste alcuna differenza significativa nella cinetica della morte di G.mellonella tra larve infette zero o 10 giorni dopo l'arrivo. I segni caratteristici della malattia sorgono nelle larve di entrambe le età che soccombono all'infezione, a partire dallo scolorimento che lascia il posto alle macchie nere prima di una totale perdita di motilità e infine della morte. L'infezione da C.albicans accelera questo processo di scolorimento e morbilità, ma non altera significativamente la cascata di marcatori fenotipici che portano alla morte rispetto alle larve non infette o iniettate da PBS.
In particolare, l'infezione di G.mellonella con omo-o eterozigoti simili ad accoppiamento da uno qualsiasi dei ceppi di C.albicans clinicamente isolati testati produce alti tassi di mortalità rispetto agli animali iniettati da PBS, mentre le iniezioni di ceppi derivati prototrofici attenuano l'effetto letale in questo modello. È importante ricordare di scegliere larve sane e di essere gentili nel maneggiare le larve. Se più ceppi verranno inoculati, fare attenzione a non lasciare che le cellule Candida si sieda nel PBS per troppo tempo.
Seguendo questa procedura, altri metodi come la profilazione immunologica e la localizzazione di Candida all'interno delle larve possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sulle interazioni tra l'ospite e l'agente patogeno fungino durante un'infezione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare la patogenesi di Candida utilizzando formati ad alta produttività. Non dimenticare che lavorare con Candida albicans richiede attenzione e che le precauzioni standard, inclusa l'usura delle attrezzature di protezione personale, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
