CR Harding è stato sostenuto dalla studentship WT086724 Wellcome Trust.

1. Preparazione di L. pneumophila per infezione <ol><li> Preparare carbone estratto di lievito (CYE) piastre (carbone 2 g / L attivato, estratto di 10 g / L di lievito, 13 g / L di agar, 10 g / L N-(2-acetammido)-2-aminothanesulfonic acido (ACE), 1 g / L α-chetoglutarato, 0,4 g / L di L-cisteina HCl e 0,25 g / L pirofosfato ferrico, pH 6,9). Nota: Se necessario, aggiungere kanamicina (25 mcg / ml) e / o cloramfenicolo (6 mg / ml) per CYE piastre. <ol><li> Eseguire tutti L. lavoro pneumophila a livello di biosicurezza di contenimento 2 (BSL-2) in una cappa di sicurezza microbiologica (MSC) nel rispetto delle norme locali. </li></ol></li><li> Streak L. pneumophila da -80 ° C scorte di glicerolo su piastre CYE </li><li> Incubare le piastre per 4 giorni a 37 ° C. Nota: L&#39;incubazione delle piastre per 4 giorni aumenta significativamente la virulenza di L. pneumophila in G. mellonella sopra incubazione per 3 giorni. </li><li> Un giorno prima dell&#39;infezione, risospendere uno fu cicloll di batteri (contenente diverse colonie) in 1 ml di preriscaldata (37 ° C) ACES estratto di lievito (AYE) brodo e misurare l&#39;assorbanza a 600 nm (OD 600) utilizzando uno spettrofotometro. </li><li> Seminare una nuova cultura da 3 ml AYE (con antibiotici se necessario) per un diametro finale 600 0.1. <ol><li> Include un supporto solo controllare per garantire la sterilità dei media. </li></ol></li><li> Incubare a 37 ° C in un incubatore agitazione a 200 rpm per 21 hr. Nota: I batteri dovrebbero essere coltivate a fase post-esponenziale per l&#39;infezione 38. In crescita per 21 ore consente esperimenti di essere standardizzati. Nota: Se richiesto per l&#39;induzione di proteine, aggiungere 0,5 mm isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) durante la notte. </li><li> Misurare il diametro esterno 600 (batteri dovrebbero essere in fase di crescita post-esponenziale, OD 600 2,5-3). </li><li> Diluire coltura batterica che invia 1 x 10 9 UFC / ml in tampone fosfato sterile Dulbecco (D-PBS). Appunto: In base ai risultati precedenti, un OD 600 di 1 corrisponde a 1 x 10 9 UFC / ml, tuttavia questo dovrà essere confermato per differente L. ceppi pneumophila. Nota: se è necessaria l&#39;induzione di una proteina da un plasmide, aggiungere 1 mM di IPTG al inoculo. </li><li> Piatto l&#39;inoculo come descritto nella sezione 9 come controllo per garantire l&#39;atteso CFU è presente nel inoculo. </li></ol> 2. Preparazione delle larve <ol><li> Acquistare sufficiente G. mellonella larve da un fornitore commerciale. Le larve vengono spediti allo stadio 5 ° o 6 ° instar (approssimativamente tra i 2-3 cm di lunghezza) e sono adatti per l&#39;uso immediato. Nota: Un metodo che descrive come larve posteriore è stato descritto in precedenza 39. Nota: Le larve può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di due settimane e non richiedono cibo. Eliminare immediatamente qualsiasi larve che presentano segni di impupamento. </li><li> Preparare il contenitore per larva da placzione un cerchio di carta da filtro 10 cm sul fondo di un piatto 10 centimetri Petri. </li><li> Utilizzando una pinzetta a punta smussa, collocare dieci sano larve di dimensioni approssimative di simile nella piastra di Petri. Nota: Eliminare insalubri di colore marrone o macchie in cerca di insetti. Larve sane sono uniformemente crema colorata senza zone di macchie scure e sono in grado a destra se stessi rapidamente se capovolta. </li></ol> 3. Infezione di G. mellonella larve <ol><li> Preparare la piattaforma di iniezione con nastro adesivo un cerchio di carta da filtro alla superficie. </li><li> Saldamente nastro una punta P1000 orizzontalmente per la carta da filtro per creare una piattaforma di iniezione. Ciò non deve essere sterile. </li><li> Sterilizzare una siringa microtitolazione 20 microlitri aspirando il 70% di etanolo e incubando per almeno 10 min. <ol><li> Indossare guanti puntura prova durante l&#39;iniezione, </li></ol></li><li> Rimuovere eventuali residui di etanolo aspirando ed espellendo acqua sterile diverse volte. </li><li> Using la siringa, aspirare 10 ml di L. pneumophila 1 x 10 9 sospensione CFU / ml. </li><li> Prendere una larva e delicatamente ma con fermezza accenderlo sua schiena, chinò la punta P1000. </li><li> Posizionare la punta della siringa sulla parte anteriore, destra proleg delle larve. </li><li> Delicatamente, inserire la punta dell&#39;ago nel proleg, assicurandosi che sia dentro le larve, e senza intoppi iniettare tutto il contenuto della siringa. Nota: se la siringa è inserita correttamente, dovrebbe essere possibile per raccogliere le larve utilizzando solo la siringa per posizionarlo nella camera. <ol><li> Dopo l&#39;iniezione, osservare le larve per alcuni secondi. Le larve inizierà a gattonare dopo un paio di secondi, ma non dovrebbe espellere fluido. </li></ol></li><li> Osservare brevemente le larve poche ore dopo l&#39;infezione, infezione con 10 7 CFU L. pneumophila 130b non causa alcun sintomo entro il primo 5-8 ore pi Pertanto, se le larve si stanno rivolgendo grigio / nero prima di questo punto, tegli esperimento deve essere interrotto. Nota: Inoculo delle larve con 1 mM IPTG non influenza la vitalità larvale nel corso dell&#39;esperimento. </li><li> Allo stesso modo, iniettare un totale di 10 larve per condizione di cui 10 larve iniettato con D-PBS per servire come controllo per analizzare la mortalità larvale. </li><li> Tape Petri chiusi e posto in contenimento secondario. </li><li> Incubare in un incubatore batterica normale a 37 ° C, per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li></ol> 4. Il pretrattamento di larve con un inibitore chimico <ol><li> Prima dell&#39;infezione, preparare larve iniettabile come descritto nella sezione 3.1-3.6. </li><li> Iniettare 10 ml di una soluzione di Citocalasina D 100 pM nella parte anteriore, sinistra proleg di 10 larve. Nota: Inhibitor viene iniettato in una proleg diverso da sospensione batterica per ridurre le lesioni alle larve. </li><li> Iniettare 10 ml di DMSO in 10 larve come controllo. </li><li> Incubare larve a37 ° C per 4 ore. </li><li> Iniettare larve pretrattato come descritto nella sezione 3, nella parte anteriore, giusto Proleg sia con 1 x 10 7 CFU di WT L. pneumophila o un controllo PBS. </li></ol> 5. Analisi della mortalità larvale <ol><li> A 18 ore dopo l&#39;infezione (pi), esaminare tutte le larve infette per la mortalità. </li><li> Per verificare la mortalità, utilizzare una pinzetta a punta smussa per girare le larve e cercare il movimento delle gambe, larve sane dovrebbe raddrizzare stessi rapidamente. Pigmentazione indica una forte reazione immunitaria alle infezioni. Se non vi è alcun movimento, contano come vivo. </li><li> Numero record di larve morti e vivi. </li><li> Ripetere questo processo in tutti gli altri punti temporali scelti. Nota: Se l&#39;incubazione è continuata per più di tre giorni, pupe può essere visto. Rimuovere eventuali pupe e eutanasia mediante congelamento a - 20 ° C prima metamorfosi può accadere. </li></ol> 6. Estrazione di emolinfa <ol><li> Casualmente selezionare trelarve e posto in una provetta 14 ml in momenti scelti come 5 e 18 ore pi, </li><li> Posizionare questo tubo in ghiaccio per 5-10 minuti, finché si osserva alcun movimento delle gambe delle larve. </li><li> Collocare le larve anestetizzato su un piatto Petri e, utilizzando un bisturi praticare un&#39;incisione tra due segmenti vicino alla coda delle larve. </li><li> Spremere le larve in una sterile provetta da centrifuga da 1,5 ml per raccogliere l&#39;emolinfa. <ol><li> Pool emolinfa da almeno tre persone. Un larve dà tra 15-50 ml di emolinfa a seconda delle dimensioni. Nota: Durante l&#39;estrazione emolinfa è molto facile da interrompere l&#39;intestino, con conseguente potenziale contaminazione dei campioni. Ridurre la contaminazione tagliando le larve vicino alla coda (distanti dall&#39;intestino) Tuttavia, la selezione antibiotica sarà sempre necessaria quando placcatura i batteri. Nota: per evitare emolinfa di imbrunimento e coagulante, processo emolinfa entro 10 minuti dopo la raccolta. </li></ol></li><li> Eliminare il corpo larvale in un nuovo 14 ml tubo Falcon, tenuta e posto a - 20 ° C durante la notte per assicurarsi le larve sono morti. </li><li> Autoclave larve morte e smaltire secondo le normative locali. </li></ol> 7. Determinazione del hemocyte Viabilità <ol><li> Estrarre emolinfa come descritto sopra. </li><li> Mescolare 20 ml di emolinfa estratto con 20 ml di 0,02% (v / v) Trypan blu in PBS in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Carico 10 ml di emolinfa su un emocitometro e contare (non blu) cellule vitali. </li><li> Contare ciascun campione in triplicato per ridurre l&#39;errore. </li></ol> 8. Il trattamento dei Estratte ematociti concentrati per immunofluorescenza microscopia <ol><li> Mescolare la emolinfa pool estratto da almeno tre larve e pipetta su un vetrino di vetro 10-15 mm in una piastra da 24 pozzetti. Nota: Coprivetrini non richiedono trattamento hemocytes può aderire al vetro. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di D-PBS e mescolare bene pipettando su e giù. </li><li> Centrifugare la piastra per 10 min a 500 xg a temperatura ambiente (RT) con un portatarga centrifuga a tenuta di aerosol. </li><li> Esaminare ciascun pozzetto utilizzando un microscopio invertito per verificare che le emociti hanno aderito. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare accuratamente le cellule tre volte con l&#39;aggiunta di 0,5 ml di D-PBS alla parete del pozzo, dondolo piastra 2-3x e rimuovendo il D-PBS con una pipetta. </li><li> Fissare le cellule mediante aggiunta di 0,5 ml di 4% (v / v) paraformaldeide (PFA) in PBS. </li><li> Incubare le cellule per 20-30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule tre volte con D-PBS, come prima. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di 15 mM NH 4 Cl in PBS per estinguere residuo PFA e incubare a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Lavare le cellule tre volte con D-PBS. Nota: In questa fase, i coprioggetti possono essere conservati per una notte a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di 0,1% Triton X-100 in PBS e incubare per 5 min a temperatura ambiente per permeabilize cellule. </li&gt; <li> Blocco per 1 ora con una soluzione bloccante (2% (w / v) di BSA in PBS). </li><li> Incubare per 1 ora a RT al buio con l&#39;anticorpo primario diluito in soluzione bloccante alla diluizione specificata dal costruttore. </li><li> Lavare 3x con PBS. </li><li> Incubare per 1 ora con l&#39;anticorpo secondario e DAPI per la visualizzazione di batteri come sopra. </li><li> Lavare 3x con PBS. </li><li> Montare i vetrini utilizzando una goccia di reagente montaggio su vetrini. </li><li> Incubare per una notte al buio a temperatura ambiente per asciugare completamente la soluzione di montaggio. </li><li> Immagine scorre su un microscopio a fluorescenza. </li></ol> 9. Quantificazione dei batterica CFU <ol><li> Aggiungere 100 mg / ml spectinomicina per CyE piastre per evitare la contaminazione da flora intestinale. L. ceppo pneumophila 130b è naturalmente resistente a spectinomicina 40. </li><li> Prima estrazione emolinfa, pesa 1,5 ml provette da centrifuga. </li><li> Estrarre emolinfa come descritto nella sezione 6 e mettere in pesato tUBE, aggiungere 1 ml di 5 mg / ml digitonina, mescolare bene e incubare per 5 minuti a RT per la lisi hemocytes. </li><li> Pesare il tubo con emolinfa e determinare il peso di emolinfa estratto. </li><li> Eseguire dieci diluizioni seriali piega del emolinfa nei media AYE sterile. </li><li> Utilizzando una penna, dividere la base di una piastra CYE in sei settori uguali ed etichetta. </li><li> Piastre tre gocce di 25 pl di ciascuna diluizione (a partire dal più diluito) in ciascuna sezione della piastra. </li><li> Incubare le piastre con i coperchi Upmost notte a 37 ° C. </li><li> Una volta che le gocce si sono asciugati completamente, girare la piastra sopra e incubare a 37 ° C per almeno altri due giorni. </li><li> Quantificare i batteri estratti per conteggio delle colonie ad ogni diluizione e normalizzare il peso di emolinfa estratto. </li></ol> 10. Determinazione del Competitive Index (CI) <ol><li> Verificare che entrambi i ceppi crescono altrettanto bene in brodo di coltura e su piastre di agar CYE prior per tentare l&#39;indice competitivo. </li><li> Preparare sospensioni batteriche mutanti resistenti WT o kanamicina come descritto nella sezione 1 e mescolare in un rapporto di 1:1. <ol><li> Diluizioni seriali Piatto della inoculo sulla CYE spectinomicina (100 pg / ml) e CYE spectinomicina / kanamicina </li></ol></li><li> Infettare le larve ed estratto di emolinfa in momenti opportuni, come sopra descritto. </li><li> Determinare la conta estraendo emolinfa e placcatura diluizioni seriali su CYE spectinomicina e CYE spectinomicina / kanamicina. </li><li> Calcolare l&#39;indice competitivo (CI) come segue: CI = (uscita mutante / uscita WT) / (inoculo mutante / WT inoculo). </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Modello larvale La Galleria mellonella per l&#39;infezione da Legionella pneumophila è uno strumento utile per studi in vivo di patogenesi. Qui è dimostrato che un numero di aspetti di infezione di macrofagi può essere riassunta nella G. modello mellonella, compreso il ruolo del Dot / Icm T4BSS in virulenza e la replicazione batterica e la localizzazione della Dot / Icm-effector SIDC. Inoltre, abbiamo dimostrato che un inibitore chimico di polimerizzazione riduce significativamente la mortalità larvale, imitando i risultati ottenuti in macophages 47 e elementi di prova che l&#39;internalizzazione dei batteri è necessaria per provocare la mortalità larvale. In precedenza, è stato dimostrato che le variazioni di virulenza tra L. ceppi pneumophila visto in altri modelli di infezione possono essere verificate in G. è necessario mellonella e che l&#39;induzione di fattori di virulenza in fase di crescita post-esponenziale per la virulenza batterica <sup&gt; 36, confermando che G. mellonella è un modello adatto a L. infezione pneumophila. Determinazione del CFU di L. pneumophila da larve infetti singolarmente o in infezioni miste aumenta notevolmente l&#39;utilità del modello. In precedenza, diversi fattori sono stati scoperti che hanno effetti sottili sulla replicazione batterica in uno o più modelli di infezione 29,48-51. Sebbene le larve non possiedono un sistema immunitario adattativo, la presenza della risposta immunitaria innata fornisce selezione più forte rispetto alla sola macrofagi, che possono servire per amplificare fenotipi sottili. Pertanto, è possibile che, mentre questi ceppi probabilmente non influenzare significativamente la mortalità larvale, possono dimostrare diminuita replicazione batterica o idoneità in G. modello mellonella. Così come replica di L. pneumophila nelle larve, abbiamo dimostrato significativa deplezione hemocyte tardi infezione. Come L.pneumophila è previsto per lisare cellule ospiti al termine del suo ciclo di replica, misurando hemocyte esaurimento può anche servire come una misura indiretta della replicazione batterica. Hemocyte esaurimento precedentemente è stato correlato con la mortalità degli insetti in infezione 3,52, anche se i risultati recenti suggeriscono che questo quadro è più complesso di prima belived 37. Recentemente, è stato dimostrato che la fame di larve porta ad una maggiore suscettibilità alle infezioni attraverso una soppressione delle risposte immunitarie 53. Nei saggi qui descritti, non larve sono state alimentate per tutta la durata dello studio e non si sa quanto bene larve Fed rispondere agli L. infezione pneumophila. Uno dei vantaggi di G. mellonella come organismo modello è la facilità di estrazione e quantificazione di emociti di larve infetti. Video precedenti hanno indicato vari metodi per l&#39;estrazione hemocytes dagli insetti 54,55 invece, l&#39;ha incontratohod presentato qui è semplice e adatto per l&#39;elaborazione immediata. Una volta estratto, hemocytes può essere facilmente quantificato, utilizzato per immunofluorescenza, microscopia elettronica a trasmissione 36 o citometria a flusso 56 o colta e infettati ex vivo 3 permettendo la risposta delle cellule all&#39;infezione da indagare in dettaglio. Ciò aumenta notevolmente la flessibilità del modello. Un avvertimento a immunofluorescenza in G. mellonella è la limitata offerta di anticorpi convalidati contro G. proteine ​​mellonella. Tuttavia, gli studi hanno dimostrato la creazione di anticorpi contro le proteine ​​larvali 57 e gli anticorpi contro le proteine ​​del sistema immunitario legati umani sono stati trovati a riconoscere G. proteine ​​mellonella 11 dimostrano il potenziale di immunofluorescenza su G. hemocytes mellonella. La facilità di G. infezione mellonella consente rapide schermi, medie di throughput che potrebberoessere utilizzato per confrontare la virulenza di varie specie e ceppi di Legionella e potrebbe essere utilizzato per analizzare ulteriormente fattori di virulenza precedentemente identificati come molecole di adesione 58 o il sistema di secrezione di tipo 2 59 che sono necessari per la virulenza in altri modelli. Inoltre, l&#39;uso di questo modello permetterà l&#39;identificazione e l&#39;ulteriore caratterizzazione di nuovi fattori di virulenza tra cui proteine ​​effettrici secrete e traslocati. Recentemente, è stato dimostrato che l&#39;attività della fosfolipasi C di L. pneumophila ha un ruolo nel G. mellonella virulenza 60 e che è necessaria la effettrici proteina Dot / Icm SDHA per la virulenza 37. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che esiste una correlazione tra i fenotipi osservati in G. mellonella e nel topo ceppo A / J 37. Questo sottolinea il valore di questo strumento per integrare protozoo ambientale e di accoglienza unicellulari e murimodelli di infezione ne. Il G. modello mellonella diventerà ancora più prezioso in futuro, una volta che la sequenza genomica larvale sarà disponibile e sono stabiliti gli strumenti più genetiche. Passi in questa direzione includono la recente pubblicazione in dettaglio il sistema immunitario legati trascrittoma 61 e la formazione di una iniziativa per avanzare silenziamento genico in Lepidotteri spp 62. Utilizzando G. mellonella larve, abbiamo una serie di semplici, rapide letture di virulenza batterica che possono essere utilizzati per studiare la patogenesi di L. pneumophila. Istituzione di questi saggi e più ampia proiezione di L. ceppi pneumophila sierogruppi e aumenterà l&#39;utilità di questo nuovo strumento e contribuiranno alla nostra comprensione di L. pneumophila patogenesi.

Modelli animali di infezione sono stati indispensabili per la determinazione dei fattori di virulenza batterica. Tuttavia, i modelli di invertebrati hanno acquisito maggiore attenzione come una valida alternativa ai modelli tradizionali di mammiferi di infezione. Le larve del lepidottero della cera, Galleria mellonella viene sempre più utilizzato per studiare una serie di importanti patogeni umani, compresi Gram-positivi 1 e Gram-negativi batteri 2,3 e numerosi funghi patogeni 4,5. Utilizzando un modello insetto ha un numero di vantaggi rispetto ai modelli tradizionali di mammifero, come un invertebrato, G. mellonella non è soggetto alle limitazioni etiche dei modelli mammiferi. Inoltre, le larve possono essere facilmente mantenuta, infettato da iniezione senza anestesia, subisce pretrattamento con inibitori chimici 6 e sostenere incubazione a 37 ° C 7. È interessante notare che una buona correlazione tra la patogenicità di vari microrganismi in G. mellonella e modelli di mammiferi di infezione è stata stabilita 2,8. La maggiore comprensione del sistema immunitario di G. mellonella ha anche assistito nella caratterizzazione di questo organismo modello. Anche se gli insetti non hanno un sistema immunitario adattativo come si trova nei mammiferi, hanno difese cellulari e omerali sofisticate, compresa la produzione di peptidi antimicrobici 9. Emociti sono il principale mediatore di difese cellulari e sono il tipo di cellule più presenti trovato emolinfa (o sangue) di G. mellonella 10, Queste cellule sono fagociti professionali e svolgono funzioni simili a macrofagi e neutrofili sia riprendendo e degradante batteri in un fago-lisosomiale vano 10,11 e formando noduli intorno batteri invasori, limitando fisicamente replicazione batterica 12. Legionella pneumophila è un patogeno respiratorio che provoca gravi pneumoniuna (malattia del legionario) in popolazioni sensibili come gli anziani o immunocompromessi 13. Legionella si trova ubiquitariamente in sorgenti d&#39;acqua sia ambientali e antropiche, dove è un agente patogeno di varie specie di amebe acqua fresca 14,15. Legionella sopravvive e replica all&#39;interno di questi fagociti professionali utilizzando un complesso multi-proteina nota come il Dot / Icm (difettoso nella tratta organello / moltiplicazione intracellulare) tipo 4 sistema di secrezione (T4SS) di traslocare oltre 275 proteine ​​effettrici nella cellula ospite 16-20. Queste proteine ​​servono a sovvertire le normali vie fagociti cellula ospite, che porta alla creazione della Legionella contenente vacuolo (LCV). La LCV evita la fusione con i lisosomi e invece recluta reticolo endoplasmatico (ER) vescicole-derivato, conseguente in un vano specializzato che assomiglia alla ER ruvido 21,22. L. pneumophila è considerato un percorso umano accidentaleogen, le stesse strategie che permettono di replicare all&#39;interno di amebe, permettono anche di replica nei macrofagi alveolari umani 23. Ospiti mammiferi sono stati caratterizzati come modelli per l&#39;infezione da Legionella umana, tra cui topi e cavie 24,25. Tuttavia, la maggior parte dei ceppi di topi sono resistenti alla infezione da Legionella 26 ad eccezione del inbred albino A / mouse J, che sviluppa un lieve, autolimitante infezione 24. Sebbene il modello cavia più simile malattia umana 25, la mancanza di mutanti e maggiori costi scoraggia l&#39;uso di 27. Inoltre, diversi modelli di invertebrati sono stati sviluppati per l&#39;infezione da Legionella pneumophila compresi Caenorhabditis elegans 28, Drosophila melanogaster 29 e diverse specie di amebe 30-32. Tuttavia, questi modelli hanno punti deboli, virulenza in C. elegans </em&gt; Sistema non è Dot / Icm-dipendente 28, limitando l&#39;utilità di questo modello. Il modello Drosophila è dimostrato efficace nelle indagini virulenza batterica Fattori 29 e sembra essere promettente però, questo modello non è stato pienamente caratterizzato. Amebe unicellulari sono gli ospiti ambientali di L. pneumophila e sono ideali per studiare l&#39;azione dei fattori di virulenza a livello molecolare 33 mancano tuttavia alcuni importanti mediatori della risposta cellula ospite di mammifero di infezione come caspasi 34. Le carenze dei modelli esistenti, insieme con il costo elevato e le preoccupazioni etiche relative alla sperimentazione dei mammiferi, ha portato alla ricerca di altri appropriati organismi modello 29,35. Abbiamo recentemente dimostrato che G. mellonella è un modello adatto a L. pneumophila patogenesi 36,37. Dettagli Questo protocollo tecniche sperimentali utilizzate per infettareing G. mellonella larve, analizzando la moralità larvale, estrazione hemocytes per il conteggio e immunofluorescenza e determinare replica valida CFU risiedono da larve infette.

<table border="1">
 <tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material/ Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ACES yeast extract (AYE) broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g &alpha;-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* 
		 *add sterile ingredients after autoclaving</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6526 </td>
			<td>0.6 mM solution, sterile filtered</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile cysteine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td>3.3 mM solution, sterile filtered</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>G. mellonella (waxworms)</td>
			<td>Livefood UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9037</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Legionella LPS</td>
			<td>Cambridge Biosciences</td>
			<td>PA1-7227 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG Alexa488</td>
			<td>Jackson Immunoreach</td>
			<td>711-485-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1026</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Biomol International</td>
			<td>BML-T109-0001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td>[header]</td>
 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microtiter Syringe</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24544</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell counter, double, Improved Neubauer </td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0926</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For centrifuging plates </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For viable cell counting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puncture-proof glove</td>
			<td>Turtleskin </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
 </tbody>
 </table>

use of galleria mellonella as a model organism to study legionella pneumophila infection

Legionella pneumophila, l&#39;agente eziologico della polmonite grave chiamata malattia del legionario &#39;, è un importante agente patogeno umano che infetta e replica all&#39;interno dei macrofagi alveolari. La sua virulenza dipende dal sistema Dot / Icm di secrezione di tipo IV (T4SS), che è essenziale per stabilire una replica vacuolo permissiva conosciuta come la Legionella contenente vacuolo (LCV). L. infezione pneumophila può essere modellato in topi tuttavia la maggior parte ceppi di topi non sono permissive, che porta alla ricerca di modelli nuovi di infezione. Abbiamo recentemente dimostrato che le larve della tarma della cera Galleria mellonella sono adatti per le indagini di L. infezione pneumophila. G. mellonella viene più utilizzato come modello di infezione per patogeni umani ed esiste una buona correlazione tra virulenza di diverse specie batteriche nel insetti e nei modelli di mammifero. Una componente chiave delle difese immunitarie del larve sono hemocytes, professioneAL fagociti, che occupano e distruggono gli invasori. L. pneumophila è in grado di infettare, formare un LCV e replicarsi all&#39;interno di queste cellule. Qui mostriamo protocolli per l&#39;analisi L. pneumophila virulenza in G. modello mellonella, compreso il modo di crescere infettive L. pneumophila, pretrattare le larve con inibitori, infettare le larve e come estrarre cellule infette per la quantificazione e la microscopia a immunofluorescenza. Abbiamo anche descritto come quantificare replicazione batterica e fitness in saggi di concorrenza. Questi approcci consentono il rapido screening di mutanti per determinare i fattori importanti in L. pneumophila virulenza, descrivendo un nuovo strumento per aiutare la nostra comprensione di questo complesso patogeno.

Qui si dimostra che G. mellonella è un modello adeguato, facile da usare per studiare L. infezione pneumophila. In precedenza è stato dimostrato che L. pneumophila virulenza di macrofagi, amebe e modelli di mammifero è dipendente dalla presenza del sistema di secrezione Dot / Icm 41-43. G. mellonella larve sono stati infettati come descritto sopra e la virulenza del tipo selvatico (WT) e un ceppo Dot / Icm-carenti rispetto. Infezione da 10 7 CFU di L. ceppo pneumophila 130b provocato 100% di mortalità entro 24 ore dopo l&#39;infezione (pi). Tuttavia, la L. ceppo pneumophila Δ DotA, che non ha un sistema di secrezione Dot / Icm T4SS funzionale, era avirulent in questo saggio (Figura 1). Ciò dimostra che L. pneumophila virulenza in G. mellonella dipende dalla traslocazione di effettori Dot / Icm, rende questo modello adatto per la caratterizzazione dila funzione di queste proteine. Recentemente, è stato dimostrato che l&#39;inibizione della fagocitosi mediante trattamento citocalasina aumentato il susceptibly delle larve alle infezioni da lievito Candida albicans 6. Come L. pneumophila è un patogeno intracellulare, è stato deciso di determinare se l&#39;assorbimento dei batteri è fondamentale nella sua patogenesi in questo modello. Le larve sono stati pretrattati con 10 ml di 100 mM Citocalasina D (CyD) per 4 ore a 37 ° C, poi infettato con 10 7 UFC di WT L. pneumophila 130b e la mortalità monitorati a 24 ore pi Il trattamento con il solo inibitore non hanno influenzato la sopravvivenza delle larve. Tuttavia, pretrattati, larve infette visualizzato significativamente maggiore sopravvivenza (P = 0.0066, spaiato T-test) rispetto al DMSO-trattati, insetti infettate (Figura 2). L&#39;effetto del trattamento CyD stata abolita per 48 hr pi (risultati non mostrati), che può essere dovuto al emivita del farmaco in G.mellonella. Ciò dimostra che l&#39;assorbimento di L. pneumophila in G. mellonella emociti è un aspetto cruciale della virulenza batterica. Per convalidare espressione e determinare la localizzazione subcellulare di una proteina effettore in G. mellonella, hemocytes sono stati estratti ed elaborati per la microscopia di immunofluorescenza. Le larve sono stati infettati con WT e Δ DOTA L. pneumophila 130b esprimere un frammento della effettrici T4SS ben definito, SIDC 41-918, fusa a 4 tag N-terminale HA. Questo attuatore è stato dimostrato di impegnare la LCV tramite un dominio phosphoinositide-4-fosfato vincolante 44. Utilizzando anti-HA (rosso) e anti-Legionella anticorpi (verde), 4HA-SIDC 41-918 localizzato al LCV in hemocytes infetti (Figura 3). Questa localizzazione è stato precedentemente mostrato nella discoideum amebe Dictyostelium e in macrofagi mammiferi 44,45 confermando il comparability di questo modello. L&#39;importanza delle proteine ​​di virulenza è solitamente determinata confrontando la cinetica di crescita di tipo selvatico e batteri mutanti. Per seguire la cinetica di replicazione batterica nel corso dell&#39;infezione, tre larve sono stati sacrificati in ogni momento (0, 5, 18, e 24 ore pi), l&#39;emolinfa raccolto e combinato e la CFU/0.1g di emolinfa estratto determinata. Dopo un tuffo iniziale a 5 ore pi, il CFU di batteri WT aumenta fino a 24 ore pi tuttavia, il ceppo Δ dota subisce alcuna replica e viene azzerato a 18 ore pi (Figura 4). La capacità di L. pneumophila di provocare la lisi dei macrofagi in modo T4SS-dipendente è stata a lungo documentato 46, tuttavia esistono studi simili sono stati condotti in vivo. La concentrazione di emociti circolanti è stato fissato al 5, 18, e 24 ore pi larve sono stati infettati con WT o Δ <em&gt; DotA L. pneumophila 130b, hemocytes estratti da insetti infetti e cellule vitali contate utilizzando il metodo di esclusione trypan blu. A 5 ore pi alcuna differenza nella conta hemocyte tra i ceppi si vedeva (Figura 5). Tuttavia, a 18 ore pi c&#39;è stato un calo significativo della concentrazione hemocyte in WT, ma non Δ DotA, larve infetti. Questa differenza persisteva a 24 ore pi Il calo numero hemocyte, combinata con la presenza di batteri intracellulari come visto da immunofluorescenza, suggerisce che L. pneumophila si replica all&#39;interno hemocytes poi lisa, permettendo ai batteri di sottoporsi a diversi cicli di replica. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig1.jpg" /> Figura 1. Infezione da L. pneumophila induce Dot / Icm-dipendente della mortalità larvale. del 10 larve sono stati infettati con PBS da solo o 10 <sup&gt; 7 CFU di wild type (WT) o Δ Dota L. pneumophila 130b, incubate a 37 ° C per 72 ore e il tempo della morte delle larve registrato. Tutte le larve infettati con il WT ceduto alle infezioni entro 24 ore dopo l&#39;infezione (pi), ma non la mortalità è stata osservata in larve inoculate con solo PBS o il ceppo Δ dota. I risultati sono la media di tre esperimenti separati, ± deviazione standard. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig2.jpg" /> Figura 2. La mortalità dipende internalizzazione batterica. 10 L. pneumophila larve sono stati pretrattati con 10 ml di 100 mM Citocalasina D (CyD) per 4 ore a 37 ° C e poi infettate con 10 7 WT e mortalità monitorata a 24 ore pi larve pretrattato dimostrato significativamente (P = 0.0066, T-test non accoppiato) ridotto mortalità. Risultati rappresentano la MEAn di a quattro esperimenti indipendenti ± deviazioni standard con 10 larve per condizione. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig3.jpg" /> Figura 3. Immunofluorescenza di imaging di proteine ​​effettrici in hemocytes estratti. Ematociti concentrati sono stati estratti da larve infettati con L. pneumophila 130b WT o Δ Dota esprimere 4HA-SIDC 41-918 a 5 celle pi hr sono state colorate con anti-HA (rosso) e anti-Legionella anticorpi (verde) e macchia DNA DAPI (blu) per visualizzare i nuclei. 4HA-SIDC 41-918 è stato osservato WT circostante, ma non Δ DotA, batteri. Barra della scala 5 micron. <img alt="Figura 4" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig4.jpg" /> Figura 4. L. pneumophila si replica all&#39;interno di G. melloNella in maniera Dot / Icm-dipendente. larve sono stati infettati con pneumophila WT o Δ DotA L. e a 0, 5, 18, ​​e 24 ore pi emolinfa da tre insetti infetti pool, placcato su piastre CYE e CFU determinata e normalizzata per l&#39;inoculo e al peso di emolinfa estratto. WT L. pneumophila replicato nel corso dell&#39;esperimento, mentre il ceppo Δ DOTA viene liberata entro 18 hr pi risultati sono la media di tre esperimenti separati ± deviazione standard. <img alt="Figura 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig5.jpg" /> Figura 5. Infezione da WT L. risultati pneumophila in significativa distruzione hemocyte. ematociti concentrati sono stati estratti a 5, 18, ​​e 24 ore pi da larve infettati con pneumophila WT o Δ DotA L. e cellule vitali contate con un emocitometro. Nessuna differenza nellanumero di cellule è stato osservato a 5 ore pi tra i ceppi però a 18 ore pi solo circa il 15% di emociti rimangono in larve infettate con il ceppo WT rispetto al ceppo Δ dota. I risultati sono la media di tre esperimenti separati, ± deviazione standard.

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Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

La larva di tarma della cera Galleria mellonella è stato recentemente stabilito come un modello in vivo per studiare l&#39;infezione da Legionella pneumophila. Qui, dimostriamo tecniche fondamentali per caratterizzare la patogenesi della Legionella nelle larve, tra cui l&#39;inoculazione, la misurazione della virulenza batterica e la replica così come l&#39;estrazione e l&#39;analisi delle hemocytes infetti.

Uso di<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come organismo modello per studiare<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infezione

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

40.0K Views.  Imperial College London.  La larva di tarma della cera Galleria mellonella è stato recentemente stabilito come un modello in vivo per studiare l'infezione da Legionella pneumophila. Qui, dimostriamo tecniche fondamentali per caratterizzare la patogenesi della Legionella nelle larve, tra cui l'inoculazione, la misurazione della virulenza batterica e la replica così come l'estrazione e l'analisi delle hemocytes infetti. 

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

L&#39;insetto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come un modello di infezione potente per Indagare Patogenesi batterica

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Cecal legatura e la puntura indotta da sepsi come modello per studiare autofagia nei topi

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Uso di<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Istituzione e Ottimizzazione di un programma di installazione High Throughput per studiare<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infezione come modello per Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of nitrate to nitrite by gut and salivary bacteria. However, in other mammalian studies, high nitrite levels do not cause birth defects, although they can lead to poor reproductive outcomes. Thus, the teratogenic potential of nitrite is not clear. It would be useful to have a vertebrate model system to easily assess teratogenic effects of nitrite or any other chemical of interest. Here, we demonstrate the utility of zebrafish (Danio rerio) to screen compounds for toxicity and embryonic defects. Zebrafish embryos are fertilized externally and have rapid development, making them a good model for teratogenic studies. We show that increasing the time of exposure to nitrite negatively affects survival. Increasing the concentration of nitrite also adversely affects survival, whereas nitrate does not. For embryos that survive nitrite exposure, various defects can occur, including pericardial and yolk sac&#160;edema, swim bladder noninflation, and craniofacial malformation. Our results indicate that the zebrafish is a convenient system for studying the teratogenic potential of nitrite. This approach can easily be adapted to test other chemicals for their effects on early vertebrate development.

Exposure to teratogens may cause birth defects. Zebrafish are useful for determining the teratogenic potential of chemicals. We demonstrate the utility of zebrafish by exposing embryos to various levels of nitrite and also at different times of exposure. We show that nitrite can be toxic and cause severe developmental defects.

Zebrafish come modello per valutare il potenziale teratogeno di nitriti

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila membrana esterna Vescicole: Isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...